Sunteți pe pagina 1din 44

Universitatea Ștefan cel Mare din Suceava

Departamentul de Sănătate și Dezvoltare Umană


Specializarea Nutriție și Dietetică

BIOLOGIE CELULARĂ ȘI
MOLECULARĂ
LUCRĂRI PRACTICE

Rezumat
Semestrul I, An I
Semestrul II, An I
îndrumător lucrări practice
(uz intern pentru studenti)
2017/2018
ș.l. Lungu Maria Magdalena
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Structura

INTRODUCERE
SEMESTRUL I

I. Tehnici de microscopie utilizate în biologia celulară.


I.1. Microscopul optic. Observarea mişcărilor celulare. Diviziunea celulara la
microscopul optic. Organitele celulare la microscopul optic.
Tehnici speciale de microscopie optică: examinarea în imersie, microscopia pe fond
întunecat.
I.2. Tehnici speciale de microscopie optică: microscopia în contrast de fază.
I.3. Tehnici speciale de microscopie optică: Microscopia de fluorescenţă.
II. Diviziunea celulară.
II.1. Etapele mitozei la microscopul optic.
III. Evidenţierea unor componente celulare prin coloraţii specifice (histochimice)
Frotiul sanguine. Observarea incluziunilor pigmentare.

SEMESTRUL II

IV. Tehnici de obținere și cultură a celulelor.


IV.1. Metode de disecție
IV.2. Metode enzimatice
IV.3. Alte metode de cultură de celule

V. Tehnici de investigație utilizate în biologia moleculară.


V.1. Studiul ADN-ului. Metode de izolare și purificare ale aciziolor nucleci
V.2. Spectrofotometria și dozarea în biologia moleculară.

VI. Tehnici de amplificarea a AND-ului. Reacția PCR – variante și tehnici


derivate

VII. Tehnici de electroforeză în biologia moleculară

1
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

INTRODUCERE

Celula procariotă. Celula eucariotă

Se diferențiază două tipuri fundamentale de celule - celula procariotă și celula


eucariotă.
Odată cu apariția microscopului electronic, biologii au avut posibilitatea
examinării structurii interne a diverselor tipuri de celule.
În urma studiilor s-au diferențiat două clase fundamentale de celule –
procariote și eucariote. Cele două clase de celule diferă între ele prin mărimea lor,
prin structura internă și nu în ultimul rând prin organitele pe care le conțin.
Celulele de tip procariot – au structură simplă și sunt caracteristice bacteriilor.
Celulele procariote sunt celule primitive, fără organite, cu dimensiuni între 0,1-10
microni (micoplasmele, bacterii, cianobacterii sau algele albastre) şi din care nucleul
lipseşte, astfel că ADN-ul este mai puţin protejat; diviziunea acestor celule este
rapidă.
Celulele de tip eucariot – (gr. carion –nucleu; eu- bine, bun), au o organizare
complexă conţin organite şi nucleu ce adăposteşte materialul genetic şi sunt prezente
la protozoare, fungi şi celulele organismelor din regnul vegetal şi animal.

În figura de mai jos este reprezentată structura celulelor. Diagramă schematică pentru
a) celulă bacteriană,
b) celulă vegetală,
c) celulă animală.

Obs: Organitele celulare nu sunt reprezentate la scală.

2
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Procesul verbal protecția muncii

Bibliografie:

Gerald Karp, Cell and Molecular Biology Concepts and Experiments, editia a 6-a, 2010, ISBN-
13978-0-470-48337-4, Printed in the United States of America

3
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

I.MIJLOACE TEHNICE DE VIZUALIZARE A


CELULELOR

Microscoapele folosite în biologia celulară permit studiul organizării


structurale a celulelor, acest lucru fiind esențial pentru a înțelege cum funcționează
celulele.
Microscoapele biologice sunt utilizate pentru educatie si cercetare in domeniul
biostiintelor. Sunt folosite pentru observarea microorganismelor animale sau vegetale,
celule si tesuturi, folosind lumina translucida (diascopic) sau incidenta (epi-luminare)
si beneficiaza de o marire incepand de la 20X pana la 1000X.

– monoculare,
– binoculare,
– trinoculare,
– cu camp luminos,
– fond negru,
– contrast de faza,
– cu polarizare si
– fluorescenta.

4
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

TIPURI DE MICROSCOAPE

A. Microscoape fotonice
B. Microscoape electronice
C. Difracţia cu raze X

A. Microscoape fotonice
1. MICROSCOPUL OPTIC
2. MICROSCOPUL CU CONTRAST DE FAZĂ
3. MICROSCOPUL CU LUMINĂ FLUORESCENTĂ
4. MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ

În continuare vor fi prezentate principalele metode de microscopie folosite în studiul


celulelor.

I.1. Microscopul optic

Microscopul optic este un prim instrument folosit în studiul celulei și în


același timp încă indispensabil.
Microscopia optică este metoda cu ajutorul căreia pot fi vizualizate imagini cu celule
dar și constituienți celulari, arhitectura tridimensională a celulelor.
Unul din avantajele microscopiei optice este că lumina folosită este relativ
nedistructivă.
Integrare de proteine fluorescente în componentele celulare.
La microscopul optic se poate vizualiza:
- mișcarea componentelor celulare
- interacțiunile dintre celule

Microscopia optică convențională are o rezoluție limitată.

O celulă animală tipică are dimensiuni cuprinse între 10–20 μm diametru, ceea ce
înseamnă circa o cincime din dimensiunile celui mai mic obiect care poate fi
vizualizat cu ochiul liber de om.

Celulele animale, pe lângă faptul că sunt foarte mici mai sunt și transparente și lipsite
de culoare. Posibilitatea ca ele să fie studiate se bazează și pe dezvoltarea către
sfârșitul secolului 19 a unei varietăți de coloranți ce conferă un contrast suficient
încât componentele celulare să devină vizibile și să poată fi distinse prin vizualizare
la microscop.

În mod similar, cu o rezoluție mult mai puternică, a fost introdus în anii 1940
microscopul electronic. Acest tip de microscopie a necesitat dezvoltarea de noi
tehnici pentru conservarea și colorarea celulelor.
5
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Ce se poate vedea cu microscopul optic.

În figura 1. sunt ilustrate etapele progresive în obținerea unei imagini la microscopul


optic cu o rezoluție din ce în ce mai mare. Ochiul liber poate vizualiza elementele
prezente în primele două cadrane, iar microscopul optic permite vizualizarea unor
detalii corespunzătoare cadranelor 4 și 5, iar microscopul electronic permite
vizualizarea în detaliu pană la al 7-lea cadran.

Figura 1. dimensiuni scalare de la celula vie la atomii din componența acesteia.

Fiecare diagramă reprezintă o imagine mărită de 10 ori, imaginar, de la un deget,


celulele epiteliului, la ribozom, atomii din componența unei molecule proteice.
Detaliile structurii atomice a macromoleculelor biologice (ultimele două cadrane) pot
fi vizualizate cu microscopul electronic.
Elementele din ultimele 5 cadrane atunci când sunt vizualizate la microscop apar doar
în alb și negru (dimensiunile sunt mult mai mici).

Microscopul optic poate să redea detalii pană la 0.2 μm


În temeni practici, bacteria și mitocondria, care au dimensiuni de aproximativ 500 nm
(0.5 μm), sunt în general cele mai mici elemente a căror formă poate să fie distinsă la
microscopul optic.
6
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 2. evidențiază mărimea diferitelor celule și structuri subcelulare și limitele în


care diferite tipuri de microscopie pot vizualiza.
Tehnici noi de rezoluție microscopică permit îmbunătățirea imaginilor obținute cu
ajutorul microscopului optic.

Unități de măsură folosite în microscopie:


μm (micrometru) = 10 –6 m
nm (nanometru) = 10 –9 m
Å (Ångström) = 10 –10 m

Figura 3. Imagini pentru aceeași celulă cu patru modalități de captură a imaginii.


Componentele unui microscop optic.

7
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

1. Partea mecanică se compune din:


-picior sau talpă- partea de sprijin pe masă
-coloană susţine tubul şi sistemele de vize.
-platina sau măsuţa pe care se aşează lama care se fixează cu ajutorul călăreţilor sau
clemelor
-şurub -superior pentru mişcări înainte şi înapoi ale măsuței
- şurub inferior pentru mişcări laterale
-macrovizele care apropie sau îndepărtează obiectivele de măsuţă
-tubul microscopului susţine sistemul obiectiv şi ocular la partea inferioară prezintă
revolverul, iar la partea superioară tuburile oculare
-revolverul are un disc mobil de care se fixeavă obiectivele şi un disc fix cu un pinten
care opreşte fiecare obiectiv în dreptul axului optic.

2. Partea optică
-sistemul ocular cu lentila înferioară, de câmp, colimatoare şi lentila superoară.
-sistemul obiectiv compus dintr-un sistem de lentile, cu puteri de mărire de 6X, 10X,
20X, 40X, pentru obiectivele uscate şi 90X. Pentru obiectivul de imersie (obiectiv
umed -sau citologic).
-sistemul de transmis lumina, alcătuit din condensor, oglindă şi sursa de lumină.

Etapele folosirii microscopului optic


1. Preparatele se aşează cu lamela în sus şi se prinde cu ajutorul clemelor. Se porneşte
sursa de lumină, şi se ridică condensorul la maxim pentru a obţine un punct luminos
pe lamă.
2. Se deplasează măsuţa prin rotirea şuruburilor măsuţei pentru a aduce preparatul în
axul optic (se suprapune preparatul pe punctul luminous de pe lamă obţinându-se
lumină colorată).
3. Se aduce în axulul optic cel mai mic obiectiv 10X şi se coboară condensorul pentru
a avea mai puţină lumină pe lamă. Se reglează distanţa pupilară a ocularelor pentru a
putea privi simultan cu ambii ochi fiind microscoape binoculare.
4. Se coboară tubul microscopului la maxim apoi se ridică prin rotirea cu ambele
mâini a macrovizei, privindu-se pentru prima dată în oculare până se obţine o
imagine clară de ţesut şi structure celulare. Se deplasează preparatul prin rotirea
şuruburilor măsuţei până este recunoscut.
5. Numai când imaginea este clară şi preparatul a fost recunoscut se trece la obiective
mai mari.
6. Pe măsură ce se trece la obiective mai mari se ridică condensorul pentru a adduce
mai multă lumină pe lamă.
7. Dacă se pierde imaginea la un obiectiv mai puternic se revine la un obiectiv mai
slab respectiv ob 10X, când se poate folosi şi macroviza.
8. La obiectivele mai mari de 10X se foloseşte numai microviza pentru a obţine o
imagine mai clară, altfel se sparge lama port obiect.
8
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

9. Uleiul de imersie nu are voie să atingă alte obiective decât cel de 90X. Pentru
aceasta după obţinerea imaginii clare la obiectivul de 40X, se aplică picătura de ulei
de imersie, după ce a fost scos obiectivul 40X din axul optic, în dreptul luminii
maxime pe frotiu, după care se trece la obiectivul de 90X.
10. La examinarea în imersie condensorul este ridicat la maxim.

Bibliografie:

Molecular Biology of the Cell sixth edition, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian
Lewis, David Morgan, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter, ed. Garland
Science, 2015.

Biologie celulară, îndrumător de lucrări practice, Conferenţiar Dr. Med. Alexandra


Crişu Bota, Universitatea ,,Lucian Blaga” din Sibiu, Facultatea de Medicină
,,Victor Papilian”, 2010

9
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

I.2. Microscopia cu contrast de fază

Microscoapele cu contrast de fază au obiective de “faza” cu ajutorul carora se


pot vizualiza organisme vii și celule care au un contrast slab sau sunt lipsite de
contrast. Cu acest microscop, vizualizarea este posibila fara pigmentarea
microorganismelor sau a celulelor care duce la moartea acestora.
Microscopul cu contrast de fază măreste contrastul, dintre structurile
preparatului microscopic, oferind posibilitatea examinării în condiţiile unei bune
vizibilităţi a celulelor vii.
Microscopul cu contrast de fază prezintă un dispozitiv care transformă
diferenţele de fază la trecerea prin diverse structuri, în diferenţe de amplitudine,
perceptibile vederii.

Figura1. Fibroblastul văzut la


microscop (stanga). Mitocondria
unui fibroblast (dreapta).

10
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Microscopul de Contrast cu Câmp Intunecat

Aceste modele de microscoape realizeaza vizualizarea probei prin contrast pe un fond


intunecat si pot fi echipate cu surse luminoase de inalta putere, precum lampa de
halogen 100 W sau sursa LED.
– obiective plan acromatice 4x 10x S40x si un obiectiv dedicat S100x-ulei cu
diafragma iris incorporata.
– cap microscopic trinocular
– condensator oglinda cardoid pentru imersie de ulei
– masa probe de dimensiuni mari, 120 x 135 mm, mecanism cu rulmenti, cu ajustare
X, Y: 75 x 35 mm
– iluminare cu lampa de halogen 100 W halogen sau sursa LED 5 W.

Microscoape Inversate

Microscoapele biologice inversate sunt disponible in varianta cu camp luminos si contrast de faza.
Obiectivele specifice compenseaza grosimea de 1,2 mm a cutiilor Petri sau a vaselor de cultura.

11
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

I.3. Microscopia cu lumină fluorescentă

Microscoapele de fluorescență sunt microscoape pentru aplicatii biologice sau


cercetare medicala, realizeaza vizualizarea celulelor vii sau a anumitor parti din
tesuturi cu ajutorul fluoroforilor. Cu acestea se pot distinge de exemplu celulele
tumorale de alte celule sau se poate dovedi prezenta sau absenta antibioticelor si a
altor molecule.
Microscoapele de fluorescenta pot fi dotate cu:
– o lampa cu vapori de mercur pentru furnizarea radiatiei incidente,
– obiective special Plan Fluarex (optional obiectiv semi-apochromatic),
– un set de filtre de excitatie/emisie si
– o oglinda semitransparenta.
Modelele upright au o sursa LED de lumina transmisa de 3 Watt, si lampa cu vapori
de mercur de 100 W. Modelele inversate sunt dotate cu lampa cu vapori de mercur de
100 W si lampa de halogen de 30 W.

Microscopul cu lumină fluorescentă este un microscop obişnuit la care se


montează o sursă de lumină ultravioletă- lampă tubulară de cuarţ cu vapori de mercur,
la o tensiune de 1000W, şi filtre pentru oprirea radiaţiilor vizibile şi a celor infraroşii,
şi filtre de protecţie a ochilor.
Tehnica se bazează pe proprietatea unor substanţe (fluorocromi) de a restitui o
parte din energia primită, atunci când sunt iluminate cu radiaţii cu lungime de undă
mică, sub formă de radiaţii cu lungime de undă mare = fenomen de fluorescenţă.
Diferiţi fluorocromi cunoscuţi se leagă specific de unele structuri celulare care
se evidenţiază în microscopia cu fluorescenţă.

12
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

În tabelul de mai jos sunt prezentati câțiva fluorocromi comuni folosiți în


biologia celulară.

Tabelul 1. Exemple de fluorocromi comuni folosiți în biologia celulară.

Figura 2. Fuziunea mitocondriilor (vizibilă prin marcarea cu un fluorocrom). O porțiune dintr-o


celula tip fibroblast de la soarece, a carei mitocondrie a fost marcata prin colorarea cu o proteina
fluorescenta (albastru). În primele 3 cadrane doua perechi de mitocondrie (care au fost marcate prin
colorarea artificiala) vin în contact cap la cap și fuzioneaza imediat. În ultimele 3 cadrane produsul
rezultat în urma fuziunii anterioare dau naștere la un rest de mitocondrie noua (fiica).

Bibliografie

Molecular Biology of the Cell sixth edition, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian
Lewis, David Morgan, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter, ed. Garland
Science, 2015.

Biologie celulară, îndrumător de lucrări practice, Conferenţiar Dr. Med. Alexandra


Crişu Bota, Universitatea ,,Lucian Blaga” din Sibiu, Facultatea de Medicină
,,Victor Papilian”, 2010.

13
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

I.4. Microscopul cu lumină polarizată


Lumina polarizată este folosită în scopul urmăririi fenomenului de
birefringenţă. Se folosesc 2 prisme nicol una în portdiafragmul irisului, a 2-a în
ocular. Birefringenţa se studiază în poziţia de dipoli încrucișați.
Când câmpul cu preparatul rămâne întunecat, atunci obiectul examinat este
monorefringent, izotrop.
Cu ajutorul microscopului cu lumină polarizantă se pot studia structuri
macromoleculare de aspect liniar,
- fibre de colagen,
- mielina,
- fibre musculare striate,
- membrane plasmatice,
- granule proteice,
- lipidice, sau de colesterol.

Structura membranei plasmatice poate fi vizualizată la microscopul cu lumină


polarizată.

Reprezentare prin desen a imaginilor văzute la microscop.

Bibliografie

Gerald Karp, Cell and Molecular Biology. Concepts and Experiments, 6th edition,.

Molecular Biology of the Cell sixth edition, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian
Lewis, David Morgan, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter, ed. Garland
Science, 2015.

Biologie celulară, îndrumător de lucrări practice, Conferenţiar Dr. Med. Alexandra


Crişu Bota, Universitatea ,,Lucian Blaga” din Sibiu, Facultatea de Medicină
,,Victor Papilian”, 2010.

14
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

II. DIVIZIUNEA CELULARĂ

Evidențierea fazelor mitozei

Mitoza este tipul de diviziune caracteristic celulelor somatice spre deosebire de


meioză (diviziune reducţională) care se întâlneşte doar la celulele sexuale.

Celule vegetale de ceapă - coloraţie cu Hematoxilină ferică

Celulele de ceapă au formă dreptunghiulară, cu o structură foarte simplă, şi la nivelul


meristemului de creştere au o rată de diviziune foarte accelerată, evidenţiindu-se
diferitele etape ale mitozei: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza. Acestea apar
colorate în negru.
* Profaza este cea mai lungă ca durată- la om 30 minute .
* Metafaza, este cea mai importantă şi durează numai 8 minute.
* Anafaza 18 minute
* Telofaza 4 minute

Ciclul celular este perioada cuprinsă între sfârşitul unei diviziuni care a dat
naştere unei celule şi terminarea diviziunii acestei celule. Normal ciclul celular
durează 25 ore, din care mitoza ocupă numai o oră.

1. Profaza se caracterizează prin apariţia celui de al 2-lea centru celular sau


centrozom, organit specific diviziunii celulare format din 2 centrioli. Pe secţiune
transversală centriolul este format din 9 triplete de microtubuli,(structura se aseamănă
cu a corpusculului bazal). Intre centozomi apar microtubulii care se alungesc şi
formează fusul de divizune. Cromatina se condensează formând un ghem numit
spirem, apoi prin condensare apar ca nişte bastonaşe de cromatină, cromozomii care
se vor fixa mai târziu de filamentele fusului de diviziune. Dispare nucleolul. Pe
preparat cromozomii apar ca nişte grunji, fără a putea distinge dispariţia învelişului
nuclear.

2. Prometafaza este o etapă de trecere în care dispare învelişul nuclear şi


cromozomii se prind de filamentele fusului de diviziune cu ajutorul cinetocorilor.
Fiecare cromozom are 2 cinetocori ca nişte cleşti cu care se fixează de filamente

15
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

fusului, care sunt microtubulii (cinetocorici), şi vor executa o serie de mişcări


oscilatorii în trecerea spre metafază.

3. Metafaza. In aceasta faza are loc clivarea longitudinală a fiecărui cromozom în 2


cromatide, fiecare prevăzută cu cinetocorul ei, şi din cei 46 cromozomi se ajunge la
92 cromozomi şi deci dedublarea genomul. Toţi cromozomii stau în această etapă la
mijlocul fusului de diviziune la ecuatorul său, motiv pentru care formaţiunea se
numeşte placă ecuatorială sau placă metafazică. Pe preparat se poate observa placa
ecuatorială dar nu se poate distinge fiecare cromozom în parte.

4. Anafaza. In aceasta faza cromatidele formate în metafază se îndepărtează între ele


când 46 pornesc spre un pol al celulei iar 46 vor porni spre celălalt pol al celulei.
Cromatidele se vor numi de acum cromozomi care se vor deplasa datorită scurtării şi
alungirii microtubulilor. Există o
anafază A când se scurtează microtubulii cinetocorici, şi o anafază B când se alungesc
microtubulii polari, asigurându-se înaintarea cromozomilor în drumul lor spre poli.
Pe preparat cromozomii se
observă la diferite distanţe .

5. Telofaza. In această fază cromozomii au ajuns la cei 2 poli ai celulei şi se grupează


în mase ordonate în jurul acelui centrozom.
Microtubulii continuă să se alungească îndepărtând şi mai mult cei doi poli celulari.
La sfârşitul telofazei se formează nucleolul şi reapare învelişul nuclear, dispar
cromozomii pentru a remodela
cromatina sub formă de eucromatină.

16
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

6. Citodiereza sau citochineza constă în clivarea citoplasmei împreună cu nucleul


corespunzător ei, astfel încât dintr-o celulă mamă să apară 2 celule fiice care vor avea
acelaşi material genetic
cu celula mamă, şi vor semăna mai mult sau mai puţin cu aceasta.
În citochineză se formează la mijlocul celulei sub plasmalemă un inel contractil în
care apar filamente de actină care se scurtează, trag şi astfel îngustează inelul de la
mijlocul celulei şi în final citoplasma se va fragmenta în 2 celule fiice.

Celule în mitoză din meristemul radicular de ceapă

Vârful germinativ al rădăcinii de ceapă ( meristemul ) furnizează un sistem adecvat


studiului mitozei, deoarece aici se pot surprinde un număr mare de celule aflate în
diferite faze ale mitozei. Mitoza se desfăşoară asemănător la celulele animale şi
vegetale, iar materialul de studiu este uşor de preparat.
* Recoltarea se prelevează vârfurile rădăcinii de ceapă, având dimensiuni de 5-10
mm.
* Fixarea se introduc în soluţie de fixator 3:1 alcool etilic, acid acetic glacial, timp de
24-48 ore.
* Colorarea cu colorant carmin acetic care se prepară astfel:
-Se dizolvă 1 g carmin într-un amestec de 45 ml acid acetic
glacialşi 55ml apă distilată
-Se fierbe câteva minute după care se lasă să se răcească
17
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

-Se filtrează
-Se păstrează la frigider în sticle colorate
Carminul acetic colorează nucleul şi cromozomii.
Se scot rădăcinuţele din fixator şi se introduc într-o eprubetă, peste care se toarnă
carmin acetic.
Se încălzeste până la fierbere câteva secunde.
Se toarnă într-o placă Petri de unde se scoate câte o rădăcinuţă şi se aplică pe o lamă.
Se secţionează cu un bisturiu la 3 mm de vârf, lăsând pe lamă numai vârful.
Se aplică o lamelă care se bate delicat cu un băţ de chibrit pentru etalarea straturilor
celulare.
Se urmăresc fazele mitozei la microscop.

Bibliografie:

BIOLOGIE CELULARĂ ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE, Conferenţiar


Dr. Med. Alexandra Crişu Bota si Asistent univ. Dr. Cezar Bologa, Universitatea
,,Lucian Blaga” din Sibiu Facultatea de Medicină ,,Victor Papilian”,2010, pag. 83-86.

18
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

III. METODE DE EVIDENȚIERE PRIN COLORAȚII


SPECIFICE

III.1.Frotiul sanguin - coloraţie May Grunwald Giemsa


(MGG)
Hematiile ocupă intregul câmp microscopic şi apar sub forma unor celule rotunde,
sub formă de disc biconcav, de culoare roşie cărămizie, uneori dispuse în fişicuri.

Printre hematii din loc în loc apar celule cu nuclee colorate în mov numite leucocite
clasificate după forma nucleului în polimorfonucleare, pentru că nucleii lor au mai
mulţi lobi şi mononucleare.

Polimorfonuclearele sau granulocitele au fost numite în trecut polinucleare,


deoarece sa crezut că ar avea mai mulţi nuclei, astăzi denumirea fiind evitată.

Granulocitele se clasifică după tipul de granulaţii secundare:


Neutrofilele prezintă granulaţii secundare care nu se colorează nici cu coloranţii acizi
şi nici bazici. Granulaţiile granulocitului eozinofil reacţionează numai cu coloranţii
acizi de unde şi denumirrea de granlocit acidofil, iar culoarea acestor granule este un
roşu cărămiziu ca şi icrele de Manciuria. Granulaţiile bazofilului se colorează cu
coloranţii bazici .
Neutrofilul prezintă un nucleu care poate avea 2 sau mai mulţi lobi, până la 5 lobi,
precum şi uneori o prelungire fină, ca un băţ de toboşar - drum stik leucocitar- un
filament de cromatilă care reprezintă corpusculul Barr, sau al 2-lea cromozom X
inactivat la femei. Acesta apare doar la 3% dintre neutrofilele acestora. Neutrofilele
sunt primele celule care fagocitează, ele merg la focarul de infecţie unde atacă
microbii şi începe necroza ţesuturilor, eliberează acolo echipamentul enzimatic pe
care îl conţin în lizozomi, o mulţime de enzime antimicrobiene de tipul lizozimului,
mieloperoxidazei, d-aminioxidazei,care ajută la digerarea acestor microbi. Mai conţin
şi alte substanţe în granulele lor secundare cum este fosfataza alcalină care pot fi
evidenţiate cu ajutorul coloraţiilor speciale, şi fagocitine cu acţiune importantă în
acţiunea lor antibacteriană. PMN rămân la locul de invazie şi împreună cu ţesuturile
necrozate formează puroiul. În mod normal apar în proporţie de 40 până la 75% în
sângele circulant, fiind fagocitele din prima linie de atac.

19
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Eozinofilele care deşi se găsesc în cantitate redusă de 1-6% au un rol important în


reacţiile imune de tip alergic la diferiţi alergeni: polenuri (febra de fân până la astm
alergic), la persoanele care prezintă parazitoze (oxiuri sau helminţi ). Dacă pătrund în
organism duc la creşterea numărului acestor eozinofile. Granulele lor specifice roşu
cărămizii, ca icrele de Manciuria, pot să acopere nucleul care este bilobat, cu formă
de desagă.Eozinofilele conţin şi: enzime cu ajutorul cărora digeră complexele antigen
- anticorp, precum şi histaminaze (substanţe care inactivează histamina) şi alte
substanţe vasoactive secretate de bazofile . De aceea la alergici unde histamina se
eliberează în cantitate mare trebuie să crească şi numărul de eozinofile. La
microscopie electronică spre deosebire de neutrofile unde se găseste un bogat
echipament lizozomal la eozinofile se observă un bogat echipament granular, cu
granulele îmbrăcate în membrane proprii, cu un centru cristaloid, bogate în
istaminaze. şi mai puţin în alte tipuri de organite.

Bazofilele au nucleul în desagă iar granulele lor se colorează cu coloranţii bazici într-
un albastru mov închis acoperind uneori cei 2 lobi ai nucleului. Granulele lor mari,
bogate în histamină, împreună cu alte tipuri de amine cum ar fi slow reactive
substances of anafilaxy (SRSA) şi heparina se eliberează în sângele alergicilor când
aceştia vin în contact cu alergenii. Aminele cresc permeabilitatea capilară şi dau

20
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

fenomenele de exudat la nivelul bronhiilor, cavităţii nazale, sau eriteme la nivel


tegumentar datorită congestiei vasculare şi toate reacţiile caracteristice alergicilor. Se
găsesc în sângele circulant în cantitate mică,normal sub 1%.

Mononuclearele - a 2-a clasă de leucocite se subîmpart în limfocite şi monocite şi


prezintă un singur nucleu nelobat.

Limfocitele se găsesc într-un număr de 20-40% în sângele circulant şi după


dimensiunea lor se clasifică în mici, mijlocii sau mari.
Limfocitele mici se aseamănă ca dimensiuni cu hematia, întreaga celulă este ocupată
de nucleu şi rar se observă la periferie puţină citoplasmă. Limfocitele mijlocii şi mari
prezintă mai multă citoplasmă care ia o nuanţă azurofilă, un cenuşiu albăstrui, ca
fumul de ţigară. Ele nu au echipament bogat lizozomal dar au rol de a secreta
substanţele implicate în reacţiile imune de tip l, ll, lll, inclusiv reacţile de tip
anafilactic.
Limfocitele de tip T secretă limfokine, interleukine, iar limfocitele de tip B, (care la
microscopul electronic prezintă perişori - limfocite păroase,) după transformarea lor
în plasmocite (prin diviziune de întinerire), secretă imunoglobulinele, anticorpii ,IgA,
IgG, IgM, IgE, care intervin în toate reacţile imune. In microscopia electronică se
descrie un nucleu foarte puţin lobat , mitocondrii, aparat Golgi şi alte tipuri de
organite mai puţin lizozomi.

Monocitul a doua categorie de


mononucleare, este un macrofag.
După ce neutrofilele merg primele
21
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

la focarul de invazie, se apropie prin mişcări ameboidale lente se apropie monocitele


care vor digera resturile celulare mari rămase în zona de agresiune inclusiv corpurile
neutrofilelor, şi microbiene care se găsesc în acea zonă. Monocitele sunt prevăzute
cu un bogat echipament enzimatic lizozomal, pe care îl eliberează în momentul
atacului şi emană pseudopode. Nucleul lor este uşor incizat reniform, asemănat şi cu
o boabă de fasole se găseste uşor excentric şi e inconjurat de citoplasmă azurofilă
bazofilă. Se găsesc în cantitate de 2-10% şi pe măsură ce migrează în ţesuturi se
transformă în macrofagele din respectivele ţesuturi cunoscute, celule Kupffer,
histiocite, sau alte tipuri de macrofage. Monocitele din sânge împreună cu
macrofagele din ţesuturi formează marele sistem monocito - macrofagic de apărare în
invaziile microbiene.

Tot în sângele circulant se pot observa mici fragmente, plachetele sangvine,


trombocitele care se găsesc între 150.000 - 400.000/ mm cub, care provin dintr-o
celulă mare numită megacariocit din măduva hematogenă, din care se desprind. Prin
aglomerare formează trombul alb, şi realizează coagularea sângelui.

Bibliografie:
BIOLOGIE CELULARĂ ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE, Conferenţiar
Dr. Med. Alexandra Crişu Bota si Asistent univ. Dr. Cezar Bologa, Universitatea
,,Lucian Blaga” din Sibiu Facultatea de Medicină ,,Victor Papilian”,2010, pag. 71-74.

22
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

III.2.Frotiu de sânge colorație Albastru brillant crezil

Acest tip de coloraţie se folosește pentru evidenţierea reticulocitelor.


În mod normal hematiile se formează în măduva hematogenă ca celule
nucleate, dar pe măsură ce se maturează îşi pierd nucleul şi pătrund în torentul
circulator.
În forma lor de hematii tinere se mai numesc şi reticulocite şi mai prezintă
resturi nucleare, respectiv ARN-ul din nucleu, care se evidenţiază cu această
coloraţie. Eritrocitele se maturează şi după 1 -2 zile în sângele circulant se transformă
în hematii adulte, care au o viaţă de până la 120 de zile.
Numărătoarea lor este importantă deoarece la persoanele anemice numărul lor
creşte, ajutând la diagnosticarea respectivelor afecţiuni.
Hematiile adulte se colorează într-un verde cenuşiu, iar reticulocitele (hematiile
tinere, care sunt şi uşor mai mari) se recunosc după granulele violet pe care le
prezintă în citoplasmă.

Bibliografie:
BIOLOGIE CELULARĂ ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE, Conferenţiar
Dr. Med. Alexandra Crişu Bota si Asistent univ. Dr. Cezar Bologa, Universitatea
,,Lucian Blaga” din Sibiu Facultatea de Medicină ,,Victor Papilian”,2010, pag. 75.

23
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

IV. METODE DE IZOLARE A CELULEOR

Izolarea celulelor are largă utilizare în culturile de celule cu aplicabilitate în


toate domeniile legate de sănătate:
- diagnosticare
- cercetare

IV.1. Metode de disecție


Sunt metodele cele mai vechi deoarece cu ajutorul lor toti precursorii culturilor de
tesuturi au obtinut primele celule in vitro. Exista mai multe tipuri:

- Constau in prelevarea unei bucati mici de țesut și suspendarea în mediu de


cultura.
- Tesutul respectiv trebuie taiat in fragmente mici. Apoi fragmentele sunt plasate
intr-un flacon de cultura ce contine un mediu nutritiv. Celulele vor migra din
fragmente, apoi se multiplica.
- Recipientul de cultura trebuie sa contina un volum foarte redus de mediu,
suficient pentru spalarea fragmentelor. Aceasta va evita „flotatia” explantelor
care va conduce inevitabil la incapacitatea lor de a permite migrarea celulelor.
Dupa cateva ore, cand explantul a aderat suficient la suport se poate suplimenta
cantitatea de mediu nutritiv de cultura.
- Pentru tesuturile moi, cum este tesutul nervos, poate fi utiliza o metoda
„mecanica” prin pipetare si descarcare succesiva cu ajutorul unei pipete cu
diametru mare.

IV.2. Metode enzimatice


Enzimele utilizate la separarea celulelor din tesuturi, sunt toate enzime
proteolitice care digera suprafata, in special proteica.

Enzima cea mai cunoscuta si mai des utilizata este TRIPSINA. Actiunea sa a
fost prezentata de catre Rous si Jones inca din 1911 (12), dar mai ales Moscona in
1952 (10) a descris in detaliu obtinerea de celule izolate sub actiunea tripsinei,
plecand de la un tesut. (Tripsina bruta sau cristalizata se utilizeaza la o
concentratie de 0,5 la 2,5 g/l intr-o solutie salina de tip Hanks sau PBS, cu sau fara
C2+ si Mg2+).
Exista numeroase tehnici care utilizeaza tripsina, insa toate respecta
aproximativ acelasi protocol. Metoda lui Fernandes (4) este una dintre cele mai
frecvent utilizate. Cele mai importante etape ale acestei tehnici sunt urmatoarele:
- Disectia tesutului, se adauga antibiotice.
- Pretripsinizarea ce consta in punerea in contact a bucatelelor de tesut cu o
solutie de tripsina, timp de aproximativ 15 minute, urmata de eliminarea
supernatantului. Aceasta pentru a ne debarasa de elementele sanguine si de
24
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

celulele moarte.
- Tripsinizarea efectuata sub agitatie magnetica la o viteza scazuta (pentru a
evita lezarea membranei celulare) si prin fractii de timp succesive. Aceasta
tripsinizare se efectueaza in diferite recipiente: erlenmaiere, fiole speciale
pentru tripsnizare, echipamentul de tripsinizare continuu sau celulele dispersate
sunt separate de tesut printr-un curent lichid.
- Inactivarea tripsinei prin diluarea suspensiei celulare fie cu mediu de cultura
la care s-a adaugat serum, fie cu inhibitorul tripsinei din soia (Sima 1mg/ml),
urmata de centrifugare la +40 C.

Pentru tesuturile bogate in colagen se utilizeaza adesea COLAGENAZELE (de


diferite grade de puritate, de la o concentratie de 0,1 pana la 2g/l intr-o solutie
salina determinata). Uneori se utilizeaza si un amestec colagenaza-tripsina.

De asemenea, uneori se utilizeaza si alte enzime, si anume: pronaza, un


amestec de proteaze neutre si alcaline, aminopeptidaze si carboxipeptidaze care
se obtin pornindu-se de la Streptomyces griseus si dispaze, proteaze neutre care se
obtin din Bacillus polymyxia.

25
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

IV. 3. Metode de cultură de celule

Principalele metode de culturi de celule sunt cele în monostrat și metodele de


culturi în suspensie (lichidă sau gel).

IV.3.1. Metodele de cultură monostrat


Principiul general al acestei metode este legat de afinitatea celulelor pentru un
suport, deoarece cea mai mare parte apartin unor tesuturi bine organizate. Prin
urmare, daca introducem intr-un recipient de cultura un anumit numar de celule,
acestea vor adera la suprafata si se vor dezvolta. Deci natura suportului este foarte
importanta.
La inceputul culturilor celulare, sticla era utilizata pe scara larga. Astazi,
materialele plastice tratate special pentru culturile celulare au inlocuit aproape in
totalitate sticla. Suprafata recipientului din plastic poate fi acoperita de diferite
suporturi fiziologice, cum ar fi: colagenul, fibronectina si recent cu membrane
bazale formate din produse extracelulare de diferite tipuri celulare, cum ar fi
celulele endoteliale sau retiniene. Compozitia membranei bazale este foarte
complexa; s-a gasit colagen, proteoglicani, glicoproteine ca fibronectina sau
lamina, care constitue o arhitectura tridimensionala foarte importanta pentru
mentinerea integritatii celulare. De asemenea, putem realiza diferite tipuri de
matrice artificiala unde celulele nu sunt cultivate pe suprafata, ci sunt incluse in
gel. Agaroza sau colagenaza sunt frecvent utilizate in acest mod in culturile
tridimensionale. Aceasta permite, pentru anumite tipuri celulare, sa se recreeze un
mediu apropiat cu conditiile in vivo si de asemenea, pentru a incuraja o mai buna
intretinere a functiilor de diferentiere.

Forma recipientelor de cultura este foarte variabila.


- Se folosesc flacoane si cutii Petri de diferite dimensiuni, tuburi Leighton (tuburi
plate ce contin lamele), microplaci, cutii de diferite dimensiuni.

In cazul metodelor de cultura stationare se pot distinge mai multe sisteme:


sistemele inchise , semi-inchise si deschise.
- Sisteme inchise - sunt constituite din flacoane de forme diferite care sunt
plasate in etuve clasice de tip bacteriologic.
- Sistemele semi-inchise - sunt constituite in general din cutii Petri sau din
microplaci.
- Sistemele deschise sau perfuziile, pentru cantitati mici de celule – se folosec
camere de cultura de tip Pomerat, Rose sau Sykes si Moore. Aceste camere
de cultura sunt utilizate in studiile ce necesita observatii de microscopie
fotonica. Pe de alta parte, pentru mari cantitati de celule, exista mai multe
modele, mai mult sau mai putin perfectionate, cum sunt tuburile ce se rotesc
prevazute cu sisteme de perfuzie. Aceste aparate pot servi pentru cultura
26
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

celulelor la nivel industrial.

Tehnicile de intretinere a acestor culturi.


Acestea sunt de 2 feluri.
1. schimbarea mediului ce consta in eliminarea mediului epuizat si inlocuirea
acestuia cu unul proaspat.
2. Transferarea - consta in transferul populatiei celulare dintr-un flacon de
cultura in care intreaga suprafata este acoperita intr-un flacon nou in care
suprafata este libera. Aceasta operatie necesita detasarea celulelor de suportul
lor, fie prin razuire mecanica, fie prin actiune enzimatica (tripsinizare).
Enzimele cele mai des utilizate sunt tripsina si colagenaza.

Ca exemplu, vom descrie tehnica cea mai simpla care este utilizata pentru
numeroase linii celulare in numeroase laboratoare. Acesta este realizat o data
sau de doua ori pe saptamana.
- Mediul de cultura este eliminat si inlocuit de catre o solutie de tripsina EDTA
(la o concentratie de 0,1 si 0,02%) preparat intr-o solutie de PBS fara Ca si Mg.
In absenta acestor ioni, interactiunile celula-celula si celula-suport se
fragilizeaza.
- Dupa unul sau doua minute de expunere excesul de solutie tripsina-EDTA
este eliminat; flaconul este plasat cateva minute la etuva (37 0C) pentru a
favoriza actiunea enzimatica.
- Numararea celulelor va da concentratia celulara in suspensie, si se realizeaza
o dilutie apropiata.

EVOLUTIA CELULELOR IN CULTURA

- In cazul evolutiei celulelor in vitro pot fi avute in vedere doua proprietati


fundamentale ale celulelor: capacitatea lor proliferativa si functia lor de
diferentiere. In cultura in vitro aceste doua proprietati au tendinta de a evolua
intr-o maniera foarte diferita, indiferent de metoda de cultura folosita.
- In cea mai mare parte a cazurilor, culturile celulare conserva potentialul lor de
diviziune, care de asemenea, poate fi stimulat la inceputul culturii. In acelasi
timp, pentru liniile normale se obseva o incetinire a ritmului proliferativ care
apar mai mult sau mai putin rapid, in functie de tipul celular si de varsta
donatorului.
asemenea pe morfologia celulelor precum si asupra activitatii lor functionale.

27
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

IV. 5. CAMERE DE NUMARAT CELULE

CAMERA DE NUMARAT NEUBAUER

Pentru numararea leucocitelor, trombocitelor si eritrocitelor


Adancimea camerei este de 0,1 mm
Marimea unui patratel mare: 1 mm2
Marimea unui patratel mic: 0,0025 mm2
Gratarul de numarare are 9 patratele mari
Patratelele din colturi sunt destinate numararii leucocitelor
Patratul mare din centru este divizat in 16 grupuri de patratele

28
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

CAMERA DE NUMARAT BURKNER

Destinata numararii leucocitelor si eritrocitelor.


Adancimea camerei este de 0,1 mm.
Marimea patratelului mare este de 1 mm2.
Gratarul de numarare are 9 patratele mari, care sunt utilizate pentru numararea
leucocitelor.
Fiecare patrat mai mare este divizat in 16 grupuri de patratele, destinate numararii
eritrocitelor.
Cele 16 grupuri de patratele nu sunt divizate.

29
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

V. TEHNICI DE INVESTIGAȚIE UTILIZATE ÎN BIOLOGIA


MOLECULARĂ
V.1. METODE DE IZOLARE ŞI PURIFICARE ALE ACIZILOR
NUCLEICI

V.1.1. Izolarea ADN genomic total din ţesut vegetal folosind metoda cu
SDS/Acetat de potasiu
Principiul metodei

Metoda este folosită pe scară largă pentru realizarea extracţiei de ADN din
ţesuturi vegetale proaspete. Sodiu dodecil-sulfat (SDS), un detergent neionic, este
utilizat pentru a elibera acizii nucleici din celulă. Moleculele de ARN din extract sunt
îndepărtate prin utilizarea ribonucleazelor, iar contaminanţii proteici eliminaţi cu
ajutorul proteinazei K.
Precipitarea ADN se realizeaza utilizând etanol, iar îndepărtarea totală a
contaminanţilor se va face după etapa de spălare a ADN cu etanol 70%. Realizarea
practică a metodei este relativ simplă şi se poate adapta pentru cantităţi variate de
material vegetal.

Material biologic: diferite tipuri de ţesut vegetal cum ar fi frunze sau seminţe.
Probele trebuie să fie proaspete şi îngheţate pe azot lichid.

Reactivi şi aparatură:
i) tampon de extracţie: 100 mM TRIS (pH 8), 50 mM EDTA (pH 8), 500 mM NaCl.
Reactivul se stochează la temperatura camerei şi este stabil o perioadă îndelungată;
ii) soluţie SDS 20%;
iii) soluţie acetat de potasiu 5 M;
iv) soluţie NaCl 5 M;
v) soluţie ribonuclează 20 mg/ml;
vi) soluţie proteinază K;
vii) etanol 100% şi 70%;
viii) izopropanol 100%;
ix) tampon salin TRIS-EDTA (TE): 1 mM TRIS-HCl (pH8), 0,1 mM EDTA (pH 8).
Reactivul se stochează la temperatura camerei şi este stabil o perioadă îndelungată;
x) 2-mercaptoetanol (2-ME);
xi) amestec 24:1 (v/v) cloroform
alcool izoamilic;
xii) apă ultrapură: apă purificată, deionizată şi lipsită de nucleaze;
xiii) termobloc;
xiv) agitator;
xv) microcentrifugă;
30
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

xvi) omogenizator sau mojar steril.

Mod de lucru
1. Ţesutul vegetal îngheţat pe azot lichid este omogenizat sau mojarat până
laobţinerea unei paste omogene.
2. Într-un tub de centrifugă de 2 ml se adaugă: 300 mg omogenat, 900 μl tampon
de extracţie (la care se adaugă extemporaneum β-mercaptoetanol până se ajunge la o
concentraţie de 2% -v/v- a acestuia) şi 80 μl SDS (20%).
3. Amestecul se agită puternic şi se incubează 10 minute la 65°C.
4. Dupa adaugarea a 300 μl acetat de potasiu 5 M, amestecul este plasat 20 minute
pe gheaţă.
5. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 10 minute, la 4°C.
6. Supernatantul este transferat într-un tub de centrifugă nou şi se adaugă un volum
egal de alcool izopropilic. Se amestecă uşor prin înclinarea tubului şi se plasează
amestecul 30 de minute pe gheaţă.
7. Centrifugare la 8000-11000 rpm,10 minute, la 4°C.
8. Supernatantul se aruncă şi peste sediment se adaugă 100 μl soluţie TE încălzită
la 65°C. Se amestecă puternic până când sedimentul se dizolvă complet.
9. După adăugarea a 10 μl soluţie ribonuclează se incubează 60 de minute la 37°C.
10. Se adaugă un volum egal de amestec de cloroform:alcool izoamilic 24:1 şi se
omogenizează prin inversia tubului timp de 5 minute.
11. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.
12. Se adaugă 10 μl proteinază K şi se incubează 60 de minute la 37°C.
13. Se adaugă un volum egal de amestec cloroform:alcool izoamilic 24:1 şi se
omogenizează prin inversia tubului timp de 5 minute.
14. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.
15. Supernatanul se transferă într-un tub de microcentrifugă nou şi se adaugă peste
acesta două volume de etanol 100% şi 1⁄2 volume de soluţie NaCl 5 M. Se
omogenizează
energic timp de 20-30 de secunde.
16. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.
17. Supernatantul este înlăturat prin inversia tubului, iar peste sediment se adaugă
etanol 70%. Se spală prin agitare uşoară, timp de 30-60 minute.
18. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.
19. Etanolul este îndepărtat prin înclinarea tubului. Sedimentul se lasă la uscat timp
de 15-20 minute la 37 0 C în curent de aer.
20. Sedimentul uscat este resuspendat într-un volum adecvat de apă ultrapură sau
de tampon TRIS-EDTA.
Bibliografie

LUCRĂRI PRACTICE BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI ŞI BIOLOGIE MOLECULARĂ,


Sergiu Emil GEORGESCU si Marieta COSTACHE, Univ. din Bucuresti, Facultatea de Biologie,
Departamentul de Biochimie si Biologie moleculara, ed. Bucuresti, 2009, pdf, pag. 26-28.

31
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

V.1.2. Izolarea ADN genomic total din ţesut vegetal folosind metoda cu
CTAB

Principiul metodei
Acest procedeu este folosit pe scară largă pentru realizarea extracţiei de ADN
din diverse surse vegetale. Iniţial, protocolul de extracţie a fost folosit la bacterii
(Jones, 1953), ulterior el fiind adaptat la plante (Murray and Thonpson, 1980).
Bromura de cetil-trimetil-amoniu (CTAB), care este un detergent neionic, este
utilizat în acest caz pentru a elibera acizii nucleici din celulă şi, ulterior, pentru a
forma un complex insolubil cu aceştia, la concentraţii de NaCl sub 0,5 M. În acest
timp, polizaharidele, compuşii fenolici şi alţii contaminanţi specifici plantelor vor
precipita şi vor putea fi îndepărtaţi. Complexul acizi nucleici-CTAB este solubil
numai în soluţii saline concentrate. Prin creşterea treptata a concentraţiei de NaCl,
complexul disociaza şi CTAB poate fi îndepărtat.
Precipitarea ADN se realizeaza utilizândPrecipitarea ADN se realizeaza
utilizând izopropanol, iar îndepărtarea totală a CTAB se face după etapa de spălare a
ADN cu etanol. Cantitatea de ADN care poate fi obţinută variază între 100 şi 500
μg per gram de ţesut vegetal iniţial. Cele mai mari cantităţi se obţin în cazul
ţesuturilor proaspete care au fost în prealabil îngheţate pe azot lichid. Realizarea
practică a metodei este relativ simplă şi se poate adapta pentru cantităţi variate de
material vegetal.

Material biologic: diferite tipuri de ţesut vegetal cum ar fi frunze, seminţe,


cotiledoane, polen. Probele pot fi proaspete, liofilizate, deshidratate sau îngheţate pe
azot lichid.

Reactivi şi aparatură:
i) soluţie de extracţie CTAB: 2% CTAB, 100 Mm TRIS-HCl (Ph 8), 20 Mm EDTA
(pH 8), 1,4 M NaCl. Reactivul se stochează la temperatura camerei şi este stabil pe o
perioadă îndelungată;
ii) soluţie de precipitare CTAB: 1% CTAB, 50 Mm TRIS-HCl (pH 8), 10 Mm EDTA
(pH 8). Reactivul se stochează la temperatura camerei şi este stabil o perioadă
îndelungată;
iii) tampon salin TRIS-EDTA (TE): 10 Mm TRIS-HCl (Ph 8), 0,1 Mm EDTA (pH 8),
1 M NaCl. Reactivul se stochează la temperatura camerei şi este stabil pe o perioadă
lungă;
iv) 2% (v/v) 2-mercaptoetanol (2-ME);
v) soluţie CTAB/NaCl: 10% CTAB în soluţie 0,7 M NaCl;
vi) amestec 24:1 (v/v) cloroform:octanol sau cloroform alcool izoamilic;

32
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

vii) etanol 80%;


viii) izopropanol 100%;
ix) apă ultrapură;
x) agitator;
xi) microcentrifugă;
xii) omogenizator sau mojar steril.

Mod de lucru
1. Ţesutul vegetal îngheţat pe azot lichid este omogenizat sau mojarat până la
transformarea în pulbere fină şi apoi este transferat într-un tub de microcentrifugă.
2. La soluţia de extracţie CTAB se adaugă 2-mercaptoetanol într-un volum adecvat
astfel încât concentarţia finală a acestuia să fie de 2%. Soluţia proaspăt obţinută este
încălzită la 65 °C. De asemenea se încălzeşte şi soluţia CTAB/NaCl.
3. Peste ţesutul vegetal proaspăt pulverizat se adaugă tampon de extracţie 2-
ME/CTAB şi soluţie CTAB/NaCl. Amestecul se vortexează foarte puternic până la
omogenizarea completă. Se incubează între 10 şi 60 de minute la 65 °C. Pentru
obţinerea unei cantităţi crescute de ADN este necesar un timp de 60 de minute. Pentru
fiecare 100 mg de ţesut vegetal proaspăt se adaugă câte 400 μl de tampon 2-
ME/CTAB şi câte 50 μl de soluţie CTAB/NaCl. În cazul folosirii unor ţesuturi
deshidratate, liofilizate sau uscate (ex. seminţe), tamponul de extracţie 2-ME/CTAB
trebuie diluat 1:1 cu apă ultrapură.
4. Se adaugă un volum egal de amestec cloroform: octanol sau cloroform: alcool
izoamilic 24:1 şi se vortexează puternic.
5. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4 °C. Se recuperează faza apoasă
superioară şi se transferă într-un tub curat.
6. Se adaugă un volum de 1/10 soluţie CTAB/NaCl din cantitatea totală recuperată
peste faza apoasă. Se amestecă energic prin inversia tubului.
7. După adaugarea unui volum egal de amestec cloroform:octanol sau
cloroform:alcool izoamilic 24:1 se vortexează puternic.
8. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4 °C. Se recuperează faza apoasă
superioară şi se transferă într-un tub curat. Aceasta poate avea o culoare galben-
maronie.
9. Se adaugă exact un volum de soluţie de precipitare CTAB şi se amestecă energic
prin inversie. ADN precipitat trebuie să devină vizibil în soluţie. Dacă acest lucru nu
se observă se incubeaza amestecul 30 minute la 65 °C.
10. Centrifugare la 2000-3000 rpm, 5 minute, la 4 °C. Viteza de centrifugare nu
trebuie crescută foarte mult deoarece sedimentul va fi foarte greu de resuspendat.
Dacă sedimentul nu este vizibil se adaugă încă 1/10 soluţie de precipitare CTAB din
volumul total şi se incubeaza între 1 şi 12 ore, la 37 0 C. Ulterior se repetă etapa de
centrifugare.
11. Supernatantul se reia într-un tub curat de microcentrifugă şi este păstrat.
Sedimentul este resuspendat în tampon salin TRIS-EDTA (se adaugă între 0,5 şi 1 ml
de tampon salin pentru fiecare gram de material vegetal supus extracţiei). Dacă

33
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

sedimentul nu se resuspendă se trece la o incubare timp de 30 de minute la 65 °C şi se


reia operaţia până la resuspendarea totală.
ATENŢIE: Este posibil ca ADN să se regăsească în supernatant. În acest caz etapele
ulterioare se vor continua folosind supernatantul. Pentru a verifica prezenţa ADN în
supernatant este recomandată citirea absorbanţei acestuia la 260 nm.
12. ADN este precipitat prin adăugarea unui volum egal de izopropanol rece. Se
omogenizează bine conţinutul prin agitarea tubului.
13. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 15 minute, la 4 °C. Izopropanolul este îndepărtat
prin înclinarea tubului.
14. Sedimentul obţinut se spală cu 1 ml etanol 80%, 60 de minute prin agitare.
15. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 15 minute, la 4 °C. Etanolul este îndepărtat prin
înclinarea tubului. Sedimentul se lasă la uscat timp de 15-20 minute, la 37 °C, în
curent de aer.
OPŢIONAL: Pentru o mai bună spălare a ADN şi pentru îndepărtarea totală a CTAB
se repetă etapele 14-15.
16. Sedimentul uscat este resuspendat într-un volum adecvat de apă ultrapură sau de
tampon TRIS-EDTA.
Bibliografie

LUCRĂRI PRACTICE BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI ŞI BIOLOGIE MOLECULARĂ,


Sergiu Emil GEORGESCU si Marieta COSTACHE, Univ. din Bucuresti, Facultatea de Biologie,
Departamentul de Biochimie si Biologie moleculara, ed. Bucuresti, 2009, pdf, pag. 28-31.

34
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

V.2. Spectrofotometria și dozarea în biologia moleculară.

V.2.1. Spectrele de absorbţie ale bazelor azotate

Principiul metodei

Bazele purinice şi pirimidinice, nucleozidele şi nucleotidele corespunzătoare


pot fi uşor detectate datorită absorbţiei lor în UV. Bazele purinice şi derivaţii lor
nucleozidici şi nucleotidici au o absorbţie mai mare decât pirimidinele şi derivaţii lor.
Spectrul de absorbţie în UV pentru fiecare bază azotată sau nucleotid depinde
de pH. La pH 7, lungimea de undă la care se înregistrează maximul de absorbţie
pentru bazele azotate se situează în jurul valorii de 260 nm.

Reactivi şi aparatură:
i) soluţii de baze azotate 10 μg/ml;
ii) spectrofotometru UV-VIS.

Mod de lucru: se realizează spectrul de absorbţie pentru toate soluţiile de baze


azotate în intervalul 200–400 nm.

Rezultate şi discuţii
În urma realizării spectrelor se vor observa maximele de absorbţie pentru
fiecare soluţie de bază azotată în parte. Valorile acestor maxime pot varia între
anumite limite în funcţie de pH.

Bibliografie

LUCRĂRI PRACTICE BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI ŞI BIOLOGIE MOLECULARĂ,


Sergiu Emil GEORGESCU si Marieta COSTACHE, Univ. din Bucuresti, Facultatea de Biologie,
Departamentul de Biochimie si Biologie moleculara, ed. Bucuresti, 2009, pdf, pag. 48.

35
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

V.2.2. Spectrul de absorbţie al ADN. Determinarea spectrofotometrică


a purităţii şi concentraţiei ADN.

Principiul metodei

ADN-ul extras din diferite surse biologice trebuie verificat pentru estimarea
purităţii şi integrităţii înainte de a fi utilizat în diferite manipulări moleculare.
Aprecierea gradului de puritate al unui extract ADN se realizează prin evaluarea
valorii absorbanţei la diferite lungimi de undă (260 şi 280 nm), la un
spectrofotometru UV, în cuve de cuarţ cu drum optic cunoscut.
Folosirea acestor cuve este absolut necesară deoarece cuarţul permite trecerea
radiaţiilor luminoase din spectrul UV.
În paralel, se recomandă şi determinarea întregului spectru de absorbţie al
probei în domeniul 200 - 400 nm, pentru a evidenţia prezenţa altor maxime la lungimi
de undă diferite de cele de interes, care pot aparţine eventualilor contaminanţi.
Verificarea purităţii ADN se realizează spectrofotometric pe baza următoarelor
considerente:
i) moleculele de ADN mono- sau dublucatenar prezintă absorbanţă maximă la
lungimi de undă cuprinse între 257 şi 260 nm;
ii) proteinele care pot impurifica extractul au absorbanţa maximă la 280 nm;
iii) glucidele rămase eventual în extract au absorbanta maxima la la 230 nm;
iv) oligonucleotidele rezultate din fragmentarea ADN în timpul extracţiei prezintă
absorbanţa maximă la 220 nm.

Determinarea concentraţiei ADN dintr-un extract se bazează pe citirea absorbanţei la 260


nm şi pe folosirea următoarelor formule:
A 260 = 1 corespunde la 50 μg ADN dc/ml;
A 260 = 1 corespunde la 33 μg ADN mc/ml.

Reactivi şi aparatură:
i) soluţie de ADN de concentraţie necunoscută;
ii) spectrofotometru UV-VIS.

Mod de lucru

Se determină spectrul de absorbţie pentru soluţia de ADN în intervalul 200–400 nm şi


se identifică maximul de absorbţie. Se citesc absorbanţele soluţiei de ADN la 260,
230 şi 280 nm şi se calculează valorile rapoartelor A 260 /A 280 şi A 260 /A 230

36
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

pentru a determina gradul de puritate al soluţiei. Cu ajutorul valorii de absorbanţă la


260 nm se calculează concentraţia soluţiei de ADN folosind formulele de mai sus.

Rezultate şi discuţii
Eventualele maxime de absorbtie pot fi datorate potenţialilor contaminanţi din
soluţia de ADN.
În funcţie de valorile A 260 şi A 280 se poate stabili gradul de contaminare
proteică sau cu ARN a extractului ADN. Raportul optim A 260 /A 280 este cuprins
între 1,8 şi 2.
Un raport mai mic de 1,8 ne indică prezenţa proteinelor în timp ce un raport
mai mare de 2 este un indiciu al contaminării cu ARN.
Raportul A 260 /A 230 oferă informaţii asupra gradului de contaminare cu
polizaharide a extractului ADN. Valoarea normală a acestuia este 2. Un raport mai
mic indică o contaminare cu polizaharide.
Bibliografie

LUCRĂRI PRACTICE BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI ŞI BIOLOGIE MOLECULARĂ,


Sergiu Emil GEORGESCU si Marieta COSTACHE, Univ. din Bucuresti, Facultatea de Biologie,
Departamentul de Biochimie si Biologie moleculara, ed. Bucuresti, 2009, pdf, pag. 50-52.

37
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

VI. Tehnici de amplificare a AND-ului. Reacția PCR-variante și


tehnici derivate.
Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) a fost pusă la punct în 1985 de către Kary Mullis şi
colaboratorii săi. Tehnica PCR este cu siguranţă metoda care a cunoscut cea mai rapidă şi
spectaculoasă dezvoltare din istoria biochimiei, iar K. Mullis a primit premiul Nobel pentru chimie
în 1993 deoarece aceasta tehnică a reuşit sa revoluţioneze dezvoltarea biologiei moleculare având
aplicabilitate largă în domenii din ce în ce mai diverse: genetică, microbiologie, virusologie,
hematologie, oncologie, etc..
În decursul timpului au fost dezvoltate o serie de interpretări ale conceptului de bază şi
introduse inovaţii atât la nivelul etapelor cât şi la nivelul aparaturii utilizate în vederea realizării
practice şi automatizării tehnicii. PCR se bazează pe o tehnologie in vitro care imită capacitatea
naturală de replicare a ADN şi care constă în generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvenţe
nucleotidice ţintă (ADN sau ARN). Numărul de copii ale secvenţei ţintă creşte exponenţial cu
fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secvenţă nucleotidică nou sintetizată constituie o
matriţă pentru o nouă copie.
Produşii PCR, care reprezintă copiii ale moleculelor de ADN/ARN ţintă originale, sunt
denumiţi ampliconi. Această metodă permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor
concentraţii foarte scăzute ale secvenţei ţintă. Cu toata simplitatea principiului tehnicii şi faptul că
realizarea practică a cunoscut evoluţii de excepţie, există numeroase etape care pot introduce erori
în rezultatele obţinute dacă nu sunt pe deplin controlate.
Utilizatorul trebuie să înţeleagă şi să integreze logic etapele care trebuie parcurse pentru
obţinerea unor rezultate finale corespunzătoare scopului în care este folosită tehnica. Proprietatea
ADN polimerazelor de a sintetiza noi catene de ADN pornind de la primeri oligonucleotidici este
utilizată în tehnica PCR pentru a amplifica de aproximativ un milion de ori secvenţa ţintă, prin
replicări succesive.
Pentru a se putea realiza practic acest lucru este necesară alegerea unor secvente
oligonucleotidice (primeri sintetici), capabile să hibridizeze la capetele secvenţei de amplificat şi
folosirea unei ADN polimeraze termostabile care permite automatizareaprocesului de amplificare
conducând la acumularea exponenţială a secvenţei ţintă la fiecare ciclu de amplificare. O reacţie
PCR se realizează în trei etape diferite:
I. Denaturarea ADN matriţă.
II. Hibridizarea primerilor pe bază de complementaritate.
III. Sinteza unei noi catene având drept matriţă catena ţintă de ADN.
Prima etapă consta în denaturarea termică a macromoleculei de ADN dublu-catenare. Astfel,
temperatura amestecului de reacţie, care conţine şi ADN, este ridicată până la 94-96oC,
determinând ruperea punţilor de hidrogen stabilite pe bază de complementaritate între cele două
catene şi a forţelor de stivuire care apar între planurile bazelor azotate. După această etapă, în
soluţie, vom regăsi ADN monocatenar.
În etapa a doua are loc hibridizarea primerilor sintetici la catena de ADN. Primerii sunt
molecule oligonucleotidice monocatenare, scurte de ADN, desemnate artificial pe bază de
complementaritate cu secvenţa din ADN care urmează a fi amplificată.
Hibridizarea primerilor se efectuează prin scăderea temperaturii amestecului de reacţie
până la o valoare care permite refacerea punţilor de hidrogen dintre aceştia şi catena matriţă.
Desemnarea primerilor este un proces laborios de care depinde reuşita reacţiei PCR. La
alegerea acestora trebuie respectate câteva reguli generale:
a) lungimea optimă a primerilor trebuie să fie cuprinsă între 18 şi 33 de nucleotide.
b) primerii trebuie să conţină un număr aproximativ egal din cele patru baze azotate, evitându-se pe
cât posibil regiunile cu repetiţii nucleotidice. Respectarea acestei reguli va conduce la eliminarea
potenţialelor regiuni cu structuri secundare.

38
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

c) perechile de primeri trebuie alese astfel încât să nu prezinte complementaritate la nivel intra- şi
interindividual, fiind astfel permisă reducerea la minim a posibilelor interacţii dintre primeri (ex.
formarea de dimeri de primeri).
d) distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai mică de 5 kpb. S-a observat o
eficienţă foarte scăzută a reacţiei în cazul în care lungimea produsului de amplificare depăşeşte 2-3
kpb.
e) pentru utilizarea acestora în condiţii bune trebuie stabilită cu exactitate temperatura optimă de
hibridizare.
În cea de-a treia etapă are loc sinteza unei noi catene de ADN complementară cu matriţa,
pornind de la primeri, cu ajutorul unei ADN polimeraze şi în prezenţa deoxinucleotid trifosfaţilor.
La final, în amestecul de reacţie, se regăsesc moleculele de ADN dublucatenare, de aceeaşi lungime
cu distanţa dintre cei doi primeri la nivelul catenei matriţă.
Sinteza noilor catene poate fi repetată prin reluarea celor trei etape într-un nou ciclu de
amplificare. Fiecare catenă nou sintetizată devine matriţă pentru un nou ciclu de amplificare, astfel
încât secvenţa ţintă de ADN este selectiv amplificată după fiecare ciclu de reacţie. Produsul de
reacţie sau amplicon conţine la capete secvenţele primer folosite la amplificare.

Realizarea reacţiei PCR în gradient de temperatură pentru


optimizarea
hibridizării primerilor

Principiul metodei

La începutul oricărui experiment care utilizeaza tehnica PCR este necesară parcurgerea unei etape
extrem de importante care constă în optimizarea temperaturii de hibridizare a primerilor prin
realizarea unei reacţii PCR în gradient de temperatură. În aceasta reacţie, ADN matriţă este
hibridizat concomitent la temperaturi diferite cu aceeaşi primeri în scopul stabilirii temperaturii
optime, care să permită eliminarea amplificărilor parazite şi realizarea cu un randament maxim a
reacţiei PCR. Totodată, în decursul unei astfel de reacţii de optimizare, pot fi variate şi intervalele
de timp în care sunt parcurse treptele de temperatură, cât şi numărul de cicluri de amplificare.

Material biologic: probe de ADN genomic de diferite provenienţe.

Reactivi şi aparatură pentru reacţia de amplificare:


1. amestec de deoxinucleotide, 10 mM din fiecare;
2. clorură de magneziu 25 mM;
3. tampon PCR 10X care conţine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3;
4. ADN polimerază 5 U/μl;
5. apă ultrapură;
6. primer sens, 20 μM şi primer antisens, 20 μM;
7.aparat PCR cu gradient de temperatură (termocicler);
8. microcentrifugă;
9. agitator.

Reactivi şi aparatură pentru electroforeză:


1. tampon de electroforeză TAE 1X– TRIS 40 mM, acid acetic 40 mM, EDTA 2 mM care se prepară
ca soluţie 10X şi este diluată înainte de folosire;

39
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

2. tamponul probei care conţine albastru de bromfenol 0,3% şi glicerol 30% în TAE 1X;
3. soluţie de bromură de etidiu 10 μg/ml;
4. marker de masa moleculară;
5. agaroză;
6. tanc de electroforeză orizontală pentru acizi nucleici;
7. sursă de curent; viii) transiluminator UV;
8. plită cu încălzire şi agitare magnetică.

Mod de lucru
1. Se adaugă reactivii prezentaţi în tabelul 1 într-un tub de centrifugă pentru a obţine amestecul de
reacţie. Se vortexează şi se centrifugează uşor.

Tabel 1. Reactivi şi cantităţi necesare realizării reacţiei PCR în gradient.

2. Se adaugă 20 μl din amestecul de reacţie pentru fiecare probă care va fi supusă unei anumite
temperaturi de hibridizare a primerilor. Ulterior se adaugă câte 5 μl AND genomic, diluat
corespunzător (50 ng/reacţie). Se vortexează şi se centrifugează uşor pentru omogenizare.
3. Tuburile se aşează în aparatul de PCR si se realizeaza programarea aparatului în conformitate cu
programul prezentat în tabelul 2.

Tabel 2: Etapele reacţiei PCR.

40
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

După terminarea reacţiei PCR se realizează o electroforeză în gel de agaroză pentru


vizualizarea produşilor de amplificare.
Gelurile de agaroză, desi au o putere de rezoluție mai mica decât cele de poliacrilamidă, sunt
cele mai utilizate pentru separarea, identificarea și purificarea fragmentelor de acizi nucleici de
dimensiuni mari (fragmente de la 200 bp – 50Kbp), în funcție de concentrația agarozei. Fragmente
mai mari de AND de până la 10000 Kbp pot I separate în geluri de electroforeză în camp pulsatile.
Mai întâi se pregătește gelulul de agaroză 2%.
Produşii de amplificare se amestecă cu tamponul probei şi se încarcă în godeuri cu o pipetă
automată. Se conectează tancul de electroforeză la sursa de curent şi se porneşte electroforeza.
Migrarea se desfăşoară la tensiune constantă şi la temperatura camerei, timp de 40 – 50 de minute,
în funcţie de mărimea fragmentelor amplificate. La finalul migrării, vizualizarea benzilor de ADN
se realizează cu ajutorul unui transiluminator UV.

Rezultate şi discuţii

În funcţie de profilul, de numărul şi intensitatea benzilor rezultate în urma reacţiei se


stabileşte temperatura optimă de hibridizare a primerilor. Tot pentru optimizarea reacţiei se poate
varia şi timpul etapelor de polimerizare şi de extensie finală sau/şi numărul de cicluri de
amplificare.

Două electroforeze ale produşilor unor reacţii PCR, în gradient de temperatură sunt
prezentate în continuare. În ambele figuri, se observă clar influenţa temperaturii de hibridizare a
primerilor asupra PCR. În figura 13, se observă formarea produşilor de amplificare nespecifici,
pentru primele trei temperaturi de hibridizare. Acest fapt este datorat hibridizării nespecifice a
primerilor, la nivelul altor situsuri decât cele pentru care au fost desemnaţi. Aceeaşi situaţie este
observată şi în figura 1, în cazul primelor patru temperaturi setate. În urma analizei rezultatelor se
poate afirma că temperaturile optime de hibridizare se încadrează în intervalul 56 - 60o C (pentru
primul exemplu) şi între 58 şi 60o C (pentru exemplul al doilea).

Figura 1. Reacţie PCR în gradient de temperatură. 1 – 52o C; 2 – 52,7o C; 3 – 53,7o C; 4 – 55,1o C; 5


–57,2o C; 6 – 58,6o C; 7 – 60o C; 8 – marker de masă moleculară 100 pb.

41
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 2.: Reacţie PCR în gradient de temperatură. 1 – 52o C; 2 – 52,7o C; 3 – 53,7o C; 4 – 55,1o C;
5– 57,2o C; 6 – 58,6o C; 7 – 59,6o C; 8 – 60o C; 9 – marker de masă moleculară 50 pb.

Bibliografie

LUCRĂRI PRACTICE BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI ŞI BIOLOGIE MOLECULARĂ,


Sergiu Emil GEORGESCU si Marieta COSTACHE, Univ. din Bucuresti, Facultatea de Biologie,
Departamentul de Biochimie si Biologie moleculara, ed. Bucuresti, 2009, pdf, pag. 262-67.

42
Biologie celulară și moleculară - ș. l. Lungu Maria Magdalena

Bibliografie
1. Molecular Biology of the Cell, 4th, Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter
P., ed., New York, Garland Publishing, 2002.
2. Molecular Biology of the Cell sixth edition, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis,
David Morgan, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter, ed. Garland Science, 2015, pdf.
3. Cell and Molecular Biology Concepts and Experiments, editia a 6-a, Gerald Karp, 2010, ISBN-
13978-0-470-48337-4, Printed in the United States of America, pdf.
4. LUCRĂRI PRACTICE BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI ŞI BIOLOGIE MOLECULARĂ,
Sergiu Emil GEORGESCU si Marieta COSTACHE, Univ. din Bucuresti, Facultatea de Biologie,
Departamentul de Biochimie si Biologie moleculara, ed. Bucuresti, 2009.
5. BIOLOGIE CELULARA INDRUMATOR DE LUCRARI PRACTICE, Conferenţiar Dr. Med.
Alexandra Crişu Bota, Universitatea ,,Lucian Blaga” din Sibiu, Facultatea de Medicină ,,Victor
Papilian”, 2010
6. 2. Curticăpean M., Tehnici de biologie moleculară și genetică, University Press, Târgu-Mureș,
2016
Referinte electronice:
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books&itool=toolbar
• http://www.cellsalive.com
• http://www.pubmed.com

43