Tipuri de microscoape utilizate pentru cercetarea celulelor

Investigatiile citologice si histologice se bazeaza pe preparatele ``microscopice`` numite extemporanee

sau nepermanente, care se examineaza fie la microscopul optic sau fotonic, fie la alte tipuri de microscoape,
cum sunt: microscoape cu fluorescenta, microscoape cu lumina ultravioleta, microscoape cu camp intunecat,
microscoape de forta atomica si microscoape electronice prin transmisie sau prin baleaj.
Microscoapele optice sau fotonice utilizeaza pentru obtinerea unei imagini marite a preparatelor,
efectele optice ale lentilelor asupra radiatiilor fotonice ale spectrului luminos.
Calitatea unui microscop fotonic este data de rezolutia sa. Rezolutia este capacitatea de a distinge intre
doua obiecte apropiate si este data de distanta minima la care doua imagini punctiforme mai pot fi observate
distinct. a este determinata in primul rand de lungimea de unda ! " # a luminii folosite.
1.1. Microscopul optic obisnuit, cu care se examineaza preparatele prin transparenta in lumina
spectrului vizibil care are lungimea de unda cuprinsa intre $%&&'(&&& ), este cel mai utilizat in hiostologie
pentru studiul tesuturilor si in citologie pentru studiul celulelor. *atorita luminii albastre existente in spectrul
luminii vizibile si care are lungimea de unda cea mai scurta, respectiv &,+ ,m, se pot studia preparate
citologice la o putere de rezolutie de aproximativ &,-,m, deci pot fi observate detalii cu diametrul de
aproximativ . ,m.
/cest tip de microscop este cel mai larg utilizat in cercetarile citologice. /ceste microscoape pot avea un
singur tub ocular, si se numesc microscoape monoculare, observatiile putand fi efectuate privind cu un singur
ochi. Cele mai multe microscoape optice au insa doua oculare, si se numesc binoculare, observatiile fiind
efectuate privind concomitent cu amandoi ochii.

1.2. Microscopul cu contrast de faza este utilizat in special pentru studiul celulelor vii. l reprezinta o
adaptare a microscopului obisnuit, prin utilizarea unor anexe care permit transformarea diferentelor de faza
existente in preparatul viu si neperceptibile ochiului, in diferenta de amplitudine.

1.3. Microscopul polarizant permite studierea proprietatilor optice ale structurilor in lumina polarizata.
0reparatul este iluminat cu un fascicul de lumina polarizata, obtinut prin interpunerea unui nicol
! polarizatorul # in calea fascicolului luminos, sub condensor. 0roprietatile optice ale obiectelor studiate sunt
determinate cu ajutorul unui alt nicol ! analizatorul # adaptat la ocular.

1
1.4. Microscopul cu fond intunecat, are un orificiu de iluminare care nu permite iluminarea intregului
camp ci, cu ajutorul unui condensor special care impiedica trecerea razelor directe prin preparat, sunt lasate sa
treaca doar razele laterale. In acest fel, obiectele aflate in campul iluminat lateral, de obicei mici organisme
aflate in stare vie, vor apare stralucitoare pe un fond intunecat ! fenomenul 23ndal #. Microscopia pe fond
intunecat da imagini de suprafata, indicand prezenta si miscarile anumitor obiecte sau microorganisme
studiate.
1.5. Microscopul cu lumina ultravioleta. 4tilizeaza radiatii cu lungime de unda mai mica decat cea a
spectrului vizibil, respectiv, de -.5&& ) in loc de $.%&&' (.&&& ), fapt pentru care acest microscop are o putere
de rezolutie mai mare decat a microscopului obisnuit. /ceste microscoape au intreaga optica din cuart, fiind
stiut faptul ca sticla este impenetrabila pentru radiatiile ultreviolete.
1.6. Microscopul cu fluorescenta, se bazeaza pe proprietatea unor substante de a transforma radiatiile
ultraviolete in radiatii vizibile, proprietate denumita fluorescenta. 0rin ocular de observa imaginile luminoare
datede structurile devenite fluorescente, datorita faptului ca preparatele au fost tratate cu substante zise
``fluorescente``.
1.7. Microscopia focala, permite obtinerea unei imagini tridimensionale a structurii studiate. 0rincipiul
de functionare se bazeaza pe osursa punctiforma de lumina care este focalizata pe un preparat printr'o lentila,
de regula printr'un obiectiv de microscop, iar imaginea se reintoarca prin aceeasi lentila la un fotodetector
care are in fata sa o diagrama. *eci, lumina care porneste de la zona punctiforma din planul preparatului aflata
exact in focarul obiectiv, va focaliza direct prin diafragma dinaintea fotodetectorului si va fi vizibila, restul
structurilor aflate in planurile invecinate nefiind vizibile. 0ot deci fi vizualizate numai imagini punctiforme,
foarte mici, insa mult mai clare decat cu microscopul obisnuit, deoarece rezolutia este mult mai buna, fiind de
&,-& nm.
/cest microscop permite obtinerea de imagini de la structuri neincluse si nesectionate, prin posibilitatea sa
de a executa `` sectiuni optice``, respectiv de a furniza imagini de la diferite nivele ale obiectului studiat.
1.8. Microscopul de forta atomica. /cest tip de microscop poseda un senzor sub forma unei sonde
montate pe o tija metalica. Intre varful acestei sonde'senzor si atomii probei de studiat peste care se `` plimba
`` senzorul si culege informatii, se stabileste o forta atomica care trebuie mentinuta constanta. 6aloarea acestei
forte este foarte mica, de ordinul a 1 7e8ton, similara cu cea existenta intre doi atomi de neon. 9e pot obtine
imagini ale oricarei probe de studiat, fara o pregatire speciala a acestora si la rezolutii foarte inalte, respectiv
de ordinul angstromilor, ca si la microscoapele electronice.
Microscopul de forta atomic este alcatuit dintr'un computer, o unitate de control electronic si o masa de
microscop.
1.9. Microscoapele alectronice. In microscopia electronica, un fascicul de electroni inlocuieste lumina
vizibila.lectronii, accelerati la o tensiune de voltaj cuprinsa intre :&.&&&'$.&&&.&&& volti, au proprietati de
unde de numai &,&&: nm, respectiv &,&: ). Cu ajutorul acestei lungimi de unda s'ar putea atinge in mod
teoretic o rezolutie de aproximativ &,1 ), deci mai mica decat diametrul unor atomi. /ceasta inseamna ca
microscopul electronic are o rezolutie de +&& de ori mai mare decat cea o microscopului optic si de -&&.&&&
de ori mai mare decat a ochiului uman.
Microscoapele electronice utilizeaza o sursa de electroni, respectiv o catoda care fiind incalzita emite
electroni. /cesti electroni sunt apoi accelerati cu ajutorul unei tensiuni de zeci de mii, sute de mii sau chiar
milioane de volti, de'a lungul interiorului coloanei microscopului in care este in permanenta mentinut un vid
foarte inalt. /ceasta coloana este alcatuita din bobine electromagnetice care dirijeaza fluxul de electroni
accelerati asupra preparatului de studiat, alcatuit de sectiuni ultrafine groase de aproximativ :&& ), pe care
electronii le traverseaza, preiau din el informatia sub forma de imagine si o transmite mai departe sub forma
marita pe un ecran fluorescent pentru a fi analizata de observator.
-
/ceste microscoape electronice se numesc microscoape elctronice prin transmisie. Cele mai bune
microscoape electronice prin transmisie au o putere de rezolutie de 1 ), putand observa aranjamentul atomilor
din anumite materiale cristaline, stiind faptul ca diametrul atomului de ; este de 1 ). In asemenea
microscoape se pot obtine mariri de la 1.&&& de ori ale preparatelor studiate pana la (&&.&&& de ori vazute
direct in microscop, iar prin marire fotografica ulterioara se pot atinge mariri de pana la -&.&&&.&&& de ori.


$
+
1.1. Microscopia electronica de inalt volta!. Reprezinta o varianta a microscoapelor electronice prin
transmisie, in sensul ca aceste microscoape permit o accelerare a electronilor de aproximativ 1'$ milioane de
volti. /cest voltaj suprainalt permite examinarea fie a unor sectiuni mai groase decat cele studiate in
microscoapele electronice obisnuite, respectiv de cativa ,m, fie examinarea unor celule sau microorganisme
intregi, incluse intr'o capsula speciala.


Cu ajutorul unor asemenea microscoape s'a observat in citoplasma celulelor examinate existenta unei
organizari ultrastructurale mai fine decat cea a citoscheletului celular, respectiv s'a observat o retea de
microtrabecule mult mai fine decat cele mai subtiri filamente ale citoscheletului. *e asemenea, aceste
microscoape au permis observarea pentru prima data a unor celule vii, si realizarea unor imagini
:
surprinzatoare ale mitocondriei, care apare sub forma unui organit unic intr'o celula, sub aspectul unui arbore
ramificat in toata citoplasma. *upa obtinerea acestor imagini s'a considerat ca ceea ce vedem de fapt din
imaginile examinate prin sectiunile analizate si numim mitocondrii nu ar fi altceva decat ramuri sectionate de
la diferite niveluri ale acestei mitocondrii arborescente unice.
1.11. Microscopia electronica" scannin# sau de balea!
/ceste microscoape permit obtinerea unor imagini tridimensionale ale suprafetelor diferitelor obiecte sau
preparate biologice de studiat. Cu ajutorul acestor microscoape se pot studia obiecte de dimensiuni relativ
mari, respectiv de cativa centimetri. *e exemplu poate fi vizualizata structura cristalina a unor roci sau
diferite alte materiale aflate in stare solida.
9pre deosebire de microscopia electronica de transmisie, cea cu baleaj realizeaza imaginea pe baza
electronilor reflectati de suprafetele preparatului care in prealabil au fost metalizate prin depunerea, prin
evaporare in vid, a unui strat subtire din anumite metale, de regula aur, platina sau chiar carbon. 4n fascicul
de electron foarte ingust, de aproximativ -&'5& ), efectueaza o miscare de zig'zag, ``maturand``, respectiv
scanand de fapt intreg preparatul, de la un capat la altul si redand informatia culeasa sub forma de imagini
afisate pe un monitor de televiziune. 0rincipiul este asemanator televiziunii, imaginile obtinute fiind
tridimensionale.
<
1.11. Microscopie electronica analitica
In acest caz, microscopul electronic propriu'zis ! cu transmisie sau scanning # este prevazut cu un sistem
de microanaliza cu raze =, respectiv un spectrometru care permite analiza elementelor componenete ale
preparatului studiat, redand pe un monitor imagini sub forma de grafice sau de harti. /semenea microscoape
electronice permit analiza a %- elemente de la >or la 4raniu.

2. $repararea probelor biolo#ice pentru e%aminarea in T&M
In microscopul electronic, specimenul este expus intr'un vid avansat, fapt care face imposibila
examinarea sa in stare vie. Celulele si tesuturile supuse observatiei sunt, in mod normal, prezervate in
prealabil prin fixare. *eoarece electronii au putere foarte limitata de penetrare a tesuturilor fixate, piesele
trebuiesc taiate in sectiuni extrem de subtiri ! :&'1&& nm # inainte ca ele sa fie examinate.0entru aceasta,
specimenele sunt dehidratate si infiltrate cu o rasina sintetica monomerica. 0rin inducerea polimerizarii se
obtine un bloc solid si compact de plastic ce contine specimenul. >locul este sectionat la nivelul
specimenului, cu ajutorul unui ultramicrotom, obtinandu'se sectiuni ultrafine,fara apa sau solventi volatili.
/ceste sectiuni sunt montate pe un suport reticulat de forma discoidala, alcatuit din cupru, denumit grila
electrolitica.
5
Contrastul imaginii obtinute in microscopul electronic depinde de numarul atomic al atomilor din care
este alcatuit. Moleculele viului sunt compuse din atomi cu numar atomic mic ! carbon, oxigen, azot si
hidrogen #. 0entru a le face vizibile,structurile biologice sunt contrastate ! impregnate, inainte sau dupa
sectionare # cu saruri ale metalelor grele cum sunt cele de uraniu sau de plumb. *iferitii constituenti celulari
vor arata grade diferite !variate# de contrast in functie de gradul lor de impregnare !?colorare? # cu aceste
saruri.
/vand in vedere tabloul esentializat al modului de pregatire a specimenelor biologice pentru
examinarea in 2M prezentat in cele de mai sus, este evident ca imaginea in microscop a structurilor celulare
observate va depinde de mai multi factori si in primul rand de: modul de colectare a probei, fixare,
dehidratare, includere, sectionare si contrastare.
3. 'i%area
@ixarea chimica a specimenelor are o importanta cruciala pentru rezultatele analizei
electronomicroscopice. 9copurile principale ale fixarii chimice sunt: stoparea proceselor metabolice,
prezervarea structurii fine a celulelor si stabilizarea celulelor pentru a face posibile etapele urmatoare ale
procedurii de preparare in vederea vizualizarii. In unele studii, cu caracter mai special, este necesar ca fixarea
sa prezerve activitatea enzimatica, antigenitatea tisulara etc.
0rocedura de fixare presupune:
a#.selectia agentilor chimici de fixare ! fixatorilor #A
b#.alegerea unui vehicul adecvat pentru fixator ! solutia tampon in care este dizolvat, p;'ul solutiei precum
si alte substante dizolvate in solutia tampon #A
c#.alegerea ueii proceduri adecvate de aplicare a solutiei fixatoare ! timp, temperatura, succesiunea
fixatorilor etc. #.
*e'a lungul timpului au fost descrise numeroase metode de fixare. 7ici una dintre ele nu este la fel de
potrivita ! avantajoasa # pentru toate tipurile de celule sau tesuturi.
Cei mai cunoscuti fixatori chimice utilizati in microscopia electronica sunt glutaraldehida si acidul
osmic.
Blutaraldehida leaga moleculele proteice intre ele prin legaturi covalente iar acidul osmic stabilizeaza
atat bistraturile lipidice cat si proteinele. 4ltimul are si un efect benefic asupra amplificarii contrastului, mai
ales a membranelor ! bistraturilor #.
2ehnicile moderne de fixare utilizeaza ambii fixatori, fixarea cu glutaraldehida precedand'o pe aceea cu
acid osmic. 9e utilizeaza solutii fixatoare apoase, obtinute prin dizolvarea fixatorilor in solutii tampon
! tampon fosfat sau tampon cacodilat, de obicei 0h'ul C 5,- D 5,< #. 9olutiile fixatoare au urmatoarele
concentratii: -'<E glutaraldehida si 1'-E acid osmic. *urata fixarii este de 1'- ore, in fiecare din cele doua
solutii fixatoare. @ixarea se efectueaza in tubusoare de sticla bine inchise, la temperatura camerei sau la +FC
! frigider #. *urata fixarii precum si concentratiile solutiilor fixatoare trebuie sa fie, de obicei, mai mari in
cazul tesuturilor vegetale. 0entru protiste procedurile de fixare sunt mai variate in functie de natura acestora
! bacterii, fungi, protozoare, alge, etc.#.
/lte substante fixatoare utilizate in microscopia electronica sunt: formaldehida, permanganatul de G si
acroleina.
*upa cum s'a mai amintit, fixarea propriu'zisa poate fi precedata de o prefixare a tesuturilor in situ.
(