LP - 2 - Sem 1

Laborator de Biologie Celulară și Moleculară
Disciplina de biologie celulară

și moleculară
Asist.univ.dr.Covaci Aurelia
Microscopia optică
Descrierea microscopului optic
Formarea imaginii. Aplicații practice
Obiectul biologiei celulare

 Biologia celulară și moleculară = este ramura științelor

biologice care se ocupă cu studiul structurii,ultrastructurii si
funcțiile ca unitate fundamentală în alcătuirea organismelor.
 Obiectul de studiu îl constituie celula, la care descriem
caracterele comune (generale) pentru toate celulele.
 Molecular- reprezentat de moleculele din care sunt formate
organismele. În compoziția materiei vii sunt prezente atât
substanțe anorganice(apa,ioni anorganici) cât și substanțe
organice.
Cuprins
1. Origine
2. Domenii de utilizare
3. Microscopia optică, rezoluția microscopului
3. Microscopul optic– componente
4. Utilizarea microscopului-etape
Care este originea microscopului?
 Povestea microscopului
începe la sfârşitul secolului al
XVI-lea, când doi olandezi care
confecţionau ochelari –
Zaccharias şi Hans Jansen – au
efectuat un experiment care
implica privirea prin mai multe
lentile introduse într-un tub.
astfel în anul 1590, a apărut

microscopul compus
 inspirat de pe urma acestei
invenţii, Galileo Galilei şi-a
construit propriul microscop –
precum şi propriul telescop, în
aceeaşi perioadă , adăugându-i
un dispozitiv de concentrare a
razelor de lumină.
 1665 - Robert Hook, utilizînd un microscop
perfecționat, a studiat structura plutei și pentru
prima dată a utilizat termenul de celulă.
 1650 - Antoni van Leeuwenhoeck cu ajutorul unor
lentile simple bine șlefuite a examinat embrioni și
diferite organisme unicelulare, inclusiv bacterii.
 1831- Robert Brown a descris nucleul
 1838-1839- Botanistul Sclaeiden și zoologul
Schwann au imbinat ideile diferitelor cercetători și
au formulat teoria celulară.
 1855- Vircov a demonstrat că celulele se formează din alte
celule prin diviziunea celulară.
 Ribosomii- descoperiti de G.EMIL PALADE-premiul nobel
ÎN CE DOMENII FOLOSIM MICROSCOPUL?
 microscoapele s-au dovedit

a fi unelte puternice pentru
cercetarea și investigarea
structurii principale a
materiei în special
 în curtea medicinei, a
biologiei
Numele: Microscopie
Greaca
mikros= mic
skopein= a observa
“Observarea unor structuri mici”

Microscopia optică
 Microscopul optic = dispozitiv cu ajutorul

căruia se pot examina structuri cu
dimensiuni mult sub puterea de rezoluție a
ochiului uman.
Componentele microscopului optic

 5. REVOLVER
 1. SURSĂ DE LUMINĂ
 6. OBIECTIVE
 2. CONDENSATOR SI DIAFRAGMĂ
 7. SISTEM DE PRISME
 3. MASA SAU PLATFORMA
 8. OCULARE
 4. DISPOZITIV DE DEPLASARE A
 9. MACROVIZA
LAMEI
 10. MICROVIZA
 11. Controlori coaxiali a
suportului de lame
Microscopul optic - componente

O c u laru l
M asa
C o n d en sato r
M acro si
S u rsa lu m in a m ic ro v iz a
Modul de formare a imaginii la MO

 Ocularul - are ca obiect
imaginea dată de obiectiv și va
forma imaginea finală mult
marită, răsturnată și virtuală, la
infinit deci nu necesită efort de
acomodare.
 Obiectivul - formează o imagine
mărită, răsturnată și reală a
specimenului.
Performanțele microscopului optic
 puterea de mărire
 puterea de rezoluție
Puterea de mărire
 Puterea de mărire = produsul dintre puterea de
mărire a obiectivului și cea a ocularului

 Puterea de mărire maximă 1500 x
 Puterea de mărire
 4×; 10 ×; 20×;
 40×; 60 ×; 80x ; 100×

Puterea de rezoluție a microscopului optic
 cea mai mică distanţă dintre două puncte la care acestea

pot fii percepute distinct
 de ea depinde claritatea şi bogăţia în detalii a imaginii
 depinde de lentila obiectivului
FORMULA LUI ABBÉ: d=/ n sinα

= lungimea de undă a radiaiței electromagnetice ( 0,55 µm)
n= indicele de refrac ție al mediului dintre preparat și obiectiv
= ½ din apertura unghiulară obiectivului

Laborator de Biologie Celulara si Moleculara
Puterea de rezoluție a microscopului optic
Limitările puterii de rezoluție a microscopului optic în

practică
  - este o constanta naturală ce nu poate fi

influențată (0,55)
 n - mediul dintre preparat și obiectiv este de
obicei aer (n = 1)
Puterea de rezoluție
Obiectivul cu imersie
 între obiectiv și preparat se interpune o
picatură de lichid cu un indice de refracție
supraunitar, cum este uleiul de cedru
(n=1,51)
 sin  - apertura unghiulară maximă

teoretică este 180 , deci =90, limita
teoretica maximă
 rezoluția maximă a microscopului optic
= 0,2
Microscopul de-a lungul timpului

TIPURI DE MICROSCOAPE
Studiul celulelor vii, necolorate
1. MICROSCOP CU
CÂMP ÎNTUNECAT
2. MICROSCOP CU
CONTRAST DE FAZĂ
3. MICROSCOP CU
INTERFERENŢĂ
4. MICROSCOP TIP
NOMARSKI
5. MICROSCOPUL
RANVERSAT
Studiul celulelor vii, necolorate

MICROSCOP CU CÂMP ÎNTUNECAT
PRINCIPIU
 există un diafragm în
condensor care selectează
doar lumina laterală iar
imaginea finală este formată
de către razele reflectate de
componentele din preparat
MICROSCOP CU CONTRAST DE FAZĂ
PRINCIPIU
 lumina care trece prin medii cu indici i de
refracţie diferiţi îşi modifică direcţia şi
viteza
 micoscopul transformă aceste diferenţe în
diferenţe de intensitate luminoasă
MICROSCOP CU INTERFERENŢĂ
PRINCIPIU
 mai foloseşte încă o rază de lumină care nu
traversează ţesutul analizat ,dar interferă cu raza
provenită de la sursa de lumină
 oferă informaţii despre densitatea obiectului
analizei
MICROSCOP TIP NOMARSKI
PRINCIPIU
 un tip modificat al
microscopului cu contrast de
fază, oferind imagini aparent
tridimensionale

..
MICROSCOPUL RANVERSAT
 pentru examinarea celulelor din flacoane

sau plăci Petri
 obiective sub măsuță
 sursa de lumină deasupra
MICROSCOPUL OPTIC– COMPONENTE:
1. Oculare
2. Revolver
3. Obiective
4. Macroviza
5. Microviza
6. Masa suport lame
7. Sursa lumină
8. Lentila Condensor și
diafragma
9. Controlori coaxiali a
suportului de lame
10. Dispozitiv de deplasare
1. Ocularele
ocularele lucrează în
combinație cu obiectivele pentru a
realiza mărirea obiectelor așa
încat se pot observa detaliile
diferitelor structuri (factorul de
mărime uzual ca valoare este
între cuprins între 5x la 25x,
frecvent10x).
 înscrisurile de pe partea laterală a ocularelor

indică anumite caracteristici ale acestora (WF
pentru wide field; UWF pentru ultra wide field;
SW si SWF pentru super wide field și CF pentru
oculare ce sunt utilizate cu obiective ce au
corecție (CF corrected objectives).
2. Revolverul
 reprezintă o
componentă metalică
rotativă în care sunt
fixate obiectivele prin
înfiletare.
 acest revolver poate avea doar un singur orificiu

pentru obiectiv sau pentru mai multe, cu
posibilitatea rotirii acestuia și a obiectivelor
implicit în poziția optimă pentru examinare.
3. Obiectivele.
 Exemplu: 10x / 0.25
 10x: înseamnă ca acest obiectiv

marește de 10x
 0.25 reprezintă Apertura

Numerică (N.A.) a obiectivului.
Cu cât N.A.este mai mare , cu
atât puterea de rezoluție a unui
obiectiv este mai mare .
apertura numerică a unui obiectiv este o măsură a capacității sale de a

aduna lumina și de a “rezolva” astfel detalii ale specimenelor fine, la o
distanță fixa de obiectiv.
4. Macroviza
5. Microviza
6. Suport lama
4. Macroviza - este un buton rotund pe
partea laterală a microscopului, este
utilizat pentru focalizarea specimenului;
prin utilizarea acesteia specimenele se pot
deplasa în plan vertical.
 ea are o treaptă superioară de mișcare
5. Microviza - este un buton mic , rotund pe partea laterală
a microscopului,utilizat pentru a ajusta focalizarea

specimenului, după folosirea grosieră a
macrovizei,buton de reglare
6. Zonă plană - în conformitate cu obiectivele
 are o gaură centrala în ea ( vezi diagrama) care permite

trecerea luminii.
 există două clipuri/cavaleri pe partea de sus a
suportului de lama prin care putem ține specimenul fix.
7. Sursa de lumină: sistem de oglinzi și lumină

8. Lentila condensor și diafragma
7. Sistemul de iluminare
 este alcătuit dintr-un numar de oglinzi
poziționate în unghiuri diferite care au rolul de a
conduce fasciculul de lumină
 acest sistem de iluminare este localizat
în ”talpa”/partea de jos a microscopului
 tot acolo există și un bec ce asigură generarea
fascicului de lumină.
8. Diafragma – controlează cantitatea de lumină ce

ajunge la obiective.
Lentilele condensor - sunt o componentă esențială a

microscopului.
 au rolul de a concentra fasciculele de lumină ce
străbat proba analizată, asigurând cantitatea de
lumină necesară, contrast și claritate în examinarea
specimenului.
 condensorul este alcătuit din mai multe lentile

poziționate imediat sub suportul de lamă și poate
fi ajustat ca funcție prin apropierea sau
îndepărtarea acestuia față de suportul de lamă
UTILIZAREA MICROSCOPULUI OPTIC
Pașii următori sunt necesari a fi utilizați de fiecare data

când folosiți microscopul optic:
1. Conectați și porniți alimentarea microscopului
2. Deschideți diafragma a condensatorului complet
( dacă este închisa)
3. Rotiți obiectivul 4x în poziție cu ajutorul revolverului
port-obiectiv
4. Utilizați butonul macroviză pentru a muta

suporul de lamă în jos pe axa verticală pentru
a face loc pentru plasarea unui specimen
5. Puneți un preparat pe suportul de lamă.

Fixați lama în poziție cu cleme/cavalerii
existenți pe suportul de lamă.
6. Se ridică suportul de lama pe verticală utilizând

macroviza, astfel încât să fie aproape de lentila
obiectivului
7.Aduceți specimenul în zona de lumină, folosind
controlorii//butoanele coaxiale
8. Se privește în microscop prin lentilele
ocularului.Treptat mutați manual lentilele ocularului,mai
aproape sau mai departe în afară, până când imaginile
de la ambii ochi fuzionează într-o singură imagine.
9. Imaginea va apărea rotind încet butonul
grosier/macroviza
Focusarea imaginii se face prin butonul de
reglaj/microviză
NU ÎNCERCAȚI SĂ FOCUSAȚI/CLARIFICAȚI
IMAGINEA CU MACROVIZĂ SUB OBIECTIV
MARE
10. Selectați o zonă de pe proba pe care doriți să o

vizualizați (ob.4x) + butoanele coaxiale.
Rotiți port-obiectivul rotativ și schimbați obiectivele

: 4 x ;10X ; 10X;20X;100x pentru examinare
ASIGURATȚI-VĂ CA PRIN SCHIMBAREA
OBIECTIVELOR NU SPARGEȚI LAMELE
11. Când ați terminat observațiile dumneavoastră la

microscop :
coborâti suportul de lamă utilizând macroviza
rotiți la obiectivul 4X în poziția de vizionare
scoateți lama cu proba examinată
OPRIM DE LA BUTONEL
DECONECTAM DE LA SURSA DE CURENT
DIFERITE TESUTIRI
COLORATE SI VIZUALIZATE
LA MO
Coloratie-HE-tubuli renali
Epiteliu tubular simplu-colon
Epiteliu acinos seros compus - pancreas
Epiteliu acinos mucos compus - esofag
Epiteliu acinos mixt compus - glanda mandibulară
Țesut conjunctiv adipos alb - cord
Țesut cartilaginos hialin - trahee
Țesut cartilaginos elastic - pavilionul urechii
Fibre musculare striate cardiace
Fibre musculare netede
Țesut conjunctiv lamelar – cornee
Amiloidoza renala, glomerul cu amiloid, Rosu Congo, 40x
Lipide colorate in rosu portocaliu –Sudan III
Glicogenul - ficat
LP 4
MICROSCOPUL OPTIC
EXAMINARE cu OBIECTIVUL
DE IMERSIE
partea cea mai importantă a unui microscop

este obiectivul, fiindcă de calităţile lui depind
calităţile imaginii
obiectivul este format din mai multe lentile montate

într-un tub metalic
lentila inferioară este plan convexă, cu faţa plană
spre obiect şi se numeşte lentilă frontală
 puterea de mărire a ei este în raport direct cu mărimea

unghiului de deschidere, adică cu unghiul format de razele
de lumină divergente extreme, care plecând din punctul O,
aflat pe obiect, pătrund în lentilă.
 puterea de mărire a unui obiectiv este cu atât mai mare cu

cât diametrul lentilei sale frontale este mai mic.
între obiect şi lentila frontală trebuie să rămână

întotdeauna un spaţiu de cel puţin 1,5 mm, numit
distanţă frontală.
 acest spaţiu poate fi liber (aer) în cazul obiectivelor
uscate
 în cazul obiectivelor cu imersie, poate fi ocupat de
un lichid cu indice de refracţie (n) apropiat cu al
sticlei, cum este apa (n=1,33) sau egal cu al sticlei, în
cazul uleiului de cedru (n=1,51).
 în cazul obiectivelor cu imersie, dacă se introduce

între lentila frontală şi lama ulei de cedru, cu
indicele de refracţie 1,51, egal cu al sticlei, sunt
eliminate fenomenele de reflexie a luminii,
precum şi fenomenele de refracţie
deci obiectivele cu imersie dau o imagine mult mai

luminoasă decât cele uscate fiindcă primesc toate
razele conului de lumină corespunzător unghiului de
deschidere.
în plus puterea de mărire a obiectivelor cu imersie
este superioară celei a obiectivelor uscate,
 de asemenea se pot observa mai bine detaliile de
structură ale obiectelor fiindcă şi rezoluţia
obiectivelor cu imersie este mai bună.
Sistemul cu imersie
 în urma refracţiei şi reflexiei datorită trecerii din
sticlă în aer, o parte din razele de lumină provenite de

la obiectul microscopic (preparat) se pierd, nu pătrund
în obiectiv (razele de tip 1)
 punând pe lamelă de sticlă un fluid cu indice de

refracţie apropiat de cel al sticlei
 de exemplu ulei de cedru (n=1,51) şi coborând
sistemul microscopului până când lentila frontală a
obiectivului se scufundă în ulei
 aceste raze trec aproape nedeviate, intrând în obiectiv,
contribuind astfel la îmbunătăţirea calităţii imaginii.
obiectivele cu imersie sunt obiective speciale, cu

sistem telescopic pentru a realiza mai uşor apropierea
de preparat fără a distruge lamela de sticlă.
puterea de mărire a acestor obiective poate fi de:
40X;60X;80X;100x sau 110x
Aplicaţii medicale importante
 studiul bacteriilor
examinări hematologice
 examinări de citogenetică
Tehnica examinării în imersie

 se plasează preparatul la microscop, utilizând
obiectivul de 4x, se focalizează microscopul pe
câmpul cel mai potrivit care conţine preparatul de
examinat
 se centrează preparatul în câmpul de examinare,
manipulând şuruburile laterale ale microscopului.
 se schimbă obiectivul la 20x şi se

refocalizează cu mai multă fineţe, din nou
se centrează câmpul de examinare
 se roteşte obiectivul la jumătatea distanţei
între 20x şi 40x
 se pune o picătură de ulei de imersie pe lamă, în

centrul câmpului de examinare
 se continuă rotirea revolverului până când cel de
40x ,60x ajunge în picătura de ulei, sub nici o
formă nu trebuie ca obiectivul de 20x sa ajungă în
ulei
 folosind focalizarea de fineţe se refocalizează
imaginea care ne interesează

imediat după ce s-a terminat vizualizarea, se şterge

uleiul de pe lamă şi de pe obiectivul de folosit cu o
hartie speciala, înmuiată în etanol, toluen sau un
substituent de xylol special pentru acest scop.
aproape toţi solvenţii organici, în special xylolul şi

toluenul sunt potenţial periculoşi, sunt inflamabili şi
pot pătrunde in organism prin absorbţie directă la
nivelul pielii sau plămânilor(recomandat manusi)
 expunerea constantă la aceşti solvenţi a fost pusă

în legătură cu afecţiuni hepatice şi chiar se
consideră a fi implicate în carcinogeneză
 astfel este recomandată utilizarea tuturor
solvenţilor cu precauţie şi în spaţii bine ventilate
 odată ce uleiul de cedru este pus pe lamă,
obiectivele de 10x şi de 40x nu vor mai fi folosite
până după îndepărtarea uleiului
Preparat de examinat cu obiectivul cu imersie
Cromatina sexuală (corpusculul Barr)
Tehnica de lucru
se degresează cu alcool sanitar 2 lame de sticlă

curate
 după igienizarea cavităţii bucale prin clătire de
câteva ori cu apă, subiectul deschide gura şi se
raclează cu o spatula mucoasa de pe faţa laterală a
vestibulului bucal, îndepărtând astfel celulele moarte,
detritusurile celulare şi saliva
 se repetă operaţia cu o altă lamă, recoltând celulele din

epiteliul mucoasei bucale
 lama care conţine celulele recoltate se aduce în contact cu
o lamă curată şi printr-o mişcare de glisare de-a lungul
lamei curate se etalează celulele, obţinându-se astfel frotiul
 se lasă lama la uscat câteva minute

1) metanol absolut, 15-30 minute

2) metanol 70%, 5 minute
3) apă distilată, 10 minute
4) fuxină bazică, 15-30 minute
 se clăteşte lama cu apă la robinet pentru
îndepărtarea excesului de colorant, apoi se introduce
în: 5) metanol 70%, 1 minut
6) metanol absolut 1 minut
 în primele două soluţii are loc fixarea

 în a treia rehidratarea
 în a patra colorarea integrală a nucleilor
 iar în ultimele două decolorarea nucleilor
 cu excepţia corpusculului Barr, care are o afinitate
mare pentru colorant, astfel încât rămâne colorat
 se examinează lama la microscop cu obiectivul cu
imersie
De studiat:
 corpusculul Barr are aspectul unui mic triunghi
colorat în violet închis cu baza la periferia
nucleului
 sau poate avea formă semilunară sau de cupolă cu
suprafaţa convexă spre interiorul nucleului, dar
totdeauna tangent la periferia nucleului
 restul nucleului este colorat palid în roz-violet şi
prezintă granule de cromatină
Evidenţierea cromatinei sexuale (săgeţi)

Evidenţierea cromatinei sexuale (săgeţi)

Cromatina – definiție şi clasificare
cromatina este materialul biologic intranuclear care se

colorează cu coloranții bazici
cromatina este deci bazofilă
genele active transcriptibile în ARNm formează zona
eucromatică, pe când cele inactive zona heterocromatică
din punct de vedere al colorabilității cu coloranți
bazici, cromatina se clasifică în două categorii:
 eucromatina (cromatina “adevarată”) care se

colorează mai puțin cu coloranți bazici - este
cromatina necondensată - transcriptibilă
 heterocromatina (“altă” cromatină) care se
colorează foarte intens cu coloranți bazici este
cromatina condensată – netranscriptibilă
Vă mulțumesc!

LP - 2 - Sem 1

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LP - 2 - Sem 1

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Laborator de Biologie Celulară și Moleculară

Disciplina de biologie celulară

Obiectul biologiei celulare

 Biologia celulară și moleculară = este ramura științelor

astfel în anul 1590, a apărut

ÎN CE DOMENII FOLOSIM MICROSCOPUL?

 microscoapele s-au dovedit

“Observarea unor structuri mici”

 Microscopul optic = dispozitiv cu ajutorul

Componentele microscopului optic

Microscopul optic - componente

Modul de formare a imaginii la MO

Performanțele microscopului optic

mărire a obiectivului și cea a ocularului

 40×; 60 ×; 80x ; 100×

Puterea de rezoluție a microscopului optic

 cea mai mică distanţă dintre două puncte la care acestea

FORMULA LUI ABBÉ: d=/ n sinα

n= indicele de refrac ție al mediului dintre preparat și obiectiv

= ½ din apertura unghiulară obiectivului

Puterea de rezoluție a microscopului optic

Limitările puterii de rezoluție a microscopului optic în

  - este o constanta naturală ce nu poate fi

 sin  - apertura unghiulară maximă

Microscopul de-a lungul timpului

Studiul celulelor vii, necolorate

Studiul celulelor vii, necolorate

MICROSCOP CU CONTRAST DE FAZĂ

MICROSCOP TIP NOMARSKI

 pentru examinarea celulelor din flacoane

 înscrisurile de pe partea laterală a ocularelor

 acest revolver poate avea doar un singur orificiu

 10x: înseamnă ca acest obiectiv

 0.25 reprezintă Apertura

apertura numerică a unui obiectiv este o măsură a capacității sale de a

5. Microviza - este un buton mic , rotund pe partea laterală

a microscopului,utilizat pentru a ajusta focalizarea

6. Zonă plană - în conformitate cu obiectivele

 are o gaură centrala în ea ( vezi diagrama) care permite

7. Sursa de lumină: sistem de oglinzi și lumină

8. Diafragma – controlează cantitatea de lumină ce

Lentilele condensor - sunt o componentă esențială a

 condensorul este alcătuit din mai multe lentile

UTILIZAREA MICROSCOPULUI OPTIC

Pașii următori sunt necesari a fi utilizați de fiecare data

4. Utilizați butonul macroviză pentru a muta

5. Puneți un preparat pe suportul de lamă.

6. Se ridică suportul de lama pe verticală utilizând

10. Selectați o zonă de pe proba pe care doriți să o

Rotiți port-obiectivul rotativ și schimbați obiectivele

11. Când ați terminat observațiile dumneavoastră la

partea cea mai importantă a unui microscop

obiectivul este format din mai multe lentile montate

 puterea de mărire a ei este în raport direct cu mărimea

 puterea de mărire a unui obiectiv este cu atât mai mare cu

între obiect şi lentila frontală trebuie să rămână

 în cazul obiectivelor cu imersie, dacă se introduce

deci obiectivele cu imersie dau o imagine mult mai

 în urma refracţiei şi reflexiei datorită trecerii din

sticlă în aer, o parte din razele de lumină provenite de

 punând pe lamelă de sticlă un fluid cu indice de

obiectivele cu imersie sunt obiective speciale, cu

Aplicaţii medicale importante