CURS BIOFIZICA

4 si 5

Şef lucrări
dr. Irena
GRIEROSU
METODE FIZICE ŞI BIOFIZICE CU
APLICAŢII ÎN MEDICINĂ

1. Metode electroforetice
2. Metode cromatografice
3. Metode de difracţie cu raze X
4. Metode de microscopie electronică
(de balaiaj, prin transmisie)
5. Tipuri de MO
I-A. Electroforeza
Electroforegrama
 Explicarea termenilor
Fe = Ff
Fe = forţa electrică
ZeE= 6rv
Ff = forţa de frecare
Ze E Ze = sarcina electrică a
v= particulei
6r
E = intensitea câmpului
electric
+ - η = viscositea mediului
+ Fe Fη -
- - r = raza particulei
+
+ - v = viteza particulei
+ -
I-B. Electrofocusarea pH
izoelectric
I-C. Imunelectroforeza
Reactie
specifica
Ag-Ac
 II. Cromatografia
2 faze

SCOP = separarea
componentelor
unui amestec

1. Fază staţionară
- solid
- lichid
- amestec solid / lichid
2. Fază mobilă
- lichid
- gaz
 4 tipuri de tehnici
cromatografice:
1. de adsorbţie
2. prin schimb ionic
3. prin permeaţie (în
funcţie de forma şi
marime)
4. de afinitate

Cromatografie prin permeatie

Cromatografie de permeaţie
Cromatografie de afinitate Imunoabsorbant – matrice solidă
care conţine legat covalent (de
obicei) un Ag.

Mixtura de Ac care urmează a fi

separată este aplicată la capătul
superior şi va trece prin coloana
staţionară. Doar Ac specifici Ag din
coloana staţionară for forma
complexe Ag-Ac şi vor fi reţinuţi.

Se adaugă o soluţie tampon care

conţine o cantitate crescută de
săruri şi / sau pH scăzut pentru a
rupe legăturile necovalente dintre
Ag şi Ac său specific.

Se adaugă o soluţie de eluţie care

conţine Ag în exces. Această
competiţie cu imunoabsorbantul pt.
Ac determină elib. Ac în fază fluidă.

Ac eliberaţi în soluţie se colectează

într-un recipient.
III. Difracţia cu raze X
BC + BD = nλ
2d sinθ = n∙λ BC = BD = AB sin θ
ecuaţia Bragg AB = d
2d sinθ = n∙λ

A
C D
d

B
Condiţia maximului de interferenţă se realizează pentru
cazul în care diferenţa de drum a celor două raze este un
multiplu întreg al lungimii de undă, adică BC + BD = nλ.
J. Watson şi F. Crick - premiul Nobel în Medicină şi Fiziologie
1962 împreună cu M. Wilkins: stabilirea structurii ADN-ului
prin difracţie cu raze X
 Difracţia cu raze X

Cristalul este rotit usor, si doar pentru anumite unghiuri θ se obtin maxime de
difractie, care vor fi inregistrate pe filmul fotografic. Rezolutia metodei = 5 - 6 Å.
Imaginea de difractie, inregistrata pe film, corespunde pozitiei atomilor din reteaua
cristalina.
Etapele de studiu ale unei proteine:
 a) difractograma (raze X)
 b) harta densitatii electronice
(computer)
 c) modelul conformational al structurii
proteinei
 Structura primară,
secundară, terţiară şi
cuaternară a proteinelor
Structura
primară

Structura secundară

Structura
terţiară

Structura
cuaternară
α - helix
β - pliat
Trioz-fosfat-
izomeraza
Funcţii generale ale
proteinelor
1. Enzime: catalizează ruptura
sau formarea unor legături
covalente (mii)

Ex:

- pepsina

- ADN-polimeraza
2. Proteine structurale:
susţinerea mecanică a celulelor şi a
ţesuturilor

Ex:
- colagenul şi
elastina
- tubulina şi
actina
- α- keratina
3. Proteine de transport:
transportul unor molecule mici sau a unor
ioni

Ex:
- Hb. - oxigen
- Transferina - fier
- Albumina - lipide
- Proteine de
transport
membranar: H2,
glucoză, Ca2+
4. Proteine motrice: generează
mişcare în celule şi ţesuturi

Ex:
miozina,
kinezina,
dineina
5. Proteine de stocare:
a unor molecule mici sau ioni

Ex:
- feritina
- ovalbumina
6. Proteine semnal: transmit
semnale de la celulă la celulă
Ex: - hormoni
- factori de creştere: NGF, EGF
7. Proteine receptoare:
detectează semnale şi le
transmit maşinăriei celulare

Ex:
- rodopsina
- receptorul
pentru
acetilcolină al
celulei
musculare
primeşte
semnale
chimice
8. Proteine reglatoare ale
genelor: se leagă de ADN pentru a
induce sau a inhiba expresia genelor
9. Proteine cu rol particular

Ex:
- proteinele antigel ale
peştilor de la polii
Nord-Sud
- proteine fluorescente
- proteine cu funcţie
de adeziv
IV. Metode de microscopie
electronică
Principiul fizic al microscopiei
electronice
 Dacă viteza creşte,  descreşte,
puterea de rezoluţie creşte:

p = 1/d = n sinu / 
 = h/p = h/mv
unde
p = putere de rezoluţie
d = distanţa minimă între 2 puncte care poate fi distinsă
separat
n = indicele de refracţie
u = unghiul

Un fascicul de electroni accelerat:

- la 10 kV,  asociat este 130 nm (13 Å),
- la 100 kV,  asociat este 30 nm (3 Å)
Semnalele emise de un material
supus unui bombardament
electronic
MET MEB
microscop electronic prin transmisie microscop electronic cu baleiaj
MICROSCOPUL
ELECTRONIC
DE BALEIAJ

Rezoluţia este mai

scăzută decât în MET.

Imagini pseudo-3D.
 Microscopul electronic de baleiaj
Principiu
Un spot de electroni baleiază
suprafaţa probei.
Electronii secundari de energie mică
(0-50 eV), emişi în urma împrăştierii
neelastice, sunt captaţi şi, după o
procesare electronică, formează
imaginea pe un ecran fluorescent, sau
pe o peliculă fotografică.
Luminozitatea fiecărui punct al imaginii
depinde de numărul de electroni
secundari înregistraţi din poziţia
corespunzătoare a probei.
Se obţin imagini ale suprafeţei unei
celule, a unui microorganism sau a unui
ţesut, de unde impresia de imagine
tridimensională.
Mărire maximum 200 000 x, cu o
rezoluţie de 3,5 nm.
Alcatuire
Tun electronic - fascicol de
electroni cu diametrul de circa
50 nm.
2-3 lentile condensoare -
diametrul până la 2 nm (spot mic,
deoarece secţiunea sa determină
pe imagine un singur punct).
O lentilă condensoare care
reglează dimensiunea finală a
spotului şi focalizează imaginea
pe ecran.
Electronii secundari sunt captaţi
de un detector de Al care acoperă
un cristal de scintilaţie al unei
sonde de scintilaţie, semnalul
obţinut este amplificat electronic şi
formează imaginea pe ecranul unui
tub catodic sau al unui monitor.
Etapele de transformare in Eritrocite umane îmbătrânite
echinocit
?
?
?
!
 E. coli

ochi de
muscă

limfocit
 Contact entre un
Contact entre un
lymphocyte
lymphocyte ( en jaune ) et
(immunofluorescence
une cellule dendritique
verte) et une cellule
présentatrice d'antigène (en
dendritique présentatrice
bleu ). Microscopie
d'antigène. Microscopie à
électronique à balayage.
contraste de phase
Pereche de cromosomi umani, X şi Y, după
Nature (2003) 423: 810-812.
?
?
Fibre de sticla
Cristale componente ale ceramicii (x 4000); cu verde -
particule îmbogăţite în calciu, în albastru - particule
care conţin fosfor. © Didier COT/IEM/CNRS
- granule de polen
MICROSCOPUL ELECTRONIC
PRIN TRANSMISIE
 relatia lui de Broglie:
Λ = h/p = h/mv
Se folosesc electronii împrăştiaţi neelastic transmişi prin probă
(preparatul de examinat).

Înainte de a ajunge la preparat (probă) electronii proveniţi de la sursa

de electroni (tunul de electroni) sunt focalizaţi de două lentile
condensor (electromagnetice). Ei sunt mai mult sau mai puţin absorbiţi
(spunem despre preparat că este mai mult sau mai puţin dens pt.
electroni).

Utilizează marcheri electrono-opaci.

Imaginea se formează în spatele preparatului pe un ecran fluorescent.

Mărirea, raportul dintre mărimea imaginii/mărimea obiectului,

rezoluţia, cu atât mai bună cu cât  este mai mică şi apertura mare
(care, însă, măreşte aberaţiile de sfericitate); la diafragme de
20-70 m rezoluţia este 0,1-0,2 nm.

Luminozitatea imaginii depinde de numărul de electroni transmişi,

intensitatea fascicolului incident, caracteristicile probei.
MET - PMN

MET - limfocit
 mitocondrie

aparat Golgi

membrana

nucleu

reticul
endoplasmic rugos
 MO
Limfocit - MEB

MET
Hematii

MO AFM

MEB MET
 TIPURI DE
MICROSCOAPE OPTICE
1 MICROSCOPUL OPTIC

Pentru a creste P (descreste ε):

- descreste  (390 - 720 nm)
- creste n
 V. lucrarea practica Legile osmozei
difuziunea si osmoza

Cellules turgescentes  ------->   Cellules

plasmolysées
2 MICROSCOPUL OPTIC
cu imersie
3 Microscopul polarizant
- lumina polarizata
Pune in evidenta fenomenul de
birefringenta a unor structuri, - 2 nicoli
expresie a anizotropiei acestora.
- Cruce de Malta
4 Ultramicroscopul (microscopul
cu fond intunecat)

Iluminarea este din lateral.

Condensorul este de tip cardioid sau
paraboloid.
Se bazeaza pe fenomenul Tyndall
(de difuzie a luminii).
Fenomenul Tyndall
5 Microscopul cu contrast de faza
Prezinta o lama
sfert de unda
care transforma
defazajul luminii
imperceptibil
ochiului uman
intr-o variatie de
intensitate
celula epiteliala perceptibila
vizual
(transforma deci
un contrast de
faza in contrast
de amplitudine).
Permite
observarea
ciclul celular celulelor
necolorate.
6 Microscopul cu fluorescenta

Principiul fenomenului de
fluorescenţă:
1. Energia este absorbită de
un atom
2. Electronul sare pe un nivel
superior de energie.
3. Ulterior, electronul revine
la starea initiala si emite un
foton – fenomenul de
fluorescenţă
- utilizează markeri fluorescenţi -
 O sursa UV.
Ecran filtrant care lasa sa treaca doar radiatiile
UV excitatoare ale fluorescentei.

celule epiteliale
GFP - Green Fluorescent Protein The Nobel Prize in Chemistry 2008
238 aa, 26.9 kDa was awarded jointly to Osamu
Shimomura, Martin Chalfie and
Do you Roger Y. Tsien "for the discovery
Nobel Chemistry 2008 and development of the green
remember?
fluorescent protein, GFP".
Bibliografie selectivă

 Aurengo A., Grémy F., Petitclerc T. - Biophysique, Médecine-Sciences

Flammarion, Paris, 1998.
 Dimoftache C., Herman S. – Principii de Biofizică umană, Ed. Universitară
“Carol Davila”, Bucureşti, 2003.
 Duncan G, Physics in the Life Sciences, Blackwell Scientific Publications,
The Alden Press, Oxford, 1990.
 Durand A., Escanyé J-M., Naoun A. La biophysique en 1001 QCM, Ed.
Ellipses, 2004.
 Goldfarb D. Biophysics DeMYSTiFieD. McGraw-Hill Companies, 2011.
 Herman S. Aparatura medicală. Principiile fizice ale aparaturii medicale
moderne,Ed.Teora,Bucureşti, 2000.
 Nölting, Bengt. Methods in Modern Biophysics. Springer. 2003.
 Pascu M., Rusu V., Vasile C., Spectrometria in IR in medicina si farmacie ,
Editura BIT, 2003.
 Popescu A., Bazele Opticii, Ed. Universităţii „Al. I. Cuza”, Iaşi, 1988.
 Rusu V., Baran T., Brănişteanu D. D. - Biomembrane şi patologie, vol. I, Ed.
Medicală, Bucureşti, 1988, 63-92, 286-292.
 Rusu V. Note de curs. 2010.
 Rusu V. – Nobel – Retrospectivă 1905 – 1995 – Laureaţii premiului pentru
fiziologie şi medicină, Ed. Omnia, Iaşi, 1996.
 Rusu V si colab. Lucrări practice şi demonstraţii de Biofizică şi Fizică
Medicală, Ed. „Gr. T. Popa” Iaşi, 2003.
 Rusu V. – Dicţionar medical, Ed. Medicală, Bucureşti, ed. IV, 2011.
 Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., Principes d’analyse instrumentale,
De Boeck Université, Paris, 2003.
 Ştefănescu C, Rusu V. Biophysics and Medical Physics: An Introduction,
Ed. Tehnopress, 2008.