Microscopie optica.

Masuratori cu microscopul optic

Tehnici de microscopie
Microscopie optica
Microscopie optica de transmisie
Microscopie de baleiaj utilizand lasere

Microscopie confocala
Microscopie in camp apropiat

Microscopie electronica

Microscopie
Microscopie

electronica
electronica

de transmisie
de baleiaj

Microscopie de forta atomica

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Componentele unui microscop

Ocularul (1) contine lentilele
ocular; valori tipice ale maririi: 5x,
10x si 2x
Obiectivul (2); valori tipice ale
maririi: 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x
si 100x; interschimbabile
Masa (3) sustine proba de
examinat
Sursa de lumina (4) situata
sub masa
Condensorul (5) sistem de
lentile si diafragme care
controleaza cantitatea de lumina
prin proba si focalizarea luminii
Macroviza (6) si microviza (7)

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopie optica
Microscopie optica de transmisie
Lumina traverseaza proba microscopica;
Lumina este absorbita diferentiat de diferite componente ale
probei
Este nevoie frecvent de colorarea artificiala a probei pentru a
vizualiza mai bine anumite componente celulare etc.
Imaginea finala este virtuala, marita si rasturnata

Formarea imaginii intr-un microscop optic

AB obiect

Ob

AB imagine intermediara
AB imagine finala

Ob lentila obiectiv
Oc lentila ocular

Oc

A A

F1

F1 F2 A

F1, F1 focare obiectiv

F2, F2 focare ocular
f1 distanta focala obiectiv
f2 distanta focala ocular

F2

B
e

e distanta intre F1 si F2
UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopie optica

Parametrii unui microscop optic

Putere

P = tga2/AB

Grosisment

G = P/4 = e/4f1f2
G = tga2/tga1
G = AB/AB
G = GobGoc

Putere separatorie

=1/d

Rezolutie

d = 1,22/(2nsinu)

- lungimea de unda a luminii folosite

n indicele de refractie al mediului dintre obiectiv si preparat
u unghiul de apertura al obiectivului
nsinu = NA (apertura numerica a obiectivului)
UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Activitate experimentala
Caracterizarea dimensiunii intr-o
populatie de celule eritrocitare
Obiective:
Calibrarea microscopului (determinarea
factorului de conversie CF)
Masurarea diametrului a 20-30 hematii
seleactate aleator de pe un frotiu de sange
Calculul mediei si deviatiei standard
Prezentarea grafica a rezultatelor

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Activitate experimentala
Calibrarea microscopului

Micrometrul ocular = reticul

Micrometru obiectiv diviziuni de 10 M / 20 M (dupa cum este indicat pe

micrometru)

Prin suprapunerea imaginii celor doua micrometre se poate determina factorul de

conversie (CF) al microscopului ( M/div)

Micrometrul obiectiv este apoi inlocuit cu un frotiu de sange

celula ( M) = Ndiv x CF x Obcalibrare/Obmasurare (celula = diametrul unei celule; Ndiv =

numarul corespunzator de diviziuni de pe reticul (diametrului celulei); Obmasurare =
obiectivul cu care s-a realizat masurarea diametrelor; Obcalibrare = marirea obiectivului
cu care s-a realizat calibrarea (determinarea CF))
Micrometru ocular (reticul)

Micrometru obiectiv

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.html

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Activitate experimentala
Reticul (micrometru ocular)

Determinarea CF si masurarea diametrului

eritrocitar

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Activitate experimentala
Analiza datelor
Rezultate experimentale
(n celule)

X1

d2

X2

d3

X3

.
.
.
.

.
.
.
.

dn

Xn

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Diametrul mediu:

X=

Deviatia standard:

1 n
2
=
(
X

X
)
i
n 1

Measured diameter

d1

X
1

Microscopie optica

Materiale suplimentare

http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.htm

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.htm

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/mea
http://www.bioteach.ubc.ca/CellBiology/confocal/index.htm

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Apendix
Diferite tipuri de microscopie
Imagini

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscoape optice speciale

Ultramicroscopul

Preparatul este iluminat lateral, imaginea finala se

formeaza pe baza luminii difuzate

Microscopia in contrast de faza

Pentru obiecte transparente; imaginea este formata

pe baza diferentei de faza indusa luminii care
travereseaza medii optice diferite, din preparatul
microscopic

Microscopia de fluorescenta

Necesita markeri speciali (fluorescenti); preparatul

este iluminat in UV si emite lumina in domeniul vizibil

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Imagini de microscopie optica

http://www.ptei.org

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopie de fluorescenta
Neuron hipocampic
marcat cu YFP (yellow
fluorescent protein)

http://neuroscience.nih.gov

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopie in contrast de faza

http://www.wallawalla.edu/academics/departments/biology/rosario/inverts/Porifera/Mycale_adhaerens.html

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopie optica folosind lasere

Microscopie confocala
Raza laser este focalizata succesiv in
sectiuni diferite ale preparatului. Este posibila
reconstructia 3D ulterioara, pe baza
imaginilor seriate

Microscopie in camp apropiat

Distanta dintre preparat si obiectiv este mai
mica decat lungimea de unda a radiatiei laser
utilizate
Nu mai apar artefacte de difractie
Permite rezolutii la nivel molecular
UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopie confocala
Imagine de
fluorescenta a unei
celule endoteliale,
folosind trei
markeri: rosu
pentru mitocondrii,
verde pentru
citoschelet si
albastru pentru
nucleu

http://www.meade.com/dsi/gallery/molecular_probes.html

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopia electronica de
transmisie

Utilizeaza lentile electromagnetice

Imagine a jonctiunii neuromusculare

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica

Microscopie electronica de baleiaj

www.bacteria-world.com

Vizualizarea suprafetelor

UMF Carol Davila Catedra de Biofizica

Microscopie optica