ELECTROFOREZA ACIZILOR NUCLEICI ŞI A PROTEINELOR

Electroforeza este una dintre cele mai eficiente metode de analiza a proteinelor si AN utilizate in biologia moleculara
pentru separarea (fragmentelor ADN rezultate in urma digestiei enzimatice), identificarea (produselor rezultate in urma
amplificării PCR, cantitativa a fragmentelor ADN obţinută în reacţiile PCR sau de extracţie) si purificarea fragmentelor de
ADN (din gel de agaroză după migrare prin excizarea cu kituri special predestinate acestui tip de purificări) (Fig.1).
Deplasarea moleculelor se face în prezența unui curent electric (AN sunt încărcați negativ datorită prezenței grupărilor fosfat
și migrează spre electrodul încărcat pozitiv Anod+) într-un mediu solid sau semisolid (Fig.2). Moleculele de polinucleotide
(ribo- sau deoxi-) se comportă ca polianioni, indiferent de pH-ul tamponului utilizat la separare. În absenţa unor forţe
externe, moleculele de acizi nucleici se află în stare relaxată în soluţie, mişcarea lor fiind de tip Brownian. Sub influenta
unui camp electric extern, moleculele se vor alinia la direcţia câmpului electric si vor migra spre anod printr-o mişcare
dirijata. Viteza de migrare — denumită mobilitate electroforetică — este dependentă de dimensiunile moleculei şi de
conformaţia acesteia. Mobilitatea si implicit separarea fragmentelor de ADN depind de o serie de parametri externi cum ar fi
compoziţia si concentraţia gelului (dimensiunea porilor din matriţă-suport (gel), a tamponului de lucru, temperatura si
intensitatea câmpului electric (voltajul). Odată cu creşterea voltajului aplicat, fragmentele de ADN mai mari vor migra
proporţional mai rapid decât cele mai mici. Rezoluţia cea mai bună la migrarea fragmentelor mai mari de 2 kb se obţine prin
mentinerea unui voltaj de max. 5 V/cm (valoarea în cm se referă la distanţa dintre electrozi).
Echilibrul dinamic dintre forţa cîmpului
electric aplicat şi forţa de reţinere produsă
de mişcarea unei molecule de o anumită
conformaţie şi dimensiune prin gelul de
separare determină mobilitatea, dependentă
de mai mulţi parametri:

Fig. 2. Fragmentele se separa sub

forma unor benzi electroforetice

Pentru electroforeză se pot folosi geluri de poliacrilamidă, agaroză sau mixte. Agaroza, polizaharid extras dintr-o
variatate de alge roşii, este un polimer linear compus din reziduri alternative de D şi L-galactoză reunite prin legături (1-3)
şi (1-4) glicozidice; la încălzire în soluţii apoase formează hidrosoli, care la răcire se transformă în hidrogel.
 Pentru estimarea aproximativă a mărimii fragmentelor în acelasi gel, dar în godeu separat se va migra un amestec de
molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de molecule se numeste marker molecular ADN.
Unul dintre avantajele acestei tehnici este acela că ADN-ul nu este denaturat, păstrându-și intacte elementele structurale.
Pentru a evita fragmentarea ulterioară a ADN-ului manipularea trebuie facută în așa fel încât să se evite contaminarea cu
amprente, picături, salivă sau microorganisme. Din acest motiv se preferă utilizarea de materiale și soluții sterile (vârfuri,
apă bidistilată sterilizată etc).
Marimea fragmentelor este exprimata in: ”nucleotide”, ”perechi de baze” sau “kb” - pentru o mie de perechi de baze.
Prelucrarea statistică a datelor experimentale se efectuieaza prin utilizarea diferitor programe: TotalLab Quant, Gelanalyzer,
PhotoCap.
Parametrii electroforezei. Când ADN este supus gel electroforezei, moleculele respective sunt obligate să migreze
prin interstiţiile reţelei spre anod, cu o viteză de migrare care depinde de următoarele caracteristici:
 masa moleculară. Există o relaţie de proporţionalitate inversă între mobilitate şi logaritmul masei (fig.3), dar relaţia este
valabilă doar pentru moleculele liniare având sub 20 kb. Migrarea moleculelor mari este aproape independentă de mărime,
astfel încât nu se mai observă relaţia de liniaritate;
 conformaţia (liniară L, cerc deschis CD/OC — open circle, cerc covalent închis CCI/CCC — covalently closed circle). La
aceeaşi masă, moleculele CCI au cea mai mare mobilitate, pe când conformaţia CD este cea mai lentă. Moleculele liniare au
o mobilitate intermediară, comparativ cu celelalte două specii;
 porii gelului (în funcţie de concentraţia gelului). Pot fi predeterminaţi prin ajustarea concentraţiei: cu cât gelul este mai
diluat, porii sunt mai mari şi reciproca. Un fragment de acid nucleic de o anumită dimensiune va migra cu mobilităţi diferite
în geluri de concentraţii diferite, dependenţă exprimată prin ecuaţia:

Gelurile de agaroză se realizează prin încălzirea agarozei într-un tampon

specific. Concentraţia agarozei în gel poate fi între 1% si 3% în dependenţă
de scopul urmărit. Cu cât concentraţia agarozei este mai mare, cu atât
mărimea porilor va fi mai mică. La concentraţii mai mici de agaroză, porii
vor fi mai mari şi migrarea moleculelor mai rapidă. Gelurile de agaroza de
1% sunt cel mai des utilizate, oferind separarea moleculelor între 0,1 şi 10
kpb. Gelurile de agaroză sunt plasate între cei doi electrozi în cuve speciale
care conţin tampon de migrare. Acest tampon este acelaşi folosit şi pentru
realizarea gelului. De obicei, moleculele mari de ADN (15-40xl06Da) sunt
separate în geluri cu concentraţii mici (0,3-0,5%), pe când cele mici — pînă
la 10xl06D sunt bine rezolvate în geluri cu dimensiuni reduse ale porilor, la
concentraţii de 0,7—1,0% sau chiar până la 2-3% (Tab. 1):
 gradientul de potenţial la care are loc migrarea. Diferenţele mari de potenţial sunt utilizate pentru separarea fragmentelor
de mici dimensiuni, dar rezoluţiile cele mai bune se înregistrează totuşi la gradienţi mai mici de potenţial;
 tamponul de electroforeză (compoziţie ionică, tărie ionică, pH). In cursul electroforezei pe gel de agaroză se pot folosi
diverse tampoane, cum ar fi TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE (Tris- borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE (Tris-
fosfat 90 mM, EDTA 2 mM) pH=7,5—7,8. Soluțiile tampon pentru electroforeză se pastrează sub forma unor stocuri
concentrate (10x-50x) la temperatura camerei. TAE este cel mai utilizat, ieften, migrarea cu 10% mai rapidă, dar este un
tampon mai „leneş“, fiind ca are un potential scăzut, care necesită recirculare, pe când TBE este „rapid“, adică separarea
speciilor de ADN are loc cu viteze mai mici sau mai mari, TPE și TBE sunt costisitoare, dar cu potential înalt decăt TAE,
foarte calitativa separare a fragmentelor ADN, recirculare nu este obligată. Pe măsură ce creşte tăria ionică, proporţională cu
concentraţia ionilor, aceştia vor transporta mai mult curent, ceea ce va avea ca efect frânarea mobilităţii moleculelor de
separat şi se va traduce printr-o separare mai netă a speciilor de analizat.
In general, se recomandă adaptarea condiţiilor de electroforeză la circumstanţele specifice ale fiecărui experiment.
Comportarea electroforetică a acizilor nucleici în gelurile de agaroză nu depinde practic de compoziţia în baze sau de
temperatură. Mobilitatea relativă a fragmentelor de ADN nu se modifică în domeniul 4°-30°C.
Gelurile de agaroză de concentraţii variate se pot utiliza în dispozitive verticale sau orizontale (care sunt cele mai comode
la lucru).
 Moleculele acizilor nucleici pot fi vizualizate în gel prin colorare cu agenţi fluorescenţi chimici, sau sunt marcate
radioactiv (Fig. 3). După migrarea speciilor de acizi nucleici evidenţierea lor se face prin colorare cu bromură de etidiu
(EtBr), care se poate adăuga şi în gel, fiind astfel facilitată urmărirea migrării şi observarea la transiluminator. EtBr, colorant
cationic, se intercalează între perechile de baze ale acizilor nucleici; se formează un „sandwich“, iar ca urmare a excitaţiei cu
lumină UV λ=320 nm, se emite o radiaţie de fluorescenţă de culoare roşie-portocalie; concentraţia critică de EtBr este de
0,1-0,5 μg/ml. Limita de detectabilitate directă este de 1 ng (10 -9g) ADN. Se mai folosesc si alti compusi fluorescenți asa ca
SYBR Green I, care are proprietatea de a se poziționa în adâncitura mare a bazelor de ADN dublu catenar. Detecţia
fragmentelor de acizi nucleici separaţi electroforetic se poate efectua şi prin alte mijloace cum ar fi autoradiografia, în cazul
marcării cu radioizotopi 32P, 35S (radiaţie (β), 125I (radiaţie ϒ) şi, mai rar, 14C sau 3H (radiaţie β moale).
La acelaşi număr de perechi de baze per fragment, mobilitatea depinde de conformaţia moleculară, aşa după cum s-a
menţionat deja. O metodă de identificare a diverselor conformaţii recomandă utilizarea în gel a unor concentraţii crescânde
de EtBr. Cu cât există mai mult colorant, cu atât se va lega mai mult la ADN. Supraspiralarea spre stânga a moleculei
circulare va fi treptat despiralată, micşorându-se mobilitatea speciei respective, din cauza relaxării. La o concentraţie critică
de colorant, când nu mai există suprarăsuciri, viteza de migrare va atinge o valoare minimă limită. Un plus de EtBr va
provoca o supraspiralare spre dreapta, iar mobilitatea va creşte corespunzător.
In general, în condiţiile obişnuite de electroforeză (în câmp cu orientare unică la gradienţi de curent pînă la 100V),
moleculele mai mari de 20 kb prezintă practic aceeaşi mobilitate electroforetică, ele neputând fi separate, chiar dacă se
recurge la câmpuri mai slabe (reclamând zeci de ore pentru efectuarea electroforezei) şi la concentraţii scăzute de agaroză
(chiar 0,1%, ceea ce ridică probleme de consistenţă ia manipulare etc.).

Fig. 3. Dupa separarea completa, fragmentele

ADN sunt vizualizate prin utilizarea unui
colorant fluorescent precum bromura de etidiu
 GELURILE
Electroforeza se realizează într-o matriţă-suport reprezentată de gelul de agaroză, de poliacrilamidă, de acetat de celuloză,
de amidon, etc. Matriţele-suport (gelurile) îmbunătăţesc rezoluţia proteinelor şi a acizilor nucleici prin minimizarea difuziei
probei şi prin reducerea tulburărilor de conducţie electrolitică, ce pot apărea ca o consecinţă a căldurii generate în timpul
electroforezei.
Gelul separă proteinele (sau AN) de diferite mărimi, comportându-se ca o sită moleculară ce permite trecerea moleculelor
mai mici decât porii săi şi împiedică migrarea moleculelor mai mari. Cele mai des utilizate sunt gelurile de agaroză şi de
poliacrilamidă.
Avantajele gelului de agaroză:
dau o rezoluţie de bună calitate a speciilor de acizi nucleici,
sunt transparente în UV;
sunt uşor de realizat şi manevrat, ele sunt cele mai folosite.
Gelurile de agaroză, în funcţie de concentraţia agarozei, pot prezenta pori cu dimensiuni cuprinse între 50nm şi 200nm
sau chiar mai mult. Există câteva tipuri de agaroză:
 agaroza standard care are o temperatură de topire înaltă (85°—95°C), este folosită pentru a separa şi analiza fragmente
de ADN cu dimensiuni între lkb şi 25kb;
 agaroza cu punct de topire scăzut (low melting temperature agarose) are o temperatură de topire mai scăzută decât
agaroza standard şi este utilizată, în special, pentru recuperarea ADN din gel, acesta având un punct de topire (cca 65°C)
mult inferior temperaturii de topire a duplexului ADN. Acest tip de agaroză este utilizat pentru separarea unor fragmente de
ADN de 200 până la 800bp, concurând gelurile de poliacrilamidă.
Pentru obtinerea gelului de agaroză se folosesc urmatoarele componente:
apa deionizata,
TAE 50x (TBE, TPE),
Agaroza,
EtBr.
Gelurile de poliacrilamidă sunt utilizate pentru separarea proteinelor şi a moleculelor mici de acizi nucleici.
Gelurile de PA se formează prin polimerizarea vinilică a monomerilor de acrilamidă, CH2=CH-CO-NH2, în lanţuri lungi de
poliacrilamidă şi prin reticularea lanţurilor, în urma includerii unui comonomer (crosslinker) bifuncţional. Cel mai utilizat
comonomer bifuncţional este N,N’ metilen-bis-acrilamida, CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2. Astfel, concentraţia
de acrilamidă utilizată determină lungimea medie a lanţului de polimer, în timp ce concentraţia de bis-acrilamidă determină
gradul de reticulare. Porozitatea gelului de PA este determinată de lungimea catenelor de PA şi de gradul de legare
încrucişată care apare în timpul reacţiei de polimerizare. Diametrul mediu al porilor formaţi este determinat de concentraţia
monomerului de acrilamidă şi a crosslinkerului bifuncţional, astfel că diametrul porilor se poate ajusta.
Catenele de poliacrilamidă legate încrucişat pot fi folosite ca matriţe suport neutre pentru electroforeză, prin care se separă
fragmente de ADN dublu catenare sau monocatenare sau proteine. Principalul factor care determină separarea polipeptidelor
în timpul electroforezei în gel de poliacrilamidă este dimensiunea porilor gelului.
Pot fi preparate doua tipuri de geluri de poliacrilamidă, în funcţie de concentraţia de poliacrilamidă, care au aplicaţii
diferite:
 gelurile cu concentraţie uniformă în poliacrilamidă sunt folosite pentru a separa fie polipeptide cu greutăţi moleculare
apropiate, fie fragmente de ADN.
 gelurile cu gradient de poliacrilamidă sunt cele mai folosite în analiza secvenţei ADN, ele fiind eficiente în separarea
fragmentelor de ADN cu dimensiuni cuprinse între 5 şi 500bp, care diferă între ele printr-o singură pereche de baze. În
gelurile cu gradient de poliacrilamidă, concentraţia acrilamidei creşte (în timp ce mărimea porilor descreşte), în direcţia de
migrare a proteinei, permiţând separarea polipeptidelor dintr-o gamă largă de dimensiuni.

În funcţie de condiţiile de lucru, gelurile de poliacrilamidă sunt:

 geluri de PA dénaturante sunt folosite pentru separarea şi purificarea fragmentelor monocatenare de ADN. Aceste geluri
sunt polimerizate în prezenţa unui agent dénaturant (uree sau formaldehidă), care împiedică împerecherea bazelor din acizii
nucleici. Aceste geluri se folosesc, de exemplu, la izolarea sondelor de ADN marcate, la analiza produşilor de digestie ai
endonucleazei S1, la analiza produşilor de secvenţiere a ADN.
geluri de PA nedenaturante (neutre) sunt folosite pentru separarea şi purificarea fragmentelor de ADN dublucatenar,
pentru a detecta complexe ADN-proteine.
 Procentul de acrilamidă folosit în prepararea gelului este stabilit în funcţie de mărimea fragmentelor de ADN care trebuie
separate. Pentru obtinerea gelului de poliacrilamida se folosesc urmatoarele componente:
apa deionizata,
TBE 5x,
Acrilamida-Bisacrilamida (29:1),
APS (10%) ( Ammonium Persulfate - (NH4)2S2O8), TEMED (Tetramethylethylenediamine -(CH₃) ₂NCH₂CH₂N (CH₃) ₂).
APS-ul si TEMED-ul se adauga in acelasi timp - agent de polimerizare.
Coloratia cu argint
Solutii folosite la colorare: Fix/Stop: 1.8l H2O, 200ml acid acetic
Solutie developare: 2l H2O, 60g Na2CO3 –tinut la rece; inainte de folosire se adauga 3ml formaldehida (37%) si 400 µl
Tiosulfat (10mg/ml)
Solutie de colorare/evidentiere: 2l H2O, 2g AgNO3, 3ml formaldehida (37%).
 Etape principale pentru colorare:
- Fixare cu solutia Fix/Stop (30 minute, agitare usoara, solutia se recupereaza)
- Spalare cu apa deionizata (3 spalari, 2minute fiecare)
- Aplicarea solutiei de colorare (30minute, agitare usoara)
- Clatire usoara (10 secunde)
- Adaugare solutie developare (agitare usoara pana apar benzile)
-Stoparea reactiei prin adaugarea solutiei Fix/Stop (solutie recuperata in prima etapa)

Fig. 4. Incarcarea probelor in gelul de poliacrilamida.

Avantajele și dezavantajele gelului de PA faţă de cel de agaroză:
1.are o putere de separare mai mare, încât se pot separa molecule de ADN a căror lungime diferă printr-o pereche de baze, la
fiecare mie de perechi;
2.se pot încărca cantităţi mai mari de ADN decât în cele de agaroză;
3.ADN recuperat din gelurile de PA are puritate mare, calitate indispensabilă pentru continuarea unor experimente;
4.aceste geluri sunt mai dificil de preparat şi de mânuit decât cele de agaroză;
5.gelurile de poliacrilamidă sunt migrate vertical într-un câmp electric constant.
SISTEME TAMPON CONTINUE ŞI DISCONTINUE
Electroforeza poate fi realizată în condiţii continue, în care aceiaşi ioni din tamponul de migrare sunt prezenţi şi în gel, sau
în condiţii discontinue, în care ionii din tamponul de migrare sunt diferiţi de ionii din gel. În electroforeza continuă, se
utilizează un singur tip de tampon de migrare şi un singur tip de gel; în electroforeza discontinuă, se utilizează un gel de
concentrare (stacking gel) şi un gel de separare (resolving gel) a fracţiilor din probă, iar tamponul de migrare pentru gelul de
concentrare are forţă ionică şi pH, de obicei, cu 2 unităţi mai mici decât tamponul de migrare pentru gelul de separare.
În electroforeza continuă, proba este încărcată în gel într-un godeu de pe linia de start. Când se aplică un câmp electric,
moleculele din proba migrează prin gel şi se separă în funcţie de mobilitatea lor electroforetică în benzi înguste.
În electroforeza discontinuă, proba este concentrată de peste 100 de ori înainte de a pătrunde în gelul de separare. Se
foloseşte un gel de poliacrilamidă de concentrare cu forţă ionică scăzută şi pori mari, care este turnat în continuarea gelului
de separare. Proba este încărcată în gelul de concentrare, iar când câmpul electric este aplicat, moleculele migrează rapid
prin acest gel şi sunt concentrate într-o zonă foarte îngustă. Discontinuitatea tamponului de migrare face să apară un front
mobil de ioni care mătură gelul în urma proteinelor care se vor concentra ulterior. Când frontul de molecule concentrate
întâlneşte gelul de separare, care are pori mici, datorită pH-ului scăzut al tamponului, se produce deconcentrarea moleculelor
care vor intra în gelul de separare, în care rata lor de migrare depinde de dimensiunea lor şi de sarcină.
CONDIŢII DE DISOCIERE ŞI DE NON-DISOCIERE
Majoritatea proteinelor au o formă complexă globulară, datorită împachetării lanţurilor lor polipeptidice. Unele proteine au un singur
lanţ polipeptidic, dar majoritatea sunt compuse din câteva lanţuri polipeptidice.
În condiţii care nu determină disocierea lanţurilor lor polipeptidice, proteinele îşi menţin structura lor naturală, conformaţia lor, deci
şi funcţia. Astfel, se pot vizualiza enzime folosind coloranţi speciali cu care să se detecteze activitatea lor (zimograme).
În condiţii de disociere, în care proteinele sunt separate în subunităţile lor, se menţine doar structura primară, iar polipeptidele
individuale migrează independent. Agenţii folosiţi pentru disocierea proteinelor sunt detergentul ionic sodium dodecil sulfat (SDS),
care se leagă de proteine şi le anulează sarcina electrică intrinsecă, şi compusul neionic uree, care rupe legăturile de hidrogen şi
anulează interacţiile hidrofobe. Pentru denaturarea proteinelor sunt necesare concentraţii mari de uree (4-8M).
 PREPARAREA PROBELOR
În electroforeza acizilor nucleici şi a proteinelor, se include în probă un colorant (albastru de bromfenol sau roșu de crezol 0,25%) care
migrează mai repede decât componenţii probei, arătând frontul de migrare. De obicei, se adaugă în proba de analizat glicerol (30%), zaharoză
(40%) sau sucroză (10%) pentru a se asigura o densitate mai mare probei faţă de tamponul de migrare. Dacă electroforeza se desfăşoară în condiţii
de non disociere, trebuie să se lucreze cu grijă, pentru a se evita denaturarea probei.
Când se lucrează în condiţii de disociere, probele proteinice sunt de obicei fierte timp de câteva minute în SDS, pentru a se realiza denaturarea şi
apoi tratate cu 2-mercaptoetanol pentru a reduce punţile disulfidice, care ar lega încrucişat unele polipeptide. Totuşi, unele proteine membranare de
transport prezintă o modificare indusă de căldură în mobilitatea lor electroforetică, care se presupune că se datorează schimbării conformaţiei. De
aceea, când se analizează proteine de membrană este recomandat să se stabilească dacă temperatura ridicată produce artefacte în mobilitatea
electroforetică.

DETECTAREA PROTEINELOR ŞI A ACIZILOR NUCLEICI ÎN GELURI

Dintre coloranţii folosiţi pentru a vizualiza proteinele separate în geluri amintim: Amido black 10B, Bromphenol blue, Ponceau S, Lightgreen SF
şi Coomassie brilliant blue G-250 şi R-250. Insă, cea mai simplă şi cea mai folosită metodă de detectare a proteinelor în geluri este colorarea
directă cu Coomassie brilliant blue R-250. Gelurile sunt scufundate în soluţie metanolică de colorant şi acid acetic, care simultan precipită şi
colorează proteinele. Excesul de colorant este îndepărtat prin difuzie pasivă intr-un solvent. Metoda de colorare cu Coomassie brilliant blue R-250
permite ulterior, dacă este necesar, o altă colorare, mai convenabilă, cum ar fi coloraţia argentică.
Proteinele care au fost separate electroforetic pot fi detectate imunochimic în gel. În ultimul timp, se preferă însă transferul proteinelor separate
pe nitroceluloză şi ulterior se realizează detectarea imunochimică. Această metodă se numeşte Western blotting.
În cazul acizilor nucleici (ADN sau ARN), cea mai utilizată metodă de vizualizare este colorarea cu un compus fluorescent, bromura de etidiu.
Bromura de etidiu se leagă la ADN cu o specificitate de secvenţă foarte mică sau chiar fără specificitate, prin legături van der Waals. Colorantul
legat la ADN are o fluorescență mai intensă decât atunci când este liber în soluţie. Radiaţia UV de 254nm este absorbită de ADN şi este transmisă
colorantului, iar radiaţia de 302nm şi 366nm este absorbită chiar de colorant. În ambele cazuri, energia este remisă la 590nm în zona rosu-orange a
spectrului vizibil. Emisia fluorescentă a complexului ADN-bromură de etidiu este de 20-30 de ori mai mare decât cea a colorantului nelegat.
Другие красители интеркалирующие для визуализации НК. Краситель SYBR Gold (несимметричный цианиновый) подходит для окрашивания дву- и
одноцепочечной ДНК, РНК при проведении гель-электрофореза и визуализации геля при помощи стандартного УФ-трансиллюминатора. SYBR Gold более
чувствительный, чем SYBR Green II и бромистый этидий, быстро проникает в плотные агарозные гели, не подавляет активность эндонуклеаз, легко удаляется
переосаждением НК. Цвет оранжевый; длина волны возбуждения флуоресценции 300 нм (УФ), 495 (голубой);длина волны испускания флуоресценции 537 нм
(желтый);температура вспышки  87 °С; условия хранения -20 °C, в темном месте.
SYBR Green I связывается с ДНК, полученный комплекс поглощает голубой свет (λmax = 497 нм) и испускает зелёный (λmax = 520 нм). Краситель встраивается
преимущественно в двуцепочечную ДНК, но может также окрашивать одноцепочечную ДНК и РНК, но эффективность такого окрашивания снижается, особенно
для РНК. SYBR Green используется для количественного определения двуцепочечной ДНК при проведении ПЦР в режиме реального времени, для визуализации
ДНК при проведении гель-электрофореза, высокие концентрации используются для окрашивания НК в агарозном геле. Также SYBR Green может быть
использован для мечения ДНК внутри клетки для проточной цитометрии и флюоресцентной микроскопии. В этих случаях требуется обработка РНКазой.  Один из
наиболее чувствительных красителей для детекции дцДНК в агарозном и полиакриламидном геле при помощи УФ-трансиллюминаторов, гель-док систем и
лазерных сканнеров. Подходит для ДНК-типирования, ПЦР-анализов, детекции в режиме реального времени. Длина волны возбуждения флуоресценции, нм — 290,
380 (УФ), 497 (голубой); Длина волны испускания флуоресценции, нм — 520 (зеленый).
Краситель PAGE GelGreen. Окрашивание дцДНК, оцДНК или РНК в полиакоиламидном геле. Визуализация при помощи 254 нм УФ-трансиллюминатора с
фильтром для SYBR Green или трансиллюминатора с видимым светом (система Dark Reader) или 488 нм лазерная сканирующая гель-система.
 Spre deosebire de gelurile de agaroză, gelurile de PA nu pot fi turnate în prezenţa bromurii de etidiu pentru
că acest colorant inhibă polimerizarea acrilamidei. Totuşi, bromura de etidiu este folosită pentru a colora
geluri de PA după electroforeză, dar sensibilitatea metodei este scăzută, deoarece PA scade intensitatea
fluorescentei bromurii de etidiu. O metodă sensibilă de colorare a gelurilor de PA este coloraţia argentică,
care permite vizualizarea unor fragmente de ADN, care diferă între ele printr-o singură bază azotată.

Gel de poliacrilamida colorat cu azotat de argint

Tipuri moderne de electroforeză. Pentru depăşirea unor handicapuri legate de dimensiunea moleculelor
(fragmentelor) de separat sau pentru obţinerea unor răspunsuri rapide privind înrudirea anumitor secvenţe din genomuri
diferite, s-au căutat alte condiţii de efectuare a electroforezei.
S-a pornit de la observaţia că prin întreruperea câmpului electric, molecula de ADN alungită se relaxează ajungând la
configuraţia sa de „repaus“, timpul necesar acestui proces fiind dependent de dimensiunile moleculei respective. Pe baza
acestei observaţii s-au imaginat diverse alte sisteme de electroforeză. Intr-o primă variantă, a fost propusă electroforeză
bidimensională: moleculele din probă sunt supuse unei migrări clasice de la catod spre anod, ceea ce permite o primă
separare; ulterior, asupra gelului se aplică un alt câmp, cu aceiași parametri, dar perpendicular. Ca rezultat, fragmentele de
acizi nucleici obţinute prin digestia enzimatică nespecifică pot fi separate mult mai eficient decât prin electroforeză
monodimensională.
De aici până la ideea că schimbarea periodică a orientării câmpului electric va forţa moleculele de ADN de dimensiuni
mari să sufere alternativ o relaxare la întreruperea unui câmp urmată de o nouă alungire la aplicarea unui câmp nou nu a mai
fost decât un pas. Repetarea acestui „modul“ s-a dovedit a fi eficientă în separarea unor molecule având chiar câteva sute de
kpb. Întrucât moleculele mari sunt mai „leneşe“ din punct de vedere al reorientării comparativ cu moleculele mai mici,
atunci când în probă vor fi mai multe fragmente - în urma aplicării alternative a unor câmpuri cu durate şi tensiuni identice
— ele vor putea fi separate, aspectul final fiind dat de rezultanta multiplelor şi scurtelor zig-zaguri de migrare.
Astfel a apărut gel electroforeză în câmp pulsator (pulse field gel electrophoresis — PFGE) ai cărei parametri sunt:
 câmpul pulsator — constând în cel puţin două câmpuri care acţionează alternativ;
 intervalul de acţiune (de pulsare) — perioada de timp în care acționează fiecare câmp;
 unghiul de reorientare — unghiul sub care sunt aplicate câmpurile pulsatoare (de 90°, perpendiculare sau sub orice alt
unghi, în funcţie de geometria dispozitivelor de lucru, adică de geometria polilor/electrozilor);
 inversiunea câmpului — uneori, unghiul de reorientare poate fi de 180°, ceea ce presupune o mişcare de „recul“ a
moleculelor deja separate într-o primă etapă.
Fiecare dintre aceste sisteme prezintă anumite avantaje, legate de gradul de rezoluţie a benzilor, dar şi dezavantaje, mai
ales cele privitoare la logistica necesară.
 De fapt, sub sigla PFGE au fost elaborate de-a lungul anilor numeroase sisteme, desemnate -— la rândul lor — cu
acronime specifice (tabelul 2).

Varietățile ale sistemelor de PFGE:

1. Câmpuri omogene/neomogene și multiple;
2. Unghiuri de orientare în gel (60, 115, 120, 165) și
durata;
3. Gradient de potențial diferit;
4. Electrozi multiple, aranjați pe contur hexagonal;
5. Viteza de rotire.
 În mediu alcalin, structura ordonată bicatenară a acizilor nucleici se desface. Denaturarea moleculelor de ADN la pH>10, în
prezenţa NaOH 0,02M, la 37°C, care are loc conform schemei din fig.4, permite stabilirea conformaţiilor în care se află
moleculele respective în anumite condiţii sau ca urmare a tratamentelor la care sunt supuse.
De exemplu, după interacţiunea ADN cu droguri şi/sau factori fizico-chimici care induc apariţia unor legături covalente de
tip cross-link între catenele polinucleotidice, cele două lanţuri rămân solidare şi nu se mai desfac prin creşterea pH peste 10,
pe când moleculele în care nu s-au format legături covalente se vor denatura. Astfel, din ADN liniar dublu catenar vor
rezulta două monocatene liniare, din OC — o monocatenă liniară şi un cerc monocatenar, iar din CCI — două cercuri
monocatenare.
O aplicaţie a tehnicii de separare electroforeticâ, ce presupune aspecte legate de denaturarea-renaturarea dublului helix, cu
posibila apariţie de molecule hibride (heteroduplexuri) este aşa numita determinare a mobilităţii electroforetice a
heteroduplexurilor (heteroduplex mobility assay). Aceasta este una dintre cele mai rapide metode de decelare şi estimare a
divergenţei genetice dintre genotipuri şi se bazează pe observaţia că heteroduplexurile de ADN formate între secvenţele
înrudite prezintă, în geluri, preferenţial de poliacrilamidă <5% sau, mai rar, agaroză >3%, o mobilitate electroforetică redusă,
în funcţie de gradul de divergenţă. Protocolul de lucru prevede denaturarea termică a amestecului de secvenţe nucleotidice
înrudite (la concentraţii egale), în tampon adecvat şi renaturarea pe gheaţă. Heteroduplexurile formate au mobilitate
electroforetică intermediară faţă de catenele „parentale“.

OC (CD)

CCI (CCC)
 ELECTROFOREZĂ ÎN MINIGELURI DE AGAROZĂ
În ultimii ani, au fost descoperite metode pentru analiza unor cantităţi mici de ADN, în timp record, folosind minigeluri de
agaroză. Fiecare godeu din aceste minigeluri poate fi încărcat cu cca. 10-100ng de ADN (1ng= 10-9g ).
Minigelurile sunt folositoare, în special, când este nevoie de un răspuns rapid înainte de a se trece la etapa următoare a
procesului de donare. Pentru că minigelurile pot fi preparate dinainte, migrarea se face rapid (50—60 min), necesită cantităţi
mici de reactivi, se pot economisi timp şi bani. Gelul poate fi folosit de mai multe ori: se încarcă un anumit set de probe,
după migrarea, vizualizarea şi fotografierea gelului, probele sunt migrate excesiv până la trecerea lor în tamponul de
migrare. Minigelurile sunt folosite pentru analiza fragmentelor de ADN mai mici de 3Kb.
Factorii de care depinde migrarea ADN în geluri de agaroză:
greutatea moleculară a ADN — moleculele de ADN dublu catenar mari migrează prin gel mai încet decât cele mici,
datorită forţei de frecare mai mari şi deci faptului că îşi găsesc drumul mai greu prin porii gelului.
concentraţia agarozei — un fragment de ADN linear, de o anumită greutate migrează cu rate diferite, prin geluri de
agaroză de concentraţie diferită.
conformaţia ADN — formele circulare covalent închise (forma I) circular deschise (forma II) şi lineare (forma III) de
ADN migrează prin gelurile de agaroză cu rate diferite. În anumite condiţii, forma I de ADN migrează mai repede decât
forma III, în alte condiţii, ordinea este inversată. În majoritatea cazurilor, cel mai bun mod de a distinge între diferite forme
conformaţionale de ADN este încărcarea în gel a unei probe de ADN circular netratat şi a unei probe din acelaşi ADN, dar
linearizată prin digestie cu o enzimă de restricţie, care taie într-un singur situs.
prezenţa bromurii de etidiu în gel şi în tampoanele de electroforeză -intercalarea bromurii de etidiu determină scăderea
numărului de sarcini negative a dublei catene de ADN. Rata de migrare a complexului colorant-ADN linear prin gel este
întârziată cu cca. 15%.
voltajul - la tensiune scăzută, rata de migrare a fragmentelor ADN linear este proporţională cu voltajul aplicat. Pe măsură
ce intensitatea câmpului electric este mărită, mobilitatea fragmentelor de greutate moleculară mare creşte diferenţiat. De
aceea, puterea de separare a agarozei descreşte pe măsură ce tensiunea creşte. Pentru a obţine cea mai bună rezoluţie a
fragmentelor de ADN mai mari de 2Kb, gelurile sunt migrate la 5-8V/cm.
tipul de agaroză.
 ELECTROFOREZA ÎN GEL DE POLIACRILAMIDĂ CU SDS – SODIUM DODECYL SULPHATE
POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS (SDS-PAGE)
O tehnică de separare a proteinelor, în funcţie de greutatea lor moleculară, este SDS-PAGE. În sistemele SDS-PAGE, se
folosesc tampoane care conţin un detergent, SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), care are proprietatea de a denatura proteinele.
În soluţii de SDS, majoritatea proteinelor alcătuite din multiple subunităţi sunt denaturate, proteina disociindu-se în
subunităţile componente.
Fiecare moleculă de SDS este încărcată negativ. La pH neutru, majoritatea proteinelor sunt învelite uniform cu SDS, care
anulează încărcătura intrinsecă a proteinei, astfel că sarcina globală a complexului SDS-proteină este determinată de SDS.
Ca urmare, toate complexele SDS-proteină au formă filamentoasă şi densităţi de sarcină electrică aproape identice. De aceea,
mobilitatea electroforetică este dată de greutatea lor moleculară. Spre deosebire de electroforeza în gel de agaroză, unde
probele sunt încărcate la anod, în cazul SDS-PAGE probele sunt încărcate la polul catodic al gelului. Sub influenţa câmpului
electric, complexele SDS-proteine migrează spre anod, pătrunzând în gel sub forma unei benzi înguste. Pe parcursul gelului,
proteinele mari au o rată de migrare superioară proteinelor mici, datorită proprietăţii de sită moleculară a gelului.
Pentru a determina greutăţile moleculare ale componentelor unei probe, se încarcă în gel, în paralel cu acestea, şi proteine
standard de greutate moleculară cunoscută, iar mobilităţile electroforetice se compară.
CONCENTRAREA IZOELECTRICĂ A PROTEINELOR (ISOELECTRIC FOCUSING)
Proteinele sunt molecule amfoterice, încărcătura lor netă depinzând de pH-ul mediului. Încărcătura lor este determinată, în special,
de lanţurile de aminoacizi de la suprafaţă, grupările ionizabile -NH2 şi -COOH. La pH foarte scăzut, majoritatea proteinelor sunt
încărcate pozitiv şi când pH-ul este crescut gradat încărcătura netă devine progresiv negativă. Pentru fiecare proteină, există un pH la
care încărcătura netă este egală cu zero. Această valoare a pH-ului se numeşte punct izoelectric. Pentru majoritatea proteinelor, această
valoare este cuprinsă între pH 4 şi pH 7.
Concentrarea izoelectricâ a proteinelor este o tehnică electroforetică prin care se separă proteinele pe baza punctelor lor
izoelectrice. Trăsătura specifică a concentraţiei izoelectrice este că electroforeza este realizată într-un gradient de pH staţionar şi
proteinele migrează spre o poziţie de echilibru. În cursul electroforezei, componentele probei sunt concentrate sub formă de benzi
intense, în poziţii corespunzătoare punctului lor izoelectric. Concentrarea izoelectrică furnizează informaţii despre numărul
componentelor din amestec şi permite determinarea punctului izoelectric al proteinelor din amestec.
Separarea electroforetică prin această metodă este realizată în gradient de pH continuu, ce creşte de la anod la catod. Când o proteină
este introdusă într-un asemenea gradient, ea va fi respinsă de unul dintre electrozi în funcţie de încărcătura sa electrostatică, astfel încât
ea va migra spre o poziţie din gradientul de pH, în care ea are o sarcină netă egală cu zero. De exemplu, când o proteină este plasată
aproape de anod, unde pH-ul este mai scăzut decât valoarea punctului său izoelectric, proteina devine încărcată pozitiv şi va migra, în
consecinţă, spre catod. Pe măsură ce migrează, proteina modifică gradientul de pH şi pierde progresiv încărcătura sa pozitivă. Dacă
proteina s-ar deplasa prin difuzie din poziţia corespunzătoare punctului său izoelectric, ea va deveni încărcată electric şi va fi deplasată
înapoi în poziţia corespunzătoare punctului său izoelectric. Datorită acestui efect, proteina este concentrată într-o bandă foarte îngustă.
 Concentrarea izoelectricâ necesită formarea unui gradient continuu şi stabil între cei doi electrozi. Asemenea gradiente
nu pot fi formate, însă, de soluţii tampon convenţionale cu pH-uri diferite. Primele tampoane adecvate acestui tip de
electroforeză cuprind o serie de compuşi care conţin grupe poliamino şi policarboxil, care poartă numele generic de
amfoliţi. Ca şi proteinele, ei sunt amfoterici. Sub acţiunea unui câmp electric, ei vor migra şi se vor concentra la un nivel
corespunzător punctului lor izoelectric. Aceşti compuşi au o capacitate de tamponare foarte mare la punctul lor izoelectric şi
crează, la locul unde sunt concentraţi, o zonă cu localizare constantă de un anumit pH. Sunt disponibile în comerţ amestecuri
de amfoliţi care permit obţinerea fie a unor gradiente de pH de domeniu larg (de exemplu, a unor gradiente de pH între 3,5 şi
9,5), fie a unora de domeniu îngust.
Concentrarea amfoliţilor este mai rapidă decât concentrarea probelor de proteine, iar timpul necesar proteinelor pentru a
ajunge în poziţia corespunzătoare punctului lor izoelectric creşte direct proporţional cu mărimea moleculei.
Concentrarea izoelectrică a proteinelor este realizată în geluri orizontale de agaroză sau de poliacrilamidă foarte subţiri.
Pentru a îmbunătăţi rezoluţia şi a scurta timpul de migrare, se utilizează câmpuri electrice puternice. Concentrarea
izoelectrică a proteinelor în prezenţa ureei este utilizată pentru a determina punctul izoelectric al subunităţilor proteinice.
ELECTROFOREZA BIDIMENSIONALĂ
In general, prin electroforeză, proteinele sunt separate pe baza mărimii sau a încărcăturii lor electrice. Folosind doar
unul din cele două principii de separare, este probabil ca mai multe proteine să comigreze şi să fie vizualizate ca o singură
bandă. Asemenea situație este de nedorit, pentru că mascarea complexităţii proteinelor studiate poate duce la o interpretare
greşită a rezultatelor. Pentru a evita această situaţie se foloseşte electroforeza bidimensională, care se realizează după două
direcţii de migrare. Se pot obţine rezoluţii bune când se realizează două electroforeze care separă proteinele pe principii
complet diferite. De exemplu, întâi se pot separa proteinele în funcţie de punctul lor izoelectric, prin metoda concentrării
izoelectrice a acestora, urmată apoi de o separare în funcţie de greutatea lor moleculară, prin metoda SDS-PAGE.
Moleculele de acizi de toate dimensiunile prezintă densităţi de sarcină foarte asemănătoare la valori de pH apropiate de
neutralitate, astfel încât separările bazate pe diferenţele de sarcină sunt rareori satisfăcătoare. La valori acide ale pH-ului
bazele azotate contribuie cu o uşoară diferenţă de sarcină, încât până la urmă, sarcina netă depinde şi de lungimea lanţului şi
de compoziţia în baze. Fenomenul de împerechere a bazelor dispare la valori scăzute ale pH-ului, iar adaosul de agenţi
denaturanţi (uree sau formaldehidă) distruge structura terţiară şi secundară. Lucrul la pH foarte scăzut, în condiţii de
temperatură înaltă, are de asemenea un efect denaturant.
 ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ ALCALINĂ
Gelurile de agaroză alcalină sunt migrate la pH mare, ceea ce face ca fiecare rest de timidină şi de guanină să piardă un
proton, fiind împiedicate astfel formarea legăturilor de H ale acestora cu bazele lor complementare, adenina şi timina.
ADN denaturat este menţinut sub formă monocatenară şi migrează printr-un gel de agaroză alcalină, în funcţie de mărimea
sa.
Gelurile de agaroză alcalină sunt folosite pentru a măsura mărimea primei şi a celei de-a doua catene de ADNc sintetizate
de revers-transcriptază; analiza dimensiunii catenei de ADN după digestia hibrizilor ADN-ARN cu nucleaza SI, etc.
Pentru a obţine un gel de agaroză alcalină se procedează ca şi în cazul unui gel obişnuit căruia, exact înainte de a fi turnat
în taviţă, i se adaugă un tampon alcalin (NaOH, EDTA) într-o anumită proporţie. Soluţiile de NaOH şi EDTA intră şi în
compoziţia tamponului de încărcare.
După migrare, are loc neutralizarea gelului într-o soluţie de Tris-HCl şi NaCl. Gelul neutralizat este apoi colorat în
bromura de etidiu 0,5pg/ml. Motivul pentru care bromura de etidiu nu se adaugă în gel, în cazul acestui tip de electroforeză,
este că fluorocromul nu ÎN
ELECTROFOREZĂ se leagă
CÂMP la ADN, la pH-ulPULSATORIU
ELECTRIC ridicat al tamponului de migrare.
— PULSE FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)
Fragmentele de ADN mai mari de 40Kb nu pot fi separate eficient
folosind un câmp electric constant pe gel de agaroză. Aceste fragmente
pot fi însă separate prin electroforeză în câmp electric pulsatoriu (PFGE
— Pulse Field Gel Electrophoresis), în care câmpul electric este
schimbat periodic pe două direcţii diferite cu pulsaţii de 0,1 până la 1000
de secunde sau chiar mai mult. Această metodă permite separarea
moleculelor de ADN de până la 5 Mb în lungime. În cursul migrării,
separarea se produce datorită faptului că timpul necesar moleculelor de
Fig. 1 — PFGE - schema principiului de funcţionare a ADN pentru a-şi schimba direcţia de migrare, ca răspuns la fluctuaţia
aparatului de electroforeză. A şi B reprezintă două seturi câmpului electric, depinde de mărimea sa: moleculele mai mici se pot
de electrozi. Când electrozii A (- şi +) sunt activaţi ADN reorienta mai repede şi de aceea se pot mişca prin gel mai repede ca
migrează dinspre anod spre catod, după cum indică prima moleculele mai lungi. Principiul general al PFGE este schiţat în figura 1.
săgeată. Apoi aceşti electrozi sunt dezactivaţi şi activaţi Alternarea cu regularitate a câmpurilor A şi B are loc pe întregul curs
electrozii din setul B (- şi +). ADN va migra dinspre anod
spre catod, dar pe o direcţie perpendiculară pe prima (a
al electroforezei, făcând ca ADN să migreze după o traiectorie în zig-
doua săgeată). In continuare, după dezactivarea setului de zag, după cum se observă şi în figură. Intervalul la care polaritatea
electrozi B, este reactivat setul A de electrozi, ADN va câmpului este schimbată poate varia între câteva secunde şi câteva ore,
migra după direcţia iniţială (din Sambrook & Russell, direct proporţional cu mărimea fragmentelor de ADN care trebuie
2001) separate.
 ELECTROFOREZA ÎN CÂMPURI TRANSVERSALE ALTERNATIVE — TRANSVERSE ALTERNATING
FIELDS ELECTROPHORESIS (TAFE)
În cazul acestei variante, migrarea se face pe verticală, gelul este încadrat de două perechi de electrozi (A şi B) şi este
susţinut de două stripsuri şi de densitatea tamponului. ADN migrează după o traiectorie generală dreaptă, iar câmpul electric
este uniform de-a lungul gelului. Unghiul dintre orientările celor două câmpuri electrice alternative este de 110° în dreptul
godeurilor, dar este mai mare în partea opusă godeurilor.

Fig. 2 — TAFE - schema principiului de funcţionare a aparatului de

electroforeză. A şi B (•) reprezintă două seturi de electrozi, săgeţile
reprezintă direcţia de migrare a ADN, (din Sambrook & Russell,
2001).

ELECTROFOREZA ÎN CÂMP INVERSAT — FIELD INVERSION GEL ELECTROPHORESIS (FIGE)

Această metodă are un principiu foarte simplu: în timpul migrării, câmpul electric generat între cei doi electrozi se
inversează cu regularitate, iniţial scoţând ADN din godeu, ulterior readucându-1 spre godeu. Unghiul dintre cele două
câmpuri electrice alternative este de 180°. Timpul în care acţionează câmpul electric ce determină migrarea ADN înainte
este mai mare decât cel în care ADN migrează înapoi, spre godeu, astfel că migrarea netă a ADN este spre înainte,
departându-se de godeu.

Fig. 3 — FIGE-schema principiului de funcţionare a

aparatului de electroforeză. A şi B reprezintă două seturi
de electrozi, săgeţile reprezintă direcţia şi sensul de
migrare a ADN, cele două linii reprezintă cei doi electrozi,
(după Sambrook & Russell, 2001).
 ELECTROFOREZA ÎN GELURI ROTATIVE
În acest caz, în loc să se alterneze polaritatea câmpului electric, se plasează un gel pe o platforma rotativă care se va
deplasa între două poziţii (A şi B), între care unghiul este de 120°, intr-un câmp electric constant (fig. 4).

Fig. 4 — Electroforeza rotativă- schema principiului de funcţionare a aparatului

de electroforeză. A şi B reprezintă două poziţii între care este deplasat gelul, cele
două linii reprezintă cei doi electrozi, (după Sambrook & Russell, 2001).

METODA CHEF (CONTOUR-CLAMPED HOMOGENOUS ELECTRIC FIELD)

Este o tehnică în care câmpul electric este omogen (fig. 5). Se folosesc 6 grupe de cite 4 electrozi dispuşi hexagonal,
permiţând obţinerea unui unghi de reorientare de 120°. Migrarea permite separarea fragmentelor de 12Mb.
Factorii care influenţează PFGE includ timpul unei pulsaţii, intensitatea câmpului, unghiul dintre câmpurile electrice
aplicate (in general 105-165°, dar şi 90°) şi temperatura (4—15°C), compoziţia soluţiilor tampon, tipul şi concentraţia de
agaroză. În practică, majoritatea acestor variabile sunt în general menţinute, iar o rezoluţie satisfăcătoare este obţinută prin
creşterea timpului unei pulsaţii pentru separarea moleculelor mari şi scăderea acestuia pentru separarea moleculelor mici.

Fig. 5 — CHEF- schema principiului de funcţionare a

aparatului de electroforeză. A şi B reprezintă doua
seturi de electrozi ( ), săgeţile reprezintă direcţia de
migrare a ADN, (după Sambrook & Russell, 2001).