C Ă T Ă L I N A G H E O R G H I E S E I

TEHNICI
MICROSCOPICE
U T I L I Z AT E
Î N C R I M I N A L I S T I C Ă

LAT E X
 Cuprins

1 Introducere 7
1.1 Obiective generale 7
1.2 Cont, inutul cursului 8
1.3 Scurt istoric 8

2 Formarea imaginilor 11
2.1 Obiectul imaginea sa 11
2.2 Principiile opticii geometrice 12
2.3 Reflexia s, i refract, ia 14
2.4 Sisteme de mărire 15

3 Microscoape utilizate în criminalistică 23

3.1 Microscopul compus 24
3.2 Microscop stereoscopic 28
3.3 Microscopul de comparat, ie 28
3.4 Microscop cu lumină polarizată 28

4 Caracterizarea imaginilor obt, inute prin instrumente optice 31

4.1 Absorbt, ia 32
4.2 Reflexia, refract, ia s, i dispersia 33
4.3 Teoria lui Abbe de formare a imaginilor 33

Glosar 43
Listă de figuri

2.1 Sistemul optic delimitează spat, iul obiect de spat, iul imagine 11
2.2 Tipuri de fascicule de lumină. 13
2.3 Drumul optic 13
2.4 Spectrul luminii vizibile 14
2.5 Reflexia s, i refract, ia luminii 14
2.6 Elementele dioptrului sferic: [AOP] axa optică principală; [AOS] axa
optică secundară; [O] centrul dioptrului sferic; [V] vârful dioptrului
sferic; [R] – raza dioptrului sferic; [n1 , n2 ] indici de refract, ie pentru
mediile separate de suprafat, a dioptrului sferic 14
2.7 Lentile convexe 15
2.8 Lentile concave 15
2.9 Principalele mărimi caracteristice lentilelor 15
2.10 Mersul razelor de lumină prin lentile. 16
2.11 Lentilă convergentă, obiect situat la distant, ă mai mare decât distant, a
focală. 17
2.12 Lentilă convergentă, obiect situat în focarul obiect. 17
2.13 Lentilă convergentă, obiect situat la distant, ă mai mică decât distant, a
focală 17
2.14 Lentilă divergentă. 17
2.15 Convent, ii de semn pentru dioptrul sferic. 18
2.16 Formulele lentilelor. 19
2.17 Formarea imaginii printr-o lupă 20
2.18 Formarea imaginii printr-un microscop optic. 21

3.1 Evolut, ia istorică a microscopului 23

3.2 Imagini ale găuncioarelor de polen de Floarea-Soarelui cu măriri de 40x,
100x s, i 400x. 25
3.3 Componentele microscopului compus 25
3.4 Mersul razelor de lumină prin microscopul compus. 27
3.5 Microscop drept. 27
3.6 Microscop inversat. 27
3.7 Microscop stereoscopic. 28
3.8 Microscop de comparat, ie. 29
3.9 Microscop cu lumină polarizată. 29
3.10 Analizorul (stânga) s, i polarizorul (2 imagini dreapta) componente ale
microscopului cu lumina polarizată. 29
3.11 Fibre vegetale colorate observate în lumină nepolarizată (stânga) respec-
tiv polarizată (dreapta). 30
3.12 Imaginea unei fibre de poliester în lumină liniar polarizată. 30
6

3.13 Imaginea unei fibre de poliester în lumină eliptic polarizată. 30

3.14 Birefringent, a cristalului de calcit. 30

4.1 Mediu transparent s, i filtru ros, u. 32

4.2 Combinat, ii datorate absorbt, iei din spectrul luminii albe. 32
4.3 Imagini obt, inute pentru obiecte colorate diferit când sunt iluminate cu
radiat, ii de culori diferite. 32
4.4 Devierea controlată a radiat, iilor prin utilizarea uleiului de imersie. 33
4.5 Dispersia prin prisma optică. 33
4.6 Interferent, a undelor stat, ionare 34
4.7 Interferent, a în dispozitivul Young. 34
4.8 Difract, ia printr-o diafragmă circulară. 35
4.9 Legătura dintre discul Airy s, i rezolut, ia optică. 35
4.10 Apertura numerică a unui obiectiv. 35
4.11 Legătura dintre discul Airy s, i apertura numerică. 36
4.12 Determinarea rezolut, iei spat, iale optime pentru sistemul optic format din
obiectiv s, i condensor. 37
4.13 Contrastul/culoarea. 38
4.14 Compararea tehnicilor de iluminare prin transmisie utilizate pentru a
genera contrast într-un es, antion de hârtie. 38
4.15 Comparat, ie iluminare în câmp întunecat s, i în câmp luminos. 39
4.16 Detalii obt, inute în câmp întunecat. 39
 1 Introducere

Acest material este destinat tuturor celor interesat, i de Tehnicile microsco-

pice utilizate în criminalistică s, i reprezintă o compilat, ie de texte prezentate
în cursul cu acelas, i nume prezentat în cadrul masterului de criminalistică
organizat la Universitatea «Alexandru Ioan Cuza» din Ias, i1 . 1
www.uaic.ro
Cititorii interesat, i de aprofundarea s, i studiul avansat a tehnicilor micro-
scopice pot consulta bibliografia prezentată la sfârs, itul materialului. Trebuie
precizat însă că aici ne vom ocupa mai mult de principiile de microscopie fără
a insista asupra unor cazuri specifice muncii expert, ilor criminalis, ti.

1.1 Obiective generale

Acest curs îs, i propune să pregătească cursant, ii pentru:

• înt, elegerea s, i aplicarea cunos, tint, elor privind conceptele de analiză prin
metodele oferite de tehnicile de microscopie optică, electronică, precum s, i
alte tehnici noi de analiză microscopică a suprafet, elor;

• să cunoască s, i sa aplice cunos, tint, ele privind modul de pregătire a probelor
conform protocoalelor standard de analiză în criminalistică, prin metodele
oferite de tehnicile de microscopie;

• să-s, i însus, ească s, i sa aplice cunos, tint, ele privind analiza comparativă s, i
analiza mezofazică a unor es, antioane, simulatoare de caz, în special prin
tehnicile de microscopie optică s, i electronică;

• să aibă capabilitatea de a căuta, prelucra s, i analiza informat, ii dintr-o varie-

tate de surse bibliografice s, i să întocmească un raport de cercetare (consta-
tare);

• să aibă idei noi privind protocoalelor experimentale de analiză;

• să posede abilitatea de a lucra în echipă pentru a rezolva probleme experi-

mentale s, i tehnologice;

• să aibă capabilitatea să formuleze critici cu privire la stadiul actual din
domeniu s, i aceea de a întrevedea direct, ii noi de cercetare;

• să init, ieze s, i să administreze cu succes proiecte personale s, i de grup;

• să aibă determinare s, i perseverent, ă în realizarea sarcinilor primite s, i a

responsabilităt, ilor asumate.
8 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

1.2 Cont, inutul cursului

Acest curs este structurat astfel:

• Introducere: Scurt istoric al microscopiei optice; Începuturile folosirii

metodelor optice de analiza în Criminalistică.

• Principii fundamentale în Optică: Proprietăt, ile fizice ale luminii; Elemente

de optică geometrică; Formarea de imagini prin lentile.

• Bazele Microscopiei Optice: Componentele principale ale unui microscop

optic; Obiective; Caracteristici (notaţii); Clasificare.

• Principii de funct, ionare: Iluminare Koehler; Teoria lui Abbe de formare a

imaginii; Rezolut, ie - criteriul Rayleigh; Drum optic; Dinamica formării
imaginii.

• Microscopie în lumină albă (câmp luminos): Microscopul de comparat, ie;

Microscopul stereoscopic; Microscopie în câmp întunecat;

• Microscopie în lumină polarizată: Proprietăt, ile luminii polarizate; Micro-

scopie în contrast de fază; Microscopie în contrast diferent, ial de interferenţă;
Microscopie de fluorescent, ă integrală; Microscopie confocală;

• Posibilităt, i de utilizare în analiza Criminalistică (analize de caz).

1.3 Scurt istoric

Microscopul este simbolul universal al s, tiint, ei prin reprezentarea abilităt, ii

de a explora lumea dincolo de percept, iile bazate pe simt, uri.
Microscopul optic: Instrument optic folosit pentru observarea obiectelor
mici mărite de circa 2000 de ori s, i se pot distinge detalii de ordinul miimilor
de milimetru. Puterea de mărire microscopului depinde de tipul respectiv, cea
mai mare fiind a microscopului electronic.
Microscopul a fost inventat în 1590 de către Zacharias Janssen (Olanda)
dar se pare că existau astfel de instrumente optice mai vechi, denumirea de
microscop a fost dată în 1624 de Johann Faber (sau Giovanni Faber) naturalist
(doctor) papal.
Microscopul electronic instrument analog microscopului optic, în care rolul
razelor de lumină este îndeplinit de un fascicul de electroni care traversează
mai multe lentile electronice; poate mări imaginea obiectelor până la un milion
de ori, permit, ând distingerea detaliilor de ordinul ångströmilor (10−10 m).
Microscopia este tehnica care foloses, te microscopul ca principal instrument
s, i care descrie modul în care se obt, in imaginile obiectelor foarte mici. Micro-
scopia descrie relat, ia între obiect s, i imaginea sa prin sistemul optic/electronic
al microscopului. Presupune folosirea unor procedee specifice domeniului de
aplicabilitate (în acest caz în criminalistică).
Microscopul în criminalistică este utilizat pentru analiza probelor în/de tip:

• Artă, Analiză fotografică, Amprente

• Benzi, Chimie, Droguri

• Gloant, e, Hârtie, Înscrisuri

 introducere 9

• Fibre, Fire de păr,

• Lemn, Materiale de construct, ie, Minerale

• Polen, Polimeri, Praf

• Sticlă, Sol, Ser, Urme de unelte

2 Formarea imaginilor

Formarea imaginilor printr-un instrument optic (implicit printr-un micro-

scop) se datorează propagării luminii prin componentele optice ale instru-
mentului (oglinzi, prisme, lentile etc.). Analiza imaginilor obt, inute prin
instrumentele optice se va face as, adar plecând de la principiile s, i legile de pro-
pagare a luminii prin componentele optice (studiate de optică) dar va depinde
s, i de as, ezarea geometrică a acestor componente (de geometrie). Ne aflăm
astfel in cadrul opticii geometrice: studiază propagarea luminii prin diferite
medii sau prin suprafet, ele de separare ale acestora, fără a lua în considerare
natura ondulatorie sau corpusculară a luminii.
Obiectele formează imagini prin intermediul instrumentelor optice. În
optica geometrică vom găsi relat, ii care leagă obiectul de imaginea sa (v.
Figura 2.1).

Figura 2.1: Sistemul optic delimitează

direcția de propagare a luminii spat, iul obiect de spat, iul imagine

Sistem optic S
pa
ct
ie

țiu
ob

im
iu

ag
aț

in
Sp

2.1 Obiectul imaginea sa

Obiecte optice sunt considerate orice obiecte, vizibile sau nu cu ochiul

liber, care formează imagini prin intermediul sistemelor optice. În optică
aceste obiecte sunt considerate a fi formate din puncte geometrice.
O clasificare simplă privind obiectele optice presupune că acestea sunt
considerate:

• obiecte luminoase – surse directe de lumină;

• obiecte neluminoase – vizibile în prezent, a obiectelor luminoase

Un obiect luminos sau neluminos este vizibil doar dacă este o diferent, ă de
strălucire sau culoare între acesta s, i mediul care îl înconjoară. Diferent, a de
strălucire sau culoare între punctele unei imagini formate de un obiect pe
retină este cunoscută sub numele de contrast.
12 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

Imaginea obt, inută privind prin microscop, fotografie, film sau televiziune
trebuie să fie o reprezentare fidelă punct cu punct a obiectului (referitor în
primul rând la strălucire, culoare etc.). Ochiul uman percepe doar strălucirea
s, i culoarea, creierul interpretează strălucirea relativă s, i culorile punctelor de
lumină de pe retină s, i face o judecată ca fiind mărimea, forma, localizarea s, i
pozit, ia obiectului real. Ceea ce vedem nu este o reprezentare perfectă a lumii
fizice deoarece:

• ochiul nu e perfect

• văzul este limitat de factori fizici (obiecte îndepărtate/apropiate, întune-

cate/strălucitoare, nu emit în vizibil

• factori psihologici (se poate păcăli us, or simt, ul văzului)

Apar o mult, ime de întrebări privind informat, iile pe care le primim prin
intermediul imaginilor:

1. Cum obt, inem (primim) informat, iile corecte despre mediul înconjurător?

2. Care este natura s, i validitatea informat, iei?

3. Care este relat, ia între percept, ia noastră s, i lumea reală?

4. Care este natura s, i validitatea informat, iilor obt, inute cu ajutorul instrumen-
telor care extind limitele simt, urilor?

Pentru a putea răspunde trebuiesc definite o serie de principii s, i demonstrate

o serie de legi legate de formarea imaginilor prin instrumentele optice. S-
au dezvoltat teorii despre sursele, propagarea s, i percept, ia luminii. O teorie
interesantă dar care s-a extins în istorie a fost dezvoltată de Aristotel, Euclid
în Grecia antică s, i a dăinuit până la Isaac Newton în Renas, tere: ”Lumina
izvorăs, te din ochi s, i pipăie obiectele din jur.”.

2.2 Principiile opticii geometrice

Pentru studiul formării imaginilor printr-un microscop vom da câteva

definit, ii:

Definit, ie 2.1. Fasciculul de lumină ca fiind o port, iune din spat, iu mărginit prin
care lumina se propagă;.

Definit, ie 2.2. Raza de lumină poate fi definită ca fiind un fascicul paralel de

lumină de grosime aproape nulă (foarte subt, ire);

În optica geometrică fasciculele de lumină (raze de lumină) sunt clasificate

în:

• Fascicule de raze omocentrice (au un punct comun): convergente sau

divergente;

• Fascicule de raze paralele: razele de lumină nu se intersectează

Pricipiu 2.1. Principiul propagării rectilinii a luminii: într-un mediu omogen

s, i izotrop lumina se propagă în linie dreaptă până la întâlnirea unui obstacol
sau a unui alt mediu.
 formarea imaginilor 13

Figura 2.2: Tipuri de fascicule de lumină. Fascicul Fascicul Fascicul

omocentric omocentric
convergent paralel
divergent

Pricipiu 2.2. Principiul independent, ei propagării razelor luminoase: razele lu-

minoase necoerente care se întâlnesc într-un punct nu se influent, ează reciproc,
păstrându-s, i fiecare direct, ia init, ială de propagare.

Pricipiu 2.3. Principiul reversibilităt, ii drumului razelor: O rază de lumină

care parcurge un sistem optic într-un sens, va parcurge sistemul pe acelas, i
drum optic dacă este dirijată în sens invers.

Pricipiu 2.4. Principiul lui Fermat: Drumul optic parcurs de o rază luminoasă
între două puncte este un extremum în raport cu oricare alt drum posibil între
acele puncte. Acest extrem este de obicei un minim.

Pricipiu 2.5. Teorema Malus–Dupin: Dacă din mediul obiect (aflat înaintea
sistemului optic) pornes, te un fascicul de raze normale la suprafat, a echifază
Σ, după parcurgerea sistemului optic (prin reflexii s, i refract, ii), razele din
fasciculul emergent sunt normale la suprafat, a echifază imagine Σ0 . Drumurile
optice pentru fiecare rază dintre cele două suprafet, e echifază sunt egale.

Într-un mediu omogen s, i izotrop viteza de propagare a luminii este constată

s, i se poate defini:

Definit, ie 2.3. Indicele de refract, ie n

c0
(2.1) n=
c
unde c0 este viteza luminii în vid

(2.2) c0 ≈ 3 × 108 m/s = 300000km/s

iar c este viteza de propagare a luminii în acel mediu.

Indicele de refract, ie este supraunitar n > 1.

Definit, ie 2.4. Drumul optic, se notează cu ( L), este produsul dintre indicele
de refract, ie n s, i lungimea geometrică a drumului parcurs de raza luminoasă
L0
drum optic (L)=nL0
(2.3) ( L ) = n × L0 n
Indicele de refract, ie a unui mediu de propagare depinde de:
L0
Figura 2.3: Drumul optic
• Temperatură

• Lungimea de undă a radiat, iei luminoase (notată cu λ)

• Undele luminoase din domeniul vizibil au lungimi de undă cuprinse între

380nm (violet) s, i 700nm (ros, u)(v. Figura 2.4).
14 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

Figura 2.4: Spectrul luminii vizibile

2.3 Reflexia s, i refract, ia

2.3.1 Reflexia luminii

Definit, ie 2.5. Reflexia luminii este fenomenul de întoarcere (part, ială) a undei
(razei) luminoase în mediul din care provine când întâlnes, te suprafat, a de
separare dintre două medii optice diferite. (Figura 2.5)

Legile reflexiei:

Legea 2.1. Raza incidentă, raza reflectată s, i normala în punctul de incident, ă

la suprafat, a de separare dintre cele două medii se află în acelas, i plan.

Legea 2.2. Unghiul de incident, ă (i1 ) este egal cu unghiul de reflexie (i10 )

(2.4) i1 = i10

2.3.2 Refract, ia luminii

Definit, ie 2.6. Refracţia luminii este fenomenul de schimbare a direct, iei de
propagare a luminii la întâlnirea suprafet, ei de separare dintre două medii
optice diferite, prin pătrunderea luminii în mediul respectiv. (Figura 2.5)

Legile refract, iei:

normala

Legea 2.3. Raza incidentă, raza refractată s, i normala în punctul de incident, ă

ra la suprafat, a de separare dintre cele două medii se află în acelas, i plan.
za
inc
ide
nt Legea 2.4. Legea Snellius-Descartes:
ă
n1 i1 i1
(2.5) n1 sin i1 = n2 sin i2
n2
raza

Observat, ii:
i2
refra

• Suprafat, a de separat, ie dintre două medii transparente cu indici de refract, ie

c

diferit, i se numes, te dioptru (v. Figura 2.6)

tată

• Dacă suprafat, a de separat, ie este sferică atunci dioptrul este numit dioptru
Figura 2.5: Reflexia s, i refract, ia luminii sferic; dacă suprafat, a este plană atunci dioptrul este numit dioptru plan;

• Dioptrul sferic se caracterizează prin următoarele elemente:

– Vârful dioptrului V (polul calotei sferice)

– Centrul de curbură O este centrul sferei din care face parte suprafat, a
sferică
AO – Axa optică principală: dreapta VO care trece prin vârf s, i centru
S
n1 – Axa optică secundară: orice dreaptă care trece prin centrul optic
R n2

AOP • Reflexia s, i refract, ia sunt fenomenele care stau la baza construct, iei instru-
V O
mentelor optice: oglinzi, prisme optice, lentile, obiective, oculare, micro-
scoape, lunete etc.
Figura 2.6: Elementele dioptrului sferic:
[AOP] axa optică principală; [AOS] axa
optică secundară; [O] centrul dioptrului
sferic; [V] vârful dioptrului sferic; [R]
– raza dioptrului sferic; [n1 , n2 ] indici
de refract, ie pentru mediile separate de
suprafat, a dioptrului sferic
 formarea imaginilor 15

2.4 Sisteme de mărire

Pentru a putea observa mai multe detalii a unui obiect (fie obiect microsco-
pic, fie obiect foarte îndepărtat) trebuie utilizat un sistem optic de mărire.
Sistemele optice de mărire pot fi clasificate în:

• sisteme simple: oglindă, proiector, lupă

• sisteme compuse: microscop, lunetă

Sistemele de mărire compuse cont, in o serie de sisteme simple: de regulă mai

multe lentile, diafragme, oglinzi etc.

Definit, ie 2.7. Lentilele sunt sisteme optice transparente formate prin alăturarea
a doi dioptri.

După diversele tipuri de dioptri alăturat, i lentilele sunt caracterizate astfel:

• lentile biconvexe (a), plan-convexe (b) s, i menisc convex (c);

• lentile biconcave (d), plan-concave (e) s, i menisc concav (f); a b c d

Figura 2.7: Lentile convexe

f1<0
obiect

F2
imagine

O
{

F1 f2>0 a b c d e f
Figura 2.8: Lentile concave
x1<0 x2>0

f2<0
obiect

{ imagine

F1
F2 O
{

f1>0

Figura 2.9: Principalele mărimi caracteris-

tice lentilelor
Principale caracteristici ale lentilelor subt, iri:

• Centrul optic al lentilei O;

• Focarul imagine F2 s, i focarul obiect F1 ;

• Distant, a focală obiect: f 1 = F1 O;

• distant, a focală imagine f 2 = F2 O;

2.4.1 Imagini prin lentile

Pentru a construi imaginile obiectelor prin lentile t, inem cont de câteva
considerente geometrice ce provin din aproximat, ia paraxială a razelor de
lumină s, i din legile de propagare a razelor de lumină prin sistemele optice. În
aproximat, ia paraxială razele de lumină care formează imaginile se propagă
foarte aproape de axa optică a sistemului (formează unghiuri mici cu axa
optică < 5o ).
16 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

O imagine a unui obiect este considerată imagine clară dacă fiecărui punct
de pe obiect îi corespunde un punct imagine s, i numai unul. Punctele imagine
se vor forma la intersect, ia a cel put, in 2 raze luminoase (sau la prelungirea
acestora)
Pentru construct, ia geometrică a imaginilor prin lentile considerăm propa-
garea următoarelor raze luminoase:

• Orice rază paralelă cu axa optică principală după lentilă va trece prin focarul
imagine (raza sau prelungirea ei)

• Orice rază luminoasă care trece prin focarul obiect după lentilă va deveni
paralelă cu axa optică;

• Orice rază care trece prin centrul lentilei se va propaga fără a fi deviată
obiect

obiect
F2 F2
imagine

imagine
O O
F1 F1
obiect

obiect
imagine

imagine

F1 F1
F2 O F2 O
obiect

F2
imagine

O
F1
obiect

imagine

F1
F2 O

Figura 2.10: Mersul raze-

lor de lumină prin lentile.
 formarea imaginilor 17

2.4.2 Construct, ia imaginilor prin lentila convergentă

Dacă obiectul este situat fat, ă de lentilă la o distant, ă mai mare decât distant, a
focală obiect (v. Figura 2.11) atunci imaginea va fi:

• reală (poate fi proiectată pe un ecran);

• răsturnată;
O F2
F1
• mai mică sau mai mare decât obiectul

Dacă obiectul este situat în focarul obiect (v. Figura 2.12) atunci imaginea
Figura 2.11: Lentilă conver-
va fi: gentă, obiect situat la distant, ă
mai mare decât distant, a focală.
• reală dar nelocalizată (se formează la infinit);

• răsturnată;
O F2
• egală ca mărime cu obiectul F1

Dacă obiectul este situat fat, ă de lentilă la o distant, ă mai mică decât distant, a
focală obiect (v. Figura 2.13) atunci imaginea va fi:
Figura 2.12: Lentilă convergentă,
obiect situat în focarul obiect.
• virtuală (nu poate fi proiectată pe un ecran);

• dreaptă;
O F2
• mai mare decât obiectul (în acest caz lentila este denumită lupă)
F1

2.4.3 Construct, ia imaginilor prin lentila divergentă Figura 2.13: Lentilă conver-
gentă, obiect situat la distant, ă
Indiferent dacă obiectul este situat fat, ă de lentilă la o distant, ă mai mică sau mai mică decât distant, a focală
mai mare decât distant, a focală obiect (v. Figura 2.14) atunci imaginea va fi:

• virtuală (nu poate fi proiectată pe un ecran);

• dreaptă;

• mai mică decât obiectul. O F1

F2

2.4.4 Complemente matematice

Figura 2.14: Lentilă divergentă.
Definit, ie 2.8. Stigmatismul este proprietatea unui sistem optic de a forma
pentru fiecare punct al unui obiect o imagine care este tot un punct s, i numai
unul.

Altfel spus sistemele optice care formează imagini clare sunt sisteme care
au proprietatea de sigmatism.
În cele ce urmează vom considera sistemele optice prezentate anterior
(dioptrul sferic, lentile) ca fiind sisteme stigmatice. O condit, ie pentru a asigura
stigmatismul este ca razele de lumină să fie paraxiale, adică să fie „aproape”
paralele cu axa optică: fac unghiuri mici cu axa optică (mai mici decât 5o )
Convent, ii de semn:

• Toate distant, ele până la punctele obiect s, i imagine vor fi măsurate fat, ă de
vârful V al dioptrului sau fat, ă de centrul lentilei. Se consideră distant, e po-
zitive dacă măsurătoarea se face în sensul propagării radiat, iilor s, i negative
dacă măsurătoarea se face în sens opus propagării razei de lumină;
18 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

• unghiurile se vor măsura fat, ă de axa optică s, i vor fi considerate pozitive

dacă raza „se rotes, te” spre axa optică în sens trigonometric (antiorar) s, i
negativ dacă „rotat, ia” se face în sens antitrigonometric (orar)

Figura 2.15: Convent, ii de

semn pentru dioptrul sferic. n1

+y1 R n2
-1 2
AOP
V O
-y2

-x1 +x2

2.4.5 Formule dioptru

Legea 2.5. Prima relat, ie (sau relat, ia punctelor conjugate)
n2 n n − n1
(2.6) − 1 = 2
x2 x1 R
Legea 2.6. A doua relat, ie (mărirea liniară transversală)
y2 x n
(2.7) β= = 2· 1
y1 x1 n2

Pentru a afla pozit, ia focarului imagine: în relat, ia (2.6) se consideră că

o rază provine de la un obiect as, ezat la infinit (raza va fi paralelă cu axa
optică principală) s, i după ce trece prin dioptru va ajunge în focar (matematic
x1 → −∞ s, i x2 = f 2 ):

n2 R
(2.8) f2 =
n2 − n1
Analog pentru pozit, ia focarului obiect: în relat, ia (2.6) se consideră că o
rază provine de la un obiect as, ezat în focarul obiect ce trece prin dioptru va
ajunge paralelă cu axa optică principală (matematic x2 → −∞ s, i x1 = f 1 ):

n1 R
(2.9) f1 = −
n2 − n1
încât formula punctelor conjugate (2.6) se poate rescrie

f2 f
(2.10) + 1 =1
x2 x1

2.4.6 Formule lentile

Legea 2.7. Formula fundamentală a lentilelor subt, iri:
 
1 1 1 1
(2.11) − = ( n − 1) −
x2 x1 R1 R2

Legea 2.8. Formula măririi liniare transversale pentru lentile:

y2 x
(2.12) β= = 2
y1 x1
 formarea imaginilor 19

Figura 2.16: Formulele lentilelor.

f1<0
obiect

{
F2

imagine
O

{
F1 f2>0
x1<0 x2>0

Focarul imagine a lentilei subt, iri:

1
(2.13) f2 =   = f
1 1
( n − 1) R1 − R2

Focarul obiect:
1
(2.14) f1 = −   = −f
1 1
( n − 1) R1 − R2

Definim convergent, a unei lentile:

1
(2.15) C=
f

2.4.7 Caracteristici instrumente optice

Mărirea liniară transversală: raportul dintre mărimea imaginii y2 s, i mărimea
obiectului y1
y2
(2.16) β=
y1

Puterea: raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede prin instrument
un obiect α2 s, i mărimea obiectului y2

tan α2
(2.17) P=
y2

Grosismentul determină mărirea unghiulară a instrumentului optic s, i este

definit ca fiind raportul între tangentele unghiurilor sub care se vede obiectul
prin instrument α2 s, i fără instrument α1 :
tan α2
(2.18) G=
tan α1

Puterea separatoare reprezintă capacitatea de a forma imagini distincte a

două puncte vecine s, i poate fi definită prin:

• distant, a minimă între două puncte ce formează puncte distincte prin in-
strumentul optic (pe imagine se disting 2 puncte) – putere separatoare
liniară;

• unghiul minim între 2 raze de lumină care formează prin instrumentul optic
imagini distincte – putere separatoare unghiulară
20 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

Pentru instrumentele optice la care imaginea este privită cu ochiul liber

o mărime importantă este distant, a optimă de citire notată cu δ care pentru
ochiul normal (emetrop) este δ = 0, 25m = 25cm s, i este distant, a între ochi
s, i punctul proxim. Pentru toate obiectele situate la distant, ă mai mare decât
acest punct ochiul necesită acomodare până la aproximativ 6m unde se află
punctul „remotum”. Ochiul normal nu poate forma imagini clare dacă obiectul
observat este situat la mai put, in de 25cm de ochi. Trebuie remarcat aici faptul
că această distant, ă depinde de la subiect la subiect s, i mai mult tinerii pot
focaliza la distant, e mai mici de până la 125mm (de aproximativ 2x mai mică)
încât aces, tia practic măresc cu ajutorul ochiului de 2x fat, ă de adult, i deoarece
imaginea acoperă o mai mare parte a retinei.

2.4.8 Lupa
Lupa este un instrument optic simplu convergent alcătuit dintr-o lentilă
sau un grup de lentile care au o distant, ă focală de ordinul centimetrilor.

Figura 2.17: Formarea

imaginii printr-o lupă

y2
y1 2 O F2
F1 x1 M
a


Obiectul care formează imaginea prin lupă este as, ezat între focarul obiect F1
s, i lentilă (v. Figura 2.17). Imaginea va fi virtuală, dreaptă s, i mai mare decât
obiectul. Pentru observarea imaginii ochiul este plasat în imediata apropiere a
lentilei (punctul M) la o distant, a a de lentilă s, i la δ = 25cm distant, a optimă
de observare. De obicei obiectul este situat cât mai aproape de focarul F1
astfel încât x1 ≈ f . Prin urmare puterea lupei va fi:
tan α2 y /x 1 1
(2.19) P= = 1 1 = ≈
y2 y1 x1 f

În concluzie: puterea lupei este egală cu convergent, a ei. As, adar pentru a
realiza o lupă cu putere cât mai mare va trebui să se utilizeze o lentilă (sau un
grup de lentile) cu convergent, ă cât mai mare. Acest lucru presupune utilizarea
unor lentile a căror dioptri au raze de curbură mici ceea ce mics, orează mult
suprafat, a lentilei. Drept consecint, ă puterea optică a lupelor nu depăs, es, te 100
de dioptrii iar puterea separatoare este de aproximativ 3µm = 3 × 10−6 m.
Pentru observarea obiectelor cu dimensiuni mai mici trebuie utilizat un alt
sistem de mărire: microscopul optic.

2.4.9 Microscopul optic

Microscopul optic cont, ine 2 părt, i optice numite obiectiv s, i ocular (v. Fi-
gura 2.18). Obiectivul este partea optică cea mai apropiată de obiect s, i for-
 formarea imaginilor 21

mează imagine reală, răsturnată s, i mai mare decât obiectul în spat, iul dintre
obiectiv s, i ocular (imaginea A0 B0 ). Această imagine are rol de obiect pentru
lentila ocular care se comportă ca o lupă formând în final imaginea virtuală,
răsturnată mai mare decât obiectul (imaginea A00 B00 ). Imaginea formată

Figura 2.18: Formarea imaginii printr-un

microscop optic.

prin microscop des, i mărită se află situată destul de departe fat, ă de ocular (Oc)
încât ochiul (practic lipit de ocular) va privi această imagine neacomodat.
Astfel razele de lumină emergente sunt aproape paralele iar raza B00 F20 va face
cu axa optică a sistemului unghiul α2 aproximativ egal cu unghiul format
de raza B00 O cu axa optică. As, adar tan α2 ≈ y10 / f 2 iar puterea optică a
microscopului va fi:

tan α2 y0
(2.20) P= ≈ 1
y1 y1 f 2

s, i cum imaginea y10 se formează foarte aproape de focarul F2 ca s, i în cazul

lupei practic F10 A0 ≈ e cu e distant, a dintre cele două focare F10 s, i F2 . Distant, a
e se numes, te interval optic s, i pentru unele microscoape este stabilită de către
utilizator prin operat, ia de „punere la punct” a microscopului (se deplasează
ocularul sau obiectivul până când se observă clar imaginea mărită a obiectului).
Astfel puterea optică a microscopului va deveni:
e
(2.21) P≈
f1 f2

În concluzie puterea optică a microscopului este cu atât mai mare cu cât

este mai mare intervalul optic sau convergent, a obiectivului 1/ f 1 respectiv a
ocularului 1/ f 2 .
Grosismentul microscopului definit de relat, ia (2.18) este:

tan α2 y0 δ P
(2.22) G= = 1· ≈
tan α1 f 2 y1 4

unde am t, inut cont că pentru un ochi normal delta = 0, 25m = 1/4m. În
practică microscoapele au mai multe obiective s, i oculare care se pot combina
pentru a se obt, ine puteri diferite.
3 Microscoape utilizate în criminalistică

Primele metode de examinare a probelor fizice, în laboratoarele de crimi-

nalistică, s-au bazat aproape exclusiv pe microscopie pentru a studia structura
s, i funct, iile materiei. Microscoapele utilizate în criminalistică nu diferă cu
nimic fat, ă de aparatele utilizate în cercetare. Diferent, a constă în protocolul
utilizat pentru prelevarea probei, obt, inerea imaginii pe microscop s, i eventual
fotografierea sau înregistrarea video a imaginilor.
Primele microscoape utilizate constau doar în alăturarea celor două lentile
convexe s, i fixarea lor la distant, ă corespunzătoare într-un tub analog cu cel utili-
zat pentru lunete. Mai apoi au fost realizate monturi fixe s, i s-au adăugat sursele
de lumină, diafragmele, filtrele, polarizorii s, i aparatul fotografic. Pe măsură
ce tehnica s-a dezvoltat s-a ajuns la utilizarea microscoapelor electronice cu

Istoricul microscopiei optice

baleiaj (v. Figura 3.1).

Figura13
3.1: Evolut, ia istorică a microscopu-
lui
O listă a diferitelor tipuri de microscoape este prezentată mai jos:

• Microscop optic compus

• Microscop optic stereoscopic

• Microscop de comparat, ie

• Microscop în lumină polarizată

• Microscop în fluorescent, ă
24 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

• Microscop electronic de baleaj (SEM & TEM)

• Microspectrofotometru

Pentru a alege tehnica de microscopie convenabilă pentru analiza criminalistică

trebuie să răspundem la următoarele întrebări:

1. Ce tip de probă urmează să fie studiată?

2. De ce mărire este nevoie?

3. Dorit, i să pregătit, i proba în as, a fel ca rezultatul sa conducă la evident, ierea
anumitor aspecte (detalii)?

1. Ce tip de probă urmează să fie studiată?

Probe diferite au proprietăţi fizice diferite – intent, ia este să se observe aproape
orice cu ajutorul microscopului! De exemplu: sângele este structural foarte
diferit fat, ă de un diamant al unui inel s, i prin urmare diferă tehnica de con-
trast folosită pentru observare. As, adar cerint, ele unui microbiolog pentru un
microscop vor fi foarte diferite fat, ă de cele ale unui producător de bijuterii!
2. De ce mărire este nevoie?
Celulele ros, ii din sânge au 6-8µm în diametru  o dimensiune mică! Vet, i
avea nevoie de o mărire de minimum 400x pentru a vedea celule ros, ii din
sânge, dar dacă doriţi să vizualizat, i celulele ros, ii în detaliu, atunci veţi avea
nevoie de o mărire mai mare. În plus, proba de sânge va trebui să fie pregătită
pe o lamelă de sticlă, astfel încât să poată fi văzute detaliile pe care le dorit, i.
Un inel cu diamant are aproximativ 1,5 cm în dimensiune s, i poate fi văzut cu
ochiul liber. Un producător de bijuterii, poate vedea toate detaliile complicate
ale inelului cu o mărire de 10x-–20x.
3. Dorit, i sa pregătit, i proba în as, a fel ca să fie evident, iate anumite aspecte?
Când se as, ează un diamant într-un inel, bijutierul trebuie să plaseze cu grijă
piatra pret, ioasă. Pentru aceasta este nevoie de vedere 3D deoarece acest lucru
oferă percept, ia adâncimii, care ajută la coordonarea mână-ochi.
Des, i celulele ros, ii din sânge sunt prea mici, se dores, te observarea diferitelor
aspecte. Acest lucru ar putea implica modalităt, i diferite de pregătire a probei
de sânge s, i/sau tehnici diferite de iluminare: câmp întunecat sau iluminare în
contrast de fază.

3.1 Microscopul compus

Microscoapele simple au doar un singur set de lentile în timp ce microsco-

pul compus posedă sisteme de lentile grupate în obiectiv s, i ocular. Mărirea
maximă va fi dată de produsul măririlor corespunzătoare celor doua compo-
nente. microscopul compus are o mărire uzuală cuprinsă între 40x s, i 450x
dar s-a obt, inut valoarea maximă record de 1000x (în practică mărirea maximă
fiind 650-700x în funct, ie de ocularele s, i obiectivele utilizate). În Figura 3.2
sunt prezentate imagini ale găuncioarelor de polen de Floarea-Soarelui cu
măriri de 40x, 100x s, i 400x.
Componentele microscopului compus sunt prezentate în Figura 3.3 pentru
cazul în care se foloses, te un singur ocular (microscopul se va numi monocular)
dar nu diferă cu nimic de cazul utilizării a două oculare când aceeas, i imagine
este privită prin două oculare diferite (microscop binocular) foarte utilizat
 microscoape utilizate în criminalistic ă 25

Figura 3.2: Imagini ale găuncioarelor

de polen de Floarea-Soarelui
cu măriri de 40x, 100x s, i 400x.

Figura 3.3: Componen-

tele microscopului compus ocular

tub de observare
Monocular

suport pentru
obiective
(ecran) braț

(ocular)
obiective
controler coaxial
masă probe
(imagine plană
masa pentru
intermadiară) probe reglaj grosier

(obiectiv) lentile condensor

(proba)
(condensor) diafragma irisului

(imagine virtuală) sursa de lumină

reglaj fin

șasiu
26 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

astăzi. Mersul razelor de lumina printr-un astfel de microscop este

reprezentat în Figura 3.4
 microscoape utilizate în criminalistic ă 27
Monocular

suport pentr
obiective
(ecran)

3.1.1 Terminologie (ocular)

obiective
Principalii termeni care sunt considerat, i în cazul comparării performant, elor
(imagine plană
microscoapelor compuse sunt: masa pentru
intermadiară) probe

• Sursa câmpului de iluminare - iluminare prin transmise

(obiectiv) lentile conden
(proba)
• Sursa de epi-iluminare - iluminare prin reflexie (condensor) diafragma

• Diafragma irisului
(imagine virtuală) sursa de lu
• Parfocal

• Monocular Binocular
Figura 3.4: Mersul razelor de lu- șasiu
mină prin microscopul compus.
• Adâncimea câmpului vizual

• Lărgimea câmpului vizual

toate aceste caracteristici sunt trecute pe fis, a tehnică ce însot, es, te microscopul.
În funct, ie de pozit, ia surselor câmpului de iluminare s, i epi-iluminare s-au
realizat microscoape cu vizualizare de deasupra probei (microscop drept)
respectiv cu vizualizare pe dedesubtul probei (microscop inversat). Astfel

Figura 3.5: Microscop drept.

în cazul microscopului drept (v. Figura 3.5) sursa câmpului de iluminare este
o sursă de iluminare prin transmisie s, i situată în partea de jos a microscopului
iar sursa de epi-iluminare este sursă prin reflexie s, i situată în partea de sus.

Figura 3.6: Microscop inversat.

28 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

Microscopul inversat (v. Figura 3.6) prezintă sursa câmpului de iluminare prin
transmisie în partea de sus iar sursa de epi-iluminare prin reflexie în partea de
jos.

3.2 Microscop stereoscopic

Microscopul stereoscopic este cel mai utilizat în criminalistică (v. Fi-

gura 3.7) având un domeniu de mărire 10–125x. Des, i mărirea acestui micro-
scop nu este foarte mare acest tip de microscop are un câmp de vedere larg
s, i adâncime mare de focalizare (sunt imagini 3D) ceea ce permite utilizarea
acestuia pentru eliminarea artefactelor voluminoase s, i concentrarea studiilor
următoare doar asupra zonelor de interes criminalistic. Nu trebuie

Figura 3.7: Microscop stereoscopic.

confundat microscopul stereoscopic cu cel binocular numai pentru faptul ca

se utilizează ambii ochi pentru privirea imaginii formate. Microscopul stereo-
scopic formează doua imagini distincte pentru cei doi ochi spre deosebire de
microscopul binocular la care pe fiecare ochi este proiectată aceeas, i imagine.
Imaginea stereoscopică este interpretată ca fiind imagine 3D de către creierul
omului care face analiza, orice fotografie obis, nuită făcută prin microscopul
stereoscopic fiind totus, i o imagine 2D.

3.3 Microscopul de comparat, ie

Microscopul de comparat, ie (v. Figura 3.7) este un alt exemplu ce microscop

foarte utilizat în criminalistică ce permite compararea probei cu un model de
laborator. Este format practic din două microscoape compuse independente
care formează imagini alăturate sau suprapuse în acelas, i câmp vizual. Acest
tip de microscop este utilizat în special pentru compararea urmelor lăsate de
diferite unelte pe diferite tipuri de materiale sau în cazul analizei tuburilor de
cartus, ce provin de la diferite arme de acelas, i calibru.

3.4 Microscop cu lumină polarizată

Microscop cu lumină polarizată este un microscop compus în care se

utilizează o lumină polarizată pentru cres, terea contrastului s, i evident, ierea
 microscoape utilizate în criminalistic ă 29

Figura 3.8: Microscop de comparat, ie.

(tuburi de observare)
Figura 3.9: Microscop cu lumină polari-
zată.
(tuburi intermediare)
(ocular)
(cadru)
(lentile Bertrand)

(analizor)

(buton pentru
pornire/oprire)

(masă rotativă)
(control pentru reglarea
(condensor) intensității lămpii)
(polarizor)

(lentilă de focalizare) (buton pentru

reglarea focalizării)
(lampă de halogen
cu tungsten)
(șasiu)

Microscopie în lumină polarizată

unor caracteristici speciale ale probelor analizate. Schema constructivă a
microscopului cu lumină polarizată este prezentată în Figura 3.9. Aici trebuie
remarcate 2 componente ale acestui tip de microscop care cont, in polarizori
numite peAnalizor
scurt: Analizor respectiv polarizor (v.Polarizor
Figura 3.10).

(tub intermediar)
Figura 3.10: Analizorul (stânga) s, i polari-
(fata lentilei)
zorul (2 imagini dreapta) componente ale
microscopului cu lumina polarizată.
(lentile Bertrand)
(controler pentru
lentilele Bertrand)
(polarizor)

(vernier gradat (controler (controlerul de (polarizor)

orientare (apertura
pentru orientarea polarizor) (controlul numeric
al aperturii) a polarizorului) diafragmei)
polarizorului) (compensator plat)

Polarizorul este componenta care transformă lumina nepolarizată de la

29
sursă în lumină polarizată liniar prin introducerea unui material polarizor în
fascicul (aici este un abuz de limbaj pentru că un acelas, i cuvânt „polarizor”
este utilizat pentru materialul care realizează polarizarea luminii s, i a întregii
componente însă un material polarizor este cont, inut s, i de către analizor).
Analizorul este componenta care cont, ine deasemenea un material polarizor
s, i care plasată sub diferite unghiuri fat, ă de polarizor determină o variat, ie a
intensităt, ii fasciculului de lumină s, i obt, inerea practic a contrastului imaginii
în microscopia cu lumină polarizată. Analizorul înlăturat din drumul optic per-
mite obt, inerea imaginii în lumină polarizată s, i dă probei „culoarea adevărată”.
30 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

Dacă se intercalează în drumul optic analizorul s, i se rotes, te până la crearea

condit, iei de extinct, ie (polarizorul s, i analizorul vor avea direct, iile de transmisie
în cruce) vom obt, ine imaginea probei cu o „culoare de interferent, ă”.
Microscopie în lumină polarizată
Îmbunătăt, irea contrastului în cazul microscopiei în lumina polarizată se
obt, ine as, adar prin intensificarea culorilor chiar dacă aceste nu sunt culorile
• Îmbunătățirea
naturale adevărate ale contrastului
cont, inutului probelorprobei prin
respective. În plus se vor obt, ine
intensificarea culorilor
imagini cu contrast diferit prin utilizarea diferitelor tipuri de lumină polarizată:
liniar polarizată sau eliptic/circular polarizată.
Ex: Fibre vegetale colorate
Figura 3.11: Fibre vegetale colorate
observate în lumină nepolarizată
(stânga) respectiv polarizată (dreapta).

31
colorate; lumina polarizata

Acest lucru este observat us, or în imaginile prezentate în Figurile 3.11,

Figura 3.12: Imaginea unei fibre de
poliester în lumină liniar polarizată.
Figura 3.13: Imaginea unei fibre de
poliester în lumină eliptic polarizată.
3.12 s, i 3.13. Se remarcă diferent, a atât între imaginile pentru tipurile de fibre
(vegetale s, i sintetice) dar s, i modul în care este crescut contrastul în lumină
polarizată.
Microscopia în lumină polarizată este utilizată pentru analiza medico-
legală a fibrelor naturale/articiciale dar s, i pentru analiza medico-legală a unor
substant, e cristaline din sol de exemplu deoarece unele componente acestor
substant, e prezintă fenomenul de birefringent, ă adică fenomenul de refract, ie
atunci când lumina trece prin aceste substant, e depinde de polarizarea luminii
incidente. Practic se obt, in două raze de refract, ie în funct, ie de polarizarea
luminii (o rază se numes, te rază ordinară s, i alta rază extraordinară). Exemplu:
cristalul de calcit prezintă un astfel de fenomen (v. Figura 3.14).

Figura 3.14: Birefringent, a

cristalului de calcit.
4 Caracterizarea imaginilor obt, inute prin
instrumente optice

Atunci când sunt studiate imaginile obt, inute prin instrumentele optice
trebuie să se analizeze o serie de fenomene fizice care concură la formarea
imaginii. Fără a avea pretent, ia că vom face un tratat complet privind formarea
imaginilor vom studia în acest capitol o serie de astfel de fenomene fizice.
Pentru aprofundarea acestui subiect recomand două resurse on-line foarte
simple s, i bine informate: Nikon MicroscopyU1 s, i Optical microscopy primer2 . 1
www.microscopyu.com
2
Parte din materialul care urmează este bazat pe informat, iile cuprinse în aceste micro.magnet.fsu.edu/primer/

site-uri.
Prezentăm mai jos o enumerare sumară a fenomenelor fizice ale luminii
care au consecint, e asupra formării imaginilor:

Absorbt, ia Când lumina trece printr-un mediu optic transparent intensitatea se

reduce in funct, ie de culoare absorbită. Astfel, absorbt, ia selectivă a luminii
albe produce lumină colorată.

Reflexia Fenomenul de întoarcere a luminii în mediul din care a provenit,

atunci când întâlnes, te suprafat, a de separare dintre două medii cu densităt, i
optice diferite.

Refract, ia Schimbarea direct, iei de propagare a luminii la trecerea dintr-un

mediu transparent în altul cu densitate optică diferită (indice de refract, ie
diferit). O rază provenită dintr-un mediu mai put, in dens va fi deviată fat, ă
de normala la suprafat, a de separat, ie dintre cele două medii, deviat, ia este
cu atât mai mare cu cât radiat, ia este de lungime de undă mai mică.

Dispersia Separarea luminii în componentele spectrale, cu lungimi de undă

constitutive, atunci când străbate un mediu optic transparent – modificarea
indicelui de refract, ie cu lungimea de undă.

Difract, ia Devierea de la propagarea rectilinie a unei unde luminoase atunci

când întâlnes, te un obstacol cu dimensiunea de ordinul lungimii de undă
a radiat, iei (fenomenul de ocolire a obstacolelor). Cu cât lungimea de
undă este mai mică în raport cu dimensiunea fantei/obstacolului, cu atât
fenomenul se manifestă mai put, in.

Interferent, a reprezintă fenomenul de suprapunere a două sau mai multe unde

care se întâlnesc într-un punct din spat, iu.
32 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

4.1 Absorbt, ia

Atunci când radiat, ia optică trece printr-un mediu intensitatea ei scade după
o lege exponent, ială:
Legea 4.1.

(4.1) I = I0 exp[−e(λ) x ]

numită legea absorbt, ie sau legea Lambert-Beer. În relat, ia (4.1) I0 este

intensitatea radiat, iei optice înainte de stratul absorbant, I este intensitatea
Mediu transparent radiat, iei după ce a parcurs o distant, ă x prin stratul absorbant, e este o mărime
ce depinde de tipul de material absorbant s, i de lungimea de undă λ (culoarea)
a radiat, iilor incidente.
Aplicat, iile directe a absorbt, iei sunt reprezentate cel mai bine de filtrele
utilizate în optică. Ele se bazează pe absorbt, ia selectivă a anumitor culori din
spectrul luminii albe.
De exemplu: pentru un filtru ros, u din spectrul luminii albe sunt absor-
bite radiat, iile optice corespunzătoare culorilor verde, albastru, violet (v. Fi-
gura!4.1).
Filtru roșu În Figura 4.2 sunt reprezentate combinat, iile de radiat, ii optice absorbite din
lumina albă pentru ca radiat, ia ce trece de filtru să fie de o anumită culoare
Figura 4.1: Mediu transparent s, i filtru ros, u.
(coloana 1). De exemplu: pentru obt, inerea culorii verzi se absoarbe ros, u s, i
albastru. Combinații datorate absorbției
Figura 4.2: Combinat, ii datorate Culoarea în lumia albă Culoarea luminii absorbite
absorbt, iei din spectrul luminii albe.
roșu albastru verde
albastru roșu verde
verde roșu albastru
galben albastru
purpuriu verde green

cyan roșu
negru roșu verde albastru

gri roz verde albastru

Figura 4.3: Imagini obt, inute pentru

obiecte colorate diferit când sunt ilu-
minate cu radiat, ii de culori diferite.

Atunci când privim anumite imagini obt, inute prin trecerea radiat, iilor prin
instrumente optice este important ce lungime de undă (culoare) au radiat, iile
respective ceea ce poate determina obt, inerea de imagini colorate diferit, cu
contrast diferit (v. Figura 4.3).
 caracterizarea imaginilor obt, inute prin instrumente optice 33

4.2 Reflexia, refract, ia s, i dispersia

Fenomenele de reflexie s, i refract, ie au fost studiate s, i în capitolul anterior

unde au fost prezentate legile reflexiei s, i refract, iei (v. relat, iile (2.4) pentru
legea reflexiei respectiv relat, ia (2.5) pentru refract, ie).
Reflexia s, i refract, ia sunt fenomene fizice optice ce apar întotdeauna îm-
preună la suprafat, a de separat, ie dintre două medii optice diferite (cu indici de
refract, ie diferit, i). Refract, ia este fenomenul principal care permite radiat, iilor
optice care trec printr-o lentilă să fie deviate controlat pentru a se realiza
convergent, a sau divergent, a fasciculelor (v. lentile convergente sau divergente
studiate în capitolul anterior).
În cazul microscopiei optice refract, ia s, i reflexia permite realizarea devie-
rii razelor de lumină în mod controlat prin alegerea convenabilă a mediilor
transparente între obiectul studiat s, i obiectivul microscopului.

Figura 4.4: Devierea controlată a radiat, iilor

prin utilizarea uleiului de imersie.

În cazul fenomenului de dispersie datorită variat, iei indicelui de refract, ie cu

lungimea de undă (culoarea) radiat, iei optice se vor obt, ine unghiuri de refract, ie
diferite pentru culori diferite. Consecințe ale fenomenului de refracție
Dispersia luminii
Cel mai cunoscut experiment în care este pusă în evident, ă dispersia constă
rac
în trecerea radiat, iei albe printr-o prismă. Aici are loc refract, ia pe cele două
suprafet, e de separat, ie ale prismei s, i radiat, ia emergentă va fi colorată în com-
ponentele radiat, iei incidente (v. Figura 4.5).
Radiat, iile de lungimi de undă mici sunt deviate mai mult decât cele de
lungimi de undă mari. Radiațiile
Figura sunt4.5:
deviate avînd ca rezultat
Dispersia prin separarea
prisma culorilor
optică.–
fenomenul de dispersie a luminii.
Roșul este cel mai puțin refractat, iar violetul cel mai mult.

4.3 Teoria lui Abbe de formare a imaginilor

Fizicianul german Abbe a realizat prima teorie completă privind formarea

imaginilor prin instrumentele optice. El a considerat că: «Imaginea formată
printr-un sistem optic este efectul interferent, ei unor fenomene de difract, ie».
As, adar formarea imaginilor sunt determinate de interferent, a radiat, iilor optice Ernst Karl Abbe
care trec prin sistemul optic dar s, i de modul în care apare difract, ia acestor 23 ianuarie 1840, Eisenach
radiat, ii atunci când întâlnesc obstacole de ordinul lungimii de undă. Este 14 ianuarie 1905, Jena

necesar să se studieze aceste fenomene pentru înt, elegerea completă a formării
imaginilor.
34 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

4.3.1 Interferent, a
Interferent, a este un fenomen specific undelor care constă în suprapunerea
a 2 sau mai multe unde într-o regiune din spat, iul în care se propagă. Acest
fenomen determină valoare intensităt, ii luminoase în acel punct dar cea mai
interesantă manifestare se obt, ine în cazul în care undele care se compun au
aceeas, i frecvent, ă (lungime de undă) (unde monocromatice) s, i sunt coerente
(adică este o diferent, ă de fază constantă între ele). Fenomenul de interferent, ă
în acest caz este numit interferent, ă stat, ionară. În acest ultim caz într-un punct
din spat, iu se poate obt, ine prin interferent, ă stat, ionară o intensitate luminoasă
mai mare sau chiar se poate obt, ine o valoare minimă (la limită zero). În

Figura 4.6: Interferent, a undelor stat, ionare

Figura 4.7: Interferent, a
în dispozitivul Young.
figura 4.6 sunt ilustrate două cazuri de interferent, ă limită a 2 unde stat, ionare
A s, i B între care există o diferent, ă de fază ce duce la cres, terea intensităt, ii
(interferent, ă constructivă) sau la scăderea intensităt, ii (interferent, ă destructivă).
Pentru a ne asigura că radiat, iile care interferă au o diferent, ă de fază constantă
între ele se utilizează de obicei o metodă de împărt, ire a fasciculului de lumină
în două unde care parcurg drumuri optice diferite (altfel spus ele provin din
aceeas, i sursă init, ială dar parcurg drumuri optice diferite). Se obt, in astfel
dispozitive numite interferometre.
Un astfel de dispozitiv este s, i dispozitivul lui Young care constă în plasarea
în fat, a unui fascicul de unde cuasiparalel a unui material opac în care s-
au practicat două fante dreptunghiulare paralele (v. Figura 4.7) Fiecare din
fantele respective pot fi considerate a fi noi surse de unde luminoase iar în
spat, iul de după ele se va forma as, a numita figură de interferent, ă care poate fi
descrisă ca zone luminoase (cu interferent, ă constructivă) alternând cu zone
întunecate (cu interferent, ă destructivă). Practic în loc să obt, inem doar două
imagini luminoase (corespunzătoare celor 2 fante) se obt, in mai multe astfel de
imagini (numărul lor depinde de cât de coerentă s, i monocromatică este radiat, ia
incidentă dar s, i de dimensiunea fantelor fiind cu atât mai multe cu cât fantele
sunt mai mici) ca s, i cum lumina „are direct, ii preferent, iale de propagare”.
Concomitent cu fenomenul de interferent, ă apare aici s, i fenomenul de difract, ie.

4.3.2 Difract, ia luminii

Difract, ia este un alt fenomen caracteristic undelor (s, i în particular undelor
luminoase) care constă în „ocolirea” aparentă a marginilor obstacolelor opace
întâlnite de aceste unde. Altfel spus obiectele opace nu au o umbră net definită
 caracterizarea imaginilor obt, inute prin instrumente optice 35

ci apare s, i o zonă luminoasă în imediata vecinătate a umbrei care este cu atât

mai us, or de observat cu cât dimensiunile obiectelor care produc difract, ia sunt
mai mici (de ordinul lungimii de undă). Fenomenul de difract, ie este studiat în
special în cazul obiectelor de tip fante dreptunghiulare sau circulare. Pentru
că în microscopie se utilizează fante circulare vom studia în cele ce urmează
doar difract, ia prin fanta circulară.
Vom considera că lumina provenită de la o sursă punctuală trece printr-o
diafragmă circulară (diafragma poate fi un ochi sau un obiectiv). Imaginea
obt, inută în urma difract, iei constă într-un cu intensitate luminoasă foarte mare
centrat pe imaginea diafragmei circulare înconjurat de cercuri concentrice
luminoase mult mai put, in intense (v.!Figura 4.8).
Profilul 3D de distribut, ie a intensităt, ii luminoase se numes, te Discul lui
Airy (sau „point spread function”, PSF – funct, ia de împrăs, tiere a unui punct).
Dimensiunea discurilor Airy determină dimensiunea punctelor fizice de pe
imaginile formate într-un sistem optic (în particular printr-un microscop).
Această mărime determină rezolut, ia optică a sistemului optic.

4.3.3 Rezolut, ia
Figura 4.8: Difract, ia printr-
Cum rezolut, ia optică este capacitatea unui sistem optic de a distinge 2 o diafragmă circulară.
puncte luminoase ca fiind separate atunci cu cât discurile Airy a două puncte
luminoase învecinate sunt mai mici cu atât rezolut, ia spat, ială este mai bună.
Dacă discurile Airy sunt mari  cele două puncte luminoase nu se văd separat
în timp ce dacă discurile Airy sunt mici  cele două puncte luminoase se văd
separat (v. Figura 4.9).

Figura 4.9: Legătura dintre discul Airy s, i

rezolut, ia optică.

Apertura numerică (N.A.)

Cres, terea rezolut, iei unui sistem optic este legată direct de modul în care
reus, im să obt, inem un disc Airy mai mic. Acest lucru se poate face prin utili-
A = 2
zarea unui obiectiv cu apertură numerică mare sau cu mărire mare. Apertura
numerică este legată de modul în care se poate face focalizarea radiat, iei optice

printr-un sistem convergent (v. Figura 4.10). N.A.= n x
Conul de lumină
n = indi

(4.2) NA = n sin α

unde NA=apertura numerică (din engl. Numerical Aperture) n indicele de Figura 4.10: Apertura numerică a unui
21
obiectiv.
refract, ie a mediului prin care se propagă radiat, ia s, i α este jumătatea unghiului
36 tehnici microscopice utilizate în criminalistic ă

de deschidere dată de focalizarea radiat, iei la nivelul obiectivului. Găsim

Figura 4.11: Legătura dintre dis-

cul Airy s, i apertura numerică.

as, adar s, i o legătură între rezolut, ia optică, discul Airy s, i Apertura numerică
(v. Figura 4.11): NA=mică, discuri Airy mari s, i implicit rezolut, ie optică mică
iar pentru NA=mare discurile Airy sunt mici s, i rezolut, ia optică mare.
O altă mărime care intervine în caracterizarea imaginilor prin instrumente
optice este s, i rezolut, ia spat, ială. Această mărime este determinată de criteriul
lui Rayleigh: „două puncte luminoase se consideră distincte dacă:
• Discul Airy a primului punct luminos se suprapune peste primul ordin de
difract, ie al celui de al doilea punct luminos (determinat de primul cerc
luminos al discului Airy);

• Cele 2 puncte luminoase se consideră la o distant, ă d egală cu raza discului

Airy.”
Criteriul (limita) Rayleigh este utilizat pentru a defini cel mai bine puterea de
rezolut, ie (sau puterea separatoare) a unui obiectiv.
Definit, ie 4.1. Puterea de separare (de rezolut, ie) caracterizează capacitatea
unui instrument optic sau a unui material fotosensibil de a forma imagini
distincte s, i clare pentru 2 puncte foarte apropiate ale obiectului.
Puterea de rezolut, ie a unui obiectiv este strâns legată de sistemul format
din obiectiv s, i condensor (prin care este focalizată lumina pe obiectiv). Cele
două elemente din microscop sunt caracterizate fiecare de apertură numerică
notate NA obiectiv respectiv NA condensor . Se disting as, adar 2 cazuri:
• NA condensor > NA obiectiv de unde se calculează distant, a minimă în
mum:
0, 61λ
(4.3) d=
NA obiectiv
cu 0,61 un factor ce depinde de geometria de cercuri.

• iar pentru NA condensor ≤ NA obiectiv

1, 22λ
(4.4) d=
NA obiectiv + NA condensor

Formulele de mai sus se utilizează pentru calculul distant, ei separatorii d ce

determină puterea de rezolut, ie a sistemului optic (v. Figura 4.12).
 caracterizarea imaginilor obt, inute prin instrumente optice 37

Figura 4.12: Determinarea rezolut, iei

spat, iale optime pentru sistemul op-
tic format din obiectiv s, i condensor.

OK Prea aproape!

4.3.4 Contrast/culoare
Contrastul este numărul de nuanţe găsite într-o imagine. O imagine cu
contrast ridicat va avea doar două nuanţe, negru s, i alb. Mai multe nuant, e,
contrast mai puţin, dar mai multe informaţii. Culoarea este, de asemenea,
considerată o formă de contrast (v. Figura 4.13).
Imaginile formate în diferite tipuri de microscoape pot releva diverse
amănunte (sau elimina artefacte) dacă se pot obt, ine contraste diferite. Se
utilizează mai multe metode de mărire a contrastului:

• Iluminare în câmp luminos (Bright Field)

• Iluminare în câmp întunecat (Dark Field)

• Intensificarea culorilor

• Folosirea filtrelor

• Microscopie în lumină polarizată

• Contrast de fază

• Contrast interferent, ial

• Microscopie de fluorescent, ă

• Iluminare oblică

• Prin modificarea temperaturii probei

• Microscopie optica de baleiaj ce folosesc lasere

O parte din aceste metode vor fi descrie în cele ce urmează.

Iluminare în câmp luminos se obt, ine o imagine întunecată pe un fond luminos
contrastul în es, antion fiind cauzat de diferent, a de absorbant, ă a componentelor
luminii transmisă prin zonele de densităt, i optice diferite ale probei. Caracte-
ristici:
Contrastul este numărul de nuanţe găsite într-o imagine.
O imagine cu contrast ridicat va avea doar două nuanţe, negru şi
alb.
Mai tehnici
38 multe nuante, contrast
microscopice mai în
utilizate puţin, dar maiămulte informaţii.
criminalistic
Culoarea este, de asemenea, considerată o formă de contrast.

Iluminare Contrast
în câmp luminos
datorat absorbţiei luminii
Figura 4.13: Contrastul/culoarea.

(Bright Field)
Performanțe Contrast datorat difracției luminii
Microscopia în câmp luminos este(contrast
o tehnicăde fază) de microscopie optică şi prin
standard
urmare mărirea este limitată de puterea de rezoluţie posibilă, dependentă de
lungimea de undă a componentelor luminii vizibile.
Contrast datorat interferenței luminii
Cu cît lungime de undă este mai mică cu
(contrast atât rezoluţia este mai mare!
interferențial)
Contrast scăzut în cazul probelor care au aceeași absorbanță pentru toate
componentele acesteia.

câmp luminos lumină polarizată câmp întunecat contrast de fază Figura 4.14: Compararea tehnicilor de
iluminare prin transmisie utilizate pentru a
genera contrast într-un es, antion de hârtie.

Compararea tehnicilor de iluminare prin transmisie utilizate pentru a genera contrast într-un
4
eşantion de hârtie
• iluminarea probei este prin transmisie (proba este iluminată de jos s, i obser-
vată de sus sau invers în cazul microscopului optic inversat);

• are mai multe lentile obiectiv;

• sistem optic (microscop) parfocal – rămâne aproximativ focalizat atunci

când este schimbată mărirea (când obiectivele sunt schimbate între ele);

• mărirea totală este produsul de măriri a lentilelor ocular s, i lentilelor obiec-

tiv.

Avantajul metodei: nu necesită componente suplimentare, fat, ă de configurarea

unui microscop optic obis, nuit! Microscopia în câmp luminos este o tehnică
standard de microscopie optică s, i prin urmare mărirea este limitată de puterea
de rezolut, ie posibilă, dependentă de lungimea de undă a componentelor luminii
vizibile. Cu cît lungime de undă este mai mică cu atât rezoluţia este mai mare!
Contrast scăzut în cazul probelor care au aceeas, i absorbant, ă pentru toate
componentele radiat, iei de iluminare.
Pentru a cres, te contrastul în cazul câmpului luminos s încearcă îmbunătăt, irea
imaginii prin:

• Mics, orarea/mărirea intensităt, ii luminii, prin intermediul diafragmei iris.

• Observarea probelor folosind tehnica „în imersie”, folosind obiective de

imersie în apă sau ulei s, i respectiv apă/uleiuri de imersie adecvate cu
pretent, iile analizei. Dacă uleiul de imersie are indicele de refract, ie egal cu
cel al lamelei ce acoperă proba se va îmbunătăt, i rezoluţia!

• Utilizarea de metode de colorare a probelor;

• Utilizarea filtrelor de culoare (de obicei albastru);

• Utilizarea filtrelor de polarizare a luminii pentru a evidenţia caracteristici

care nu sunt vizibile în lumină albă.

Iluminarea în câmp întunecat se realizează realizat prin iluminarea probei cu

raze de lumină care nu vor fi colectate de lentila obiectiv s, i prin urmare nu vor
face parte din imagine. Are aspectul clasic al unui întuneric – fundal aproape
 caracterizarea imaginilor obt, inute prin instrumente optice 39

negru, cu obiecte luminoase. Un disc special blochează razele, provenite de la

sursa de iluminare pe direct, ia axei optice a microscopului, permit, ând trecerea
luminii numai printr-un inel exterior. Lentila condensor concentrează lumina
spre probă. Lumina intră în eșantion, cele mai multe raze sunt transmise
direct, în timp ce unele sunt împrăs, tiate de eșantion. Lumina împrăs, tiată
(difuză) intră în lentilă obiectiv, în timp ce lumina transmisă direct nu este
colectată. Numai lumina difuză (undele difractate de ordinul întâi s, i cele de
ordin superior) participă la formarea imaginii, în timp ce lumina transmisă
direct (undele difractate de ordinul zero) lipsesc.
Pentru a se asigura că razele care provin de la condensor cad cît mai oblic
posibil pe probă, trebuie să se ridice condensorul cât mai sus sub probă s, i
diafragma obiectiv să fie deschisă la capacitate maximă. Astfel se lucrează în
imersie cu apă sau ulei între condensor s, i lamela de sticlă ce acoperă proba. Figura 4.15: Comparat, ie iluminare în câmp
Datorită refract, iei, la trecerea din lamelă razele de lumină vor fi deviate la întunecat s, i în câmp luminos.
unghiuri mai mari decât cele de incident, ă, dacă lamela are indicele de refract, ie
mai mare decât cel al apei/uleiului. Apa este folosită pentru mai mult confort
iar imersia în ulei este folosită pentru o rezolut, ie mai bună.
Iluminare
Microscopia înîn câmp
camp întunecat
întunecat este cea mai (Dark
potrivităField)
pentru contururi
revelatoare s, i margini (limitate de obiecte). Este mai puţin utilă pentru detalii
Microscopia in camp intunecat este cea mai potrivită pentru contururi
revelatoare
revelatoare interne din
şi margini celule,decu
(limitate excepţia
obiecte). cazului
Este în care
mai puţin există o mult, ime
utilă pentru
dedetalii revelatoare
organite foarte interne din într-un
refractile celule, cu excepţia
citosol cazului
relativ în care există
transparent. Cuocât razele
mulţime de organite foarte refractile într-un citosol relativ transparent.
deCulumină cad mai oblic pe probă cu atât este mai us, or uşor
cât razele de lumină cad mai oblic pe probă cu atât mai
detectarea
este de
prezent, ei
obiectelor foarte mici.
a detecta prezenţa obiectelor foarte mici.

Figura 4.16: Detalii obt, inute în câmp

întunecat.

câmp luminos câmp întunecat

11
caracterizarea imaginilor obt, inute prin instrumente optice 41
Glosar

Analizor, 29 Indice Optica

Apertură de refract, ie, 13 geometrică, 11
numerică, 35 Interferent, ă
Aproximat, ia constructivă, 34 Polarizor, 29
paraxială, 15 destructivă, 34 Punct
Interferent, a, 34 proxim, 19
Birefringent, ă, 30 interval Putere
optic, 21 optică, 19
Câmp separatoare, 19
întunecat, 38 Legea separatorie liniară, 19
luminos, 37 absorbt, iei, 32 separatorie unghiulară, 19
Contrast, 37 Lambert-Beer, 32 Puterea
definit, ie, 11 Lentile de rezolut, ie, 36
Convergent, ă, 19 concave, 15 lupei, 20
Criteriul convexe, 15 microscop, 21
Rayleigh, 36 definit, ie, 15
Lungime Rază
Difract, ia de undă, 13 de lumină, 12
luminii, 34 Lupa, 20 Reflexia, 31, 33
Dioptru, 14 luminii, 14
Discul Airy, 35 Mârire Refract, ia, 31, 33
Distant, ă liniară, 19 luminii, 14
focală, 15 Mărire Rezolut, ia
Drum liniară, 18 spat, ială, 36
optic, 13 Microscop
drept, 27 Spat, iul
Fascicul electronic, 8 imagine, 11
de lumină, 12 inversat, 28 obiect, 11
Filtru optic, 8, 20 Stigmatism, 17
selectiv, 32 stereoscopic, 28
Focar Microscopie Teoria
imagine, 15, 18 definit, ie, 8 Abbe, 33
obiect, 15, 18 Microscopul
Formarea cu lumină polarizată, 28 Unde
imaginilor, 33 de comparat, ie, 28 coerente, 34

Grosisment, 19 Ochi Viteza

microscop, 21 emetrop, 19 luminii, 13