Metode

moleculare
Electroforeza în gel
şi marcarea cu EtBr
Electroforeza în gel şi
marcarea cu EtBr
 Separarea electroforetică
Definiţie
Electroforeza în gel este o metodă de separare a (macro)moleculelor
(ex. ADN, proteine) în funcţie de mărime, structură, încărcătură
electrică (precum şi alte proprietăţi fizice).

se realizează într-o
matrice poroasă (gel),
sub influenţa curentului electric

electrophoresis (lb. engleză)

electro ≡ electricitate phoros (lb. greacă) ≡ “to carry across”

Mărimea (macro)moleculelor separate se determină prin

comparare cu molecule de mărimi cunoscute.
Separarea electroforetică
Definiţie
Electroforeza în gel este o tehnică în cadrul căreia
(macro)moleculele sunt forţate să străbată o
matrice poroasă (i.e. gelul), sub influenţa
curentului electric.
–
Mişcarea este determinată de curentul electric (V,
mA) aplicat electrozilor poziţionaţi la ambele
capete ale gelului.
–
Separarea/distanţa străbătută în unitatea de timp
şi implicit viteza de deplasare depind de:
• (macro)moleculelor ce trebuie separate –
mobilitatea electroforetică determinată în
principal de încărcătura electrică şi mărime, dar
şi de configuraţia spaţială etc.
• mediului de electroforeză – tipul şi concentraţia
gelului şi a soluţiei tampon
• intensitatea/tensiunea c.e. aplicat.
Separarea electroforetică
Principiu
... proces similar trecerii particulelor printr-o sită

(moleculară)

O gamă largă de macromolecule biologice

importante (ex. aminoacizi, peptide, proteine,
nucleotide şi acizi nucleici) posedă grupări ionizate
care, la orice valoare a pH-ului, sunt prezente în
soluţii sub formă de cationi (+) sau anioni (-).
–
Sub influenţa curentului electric particulele vor
migra înspre catod (-) sau înspre anod (+), în funcţie
de natura încărcăturii.
–
Sarcina electronegativă a ADN-ului este dată de
moleculele de zahar şi radicalii fosfaţi din
compoziția nucleotidelor.
Separarea electroforetică
Principiu
Separarea electroforetică
Principiu

Viteza de deplasare a moleculelor în interiorul

aceleiaşi matrici poroase (i.e. gelul de agaroză)
este determinată proprietăţile molecululelor
respective.
–
Matricea poroasă (gelul) are rolul de a încetini
mişcarea (macro)moleculelor–apare forţa de
frecare. Încetinirea mişcării determină separarea
particulelor în funcţie de mărime, moleculele de
ADN de dimensiuni mici străbătând mai uşor
matricea (gelul) comparativ cu cele de
dimensiuni mari.
–
Tehnica este relativ simplă şi rapidă.
Separarea electroforetică
Principiu

Particulele încărcate electric (ionii)

se deplasează între doi electrozi în
funcţie de încărcătura electrică:
• cationii (ionii +) spre catod
(electrodul -)
• anionii (ionii -) spre anod
(electrodul +).
–
Moleculele se deplasează prin
mediul poros (reprezentat de gel).
–
Viteza (rata) de migrare depinde în
principal de mărimea moleculelor
(fragmentele de ADN).
 Electrof. în gel de agaroză
Materiale și metodă

Proba analizată (produsul PCR etc.)

Agaroză
Soluţie tampon (buffer) de electroforeză
Soluţie tampon de încărcare (loading buffer)
ADN standard (marker/ladder)
Soluţie de EtBr
pregătirea gelului
încărcarea probelor
+ migrarea (electroforeza ppz.)
marcarea
Flacon vizualizarea
Cuptor cu microunde
Tava pentru gel (rack/gel casting tray)
Matriţă pentru godeuri (comb)
Pipete micrometrice şi vărfuri sterile
Cuva (tancul) de electroforeză
Sursa de c.e.
Mănuşi
Recipient pentru vopsire
Aparat de vizualizare (transiluminator)
şi înregistrare (fotografiere)
Electrof. în gel de agaroză
Materiale și metodă
Încărcarea probelor în gel
Separarea ppz.

Separarea se poate desfăşura la tensiuni diferite, în

funcţie de gradul de separare dorit şi de timpul
disponibil.
–
Orientativ, valoarea voltajului aplicat este de ~5-10
V/cm, raportat la distanţa dintre cei doi electrozi).
Odată cu creşterea voltajului aplicat, rata de migrare
creşte. Rata de migrare a fragmentelor mari creşte
mai ult comparativ cu cea a fragmentelor mai mici.
–
În cazul produşilor PCR mici, separarea este mai
bună şi benzile sunt mai clare dacă migrarea se face
rapid. Migrarea la tensiuni mici determină difuzarea
macromoleculelor în gel, iar separarea este mai
slabă.
Separarea ppz.
 Separarea ppz.

Soluţie tampon de încărcare (loading buffer)

Marcarea (staining)
 Marcarea (staining)
Pentru vizualizarea/identificarea moleculelor separate
prin electroforeză este necesară marcarea acestora.

Substanţe de intercalare
• bromură de etidiu (EtBr), GelRed,
GelGreen, SYBR Safe etc.
Marcarea • silver staining
Sonde de hibridare
• izotopi radioactivi (32P)
• antigeni/anticorpi (digoxigenina)
• fluorocromi
Marcarea (staining)

EtBr are proprietatea de a se intercala în cadrul

unei molecule de ADNdc. Odată cu intercalarea,
fluorescenţa moleculeor de EtBr creşte
semnificativ.
–
EtBr este o substanţă mutagenă/teratogenă, deci
trebuie manipulată cu foarte mare atenţie.
–
Utilizare:
• se poate adăuga la pregătirea gelului
• după migrare gelul este introdus într-o soluţie
de EtBr.

concentraţie finală:
Soluţie stoc • 0,5 µg/ml
10 mg/ml • 1 µg/ml
• etc.
Marcarea (staining)

Cuvă şi soluţie
de marcare
cu EtBr
 Vizualizarea

Moleculele de EtBr devin florescente în prezenţa

luminii (radiaţiei) UV.
–
Cantitatea minimă de ADN care poate fi detectată
prin fotografierea gelurilor marcate cu EtBr este
de aproximativ 2 ng dispuse într-o bandă de 0,5
cm lăţime. Dacă într-o bandă de această
dimensiune sunt mai mult de 500 ng ADN, banda
este supraîncărcată iar rezultatul vizualizării este o
pată (smearing).
Rezultatele

• Sisteme digitale
• Camere foto speciale
 Interpretarea rezultatelor

Benzile corespunzătoare unor probe diferite care parcurg aceeaşi

distanţă conţin molecule care au străbătut gelul cu aceeaşi viteză–
moleculele au (auproximativ) aceeaşi mărime.
Interpretarea rezultatelor
Interpretarea rezultatelor
Interpretarea rezultatelor