I. LUCRAREA 6. MĂSURAREA POTENŢIALULUI MEMBRANAR.

CONDUCŢIA CANALELOR IONICE

6.1. SCOPUL LUCRĂRII

Se are în vedere pe parcursul lucrării, studierea celulei din punct de vedere fiziologic,
prin analiza conducţiei canalelor ionice. Tehnologia folosită este PatchCLAMP (fixarea unui
electrod pe o membrană), care poate fi de tip “voltage clamp” (când se aplică o tensiune
constantă şi se analizează răspunsul în curent) sau de tip “current clamp” când treptele de
stimulare sunt de curent constant şi se analizează răspunsul în tensiune. Ca material didactic se
foloseşte programul de simulare realizat după modelul SimPATCH şi pentru schema
electronică, programul LTspice.
6.2. ASPECTE TEORETICE

6.2.1. Circuitul echivalent al unei celule

Metoda prezentată reprezintă analiza, din punct de vedere electric, a conducţiei
canalelor ionice, prezente în membrana celulară, formată dintr-un bistrat lipidic. Canalele ionice
sunt structuri proteice din membrană care îşi pot modifica structura. În prezenţa unor stimuli se
formează canale ionice prin care circulă, din interior spre exterior şi invers, anumiţi ioni.
Investigând această deplasare se constată activitatea normală sau patologică a celulei.
Aplicabilitatea tehnicii de patch – clamp constă în studiul mecanismelor de transport ionic
electrogen din punct de vedere biofizic, fiziologic si farmacologic.
Transportul ionic poate fi pasiv, fără consum de energie, conform gradientului de
concentraţie, sau activ, cu aport energetic, împotriva gradientului de concentraţie.
Din punct de vedere electric, membrana poate fi echivalată cu un circuit format dintr-o
rezistenţă şi un condensator, conectate în paralel. Condensatorul este determinat de structura
lipidică, cu armăturile formate de capetele polare ale moleculelor, iar dielectricul este
reprezentat de cozile acizilor graşi componenţi. Rezistenţa circuitului este determinată de
conductanţa canalelor ionice, figura 6.1.
Convenţional se consideră că semnul curenţilor ionici este “-” pentru cei spre interiorul
celulei şi “+” pentru cei spre exterior. Curenţii ionici înregistraţi sunt de ordinul pA-nA. Faţă de
potenţialul mediului celular, potenţialul de repaus al unei celule este de aproximativ –70mV,
variind in limite mici de la o celulă la alta. Acest potenţialul de echilibru este potenţialul la care
migraţia de ioni din interior la exterior este egal cu cea din exterior in interior, iar cantitativ este
dat de legea lui Nernst funcţie de concentraţia ionilor, relaţiile 6.1.
R T [Na ]ext
E Na ln 0
2 F [Na ]int
(6.1)
R T [K ]ext
EK ln 0
2 F [K ]int

Exemple de canale ionice sunt cele de potasiu (K+), sodiu (Na+), clor (Cl-), calciu (Ca2+).
 II.

C R

C
R

Figura 6.1. Circuitul echivalent al membranei celulare

Din punct de vedere al proprietăţilor, canalele ionice sunt ohmice (se supun legii lui
Ohm), pot fi cu tensiune electromotoare (se activează pornind de la un potenţial) şi/sau pot fi
cu rectificare (conductanţa variabilă în anumite porţiuni ale caracteristicii). Semnificaţia
acestora este prezentată în figura 6.2.

I I I

U U U

Figura 6.2. Propietăţi canale ionice. (a) ohmice, (b) cu t.e.m., (c) rectificare

Pentru a studia conducţia unui tip de canal, se blochează funcţionarea celorlalte, prin
folosirea de substanţe inhibitoare. Cele folosite în experiment sunt trecute în tabelul 6.1.
Pentru studierea unui singur tip de canal se blochează celelalte cu o combinaţie de inhibitori
pentru celelalte.
Tabelul 6.1. Inhibitori de canale ionice
Nr. Canal Inhibitor Observaţii
Crt. ionic

1 K+ TEA - Se mai poate folosi Cs

tetraetilamoniu
2 Na+ TTX - Colina este un substituent al ionilor de Na în mediul
tetrodotoxină extracelular
3 Ca2+ Nifedipin, acetil Pentru canalele de Ca dependente de tensiune. Acetil colina
colina este un neurotransmiţător excitator, deschizând canalele de
Na+ şi K+, care determină o depolarizare a celulei.
4 Cl- Pentru forţarea deschiderii se foloseşte GABA – acid
gamaaminobutiric. Este un neurotransmiţător inhibitor,
datorită hiperpolarizării produse.
6.2.2. SimPATCH
 Este un program de simulare a întregului proces de prelevare şi înregistrare a
semnalelor de la celulă. Un astfel de echipament este format din: microscop, manipulator,
amplificator de patch clamp, interfaţă, generator de pulsuri, osciloscop, tragător de pipetă,
electrod de înregistrat. (Ag-AgCl). Tipurile de celule analizate sunt cele prezente în retină.
Acestea sunt:
Celule fotoreceptoare
Celule orizontale
Celule bipolare
Celule amacrine
Celule ganglionare
În practică, este importantă izolarea foarte bună a echipamentului faţă de stimulii
mecanici şi electrici. Aspectul interfeţei instrumentului virtual, este prezentat în figura 6.3.

Figura 6.3. Aspectul general al programului de simulare

6.2.3. Compensarea tranziţiilor
Există două surse de erori, care necesită compensarea rezistenţei serie şi anularea
capacităţii parazite. Este vorba de influenţa capacităţilor parazite a pipetei şi a rezistenţei serie
a pipetei. Schema echivalentă, care ţine cont şi de influenţa pipetei şi mediului de lucru, este
analizată în anexa 6.2.
Anularea capacităţii celulei nu trebuie confundată cu compensarea rezistenţei serie.
Anularea capacităţii este realizată pentru a evita saturarea amplificatorului din circuitul de
înregistrare pe durata curenţilor rapizi generaţi de schimbările de tensiune şi de eliminarea
erorilor datorate capacităţilor pipetei şi dispozitivului.
În prima etapă, capacitorul reprezentat de pipetă şi dispozitiv este anihilat de contactul
cu celula. Aceasta este cunoscută ca o anulare “rapidă” a capacităţii deoarece constanta de
timp este foarte mică, 0,5-5 s. Această etapă este esenţială pentru estimarea lui Rs. Pentru
metoda înregistrării semnalelor de pe suprafaţa întregi celule, o a doua anulare a capacităţii
este realizată pentru eliminarea curenţilor capacitivi ai membranei celulare. Majoritatea
amplificatoarelor uzuale pot determina valoarea capacitţilor celulei şi a rezistenţei de acces,
pentru curenţii capacitivi “lenţi”. Anularea curentului capacitiv constă în furnizarea curentului
direct necesar de încărcare a capacitorului, prin însumarea la intrarea unui amplificator printr-
un capacitor Ch, figura 6.4. Pentru aceasta o formă exponenţială de tensiune este aplicată prin
Ch. Prin reglarea amplitudinii şi constantei de timp a acestei tensiuni Vforma, curentul Icap va trece
prin Ch şi nu prin Rf. De aceea nu influenţează înregistrarea. Pentru anularea simultană a
curenţilor capacitivi rapizi (daţi de pipetă si dispozitiv) şi lenţi (daţi de celulă), suma celor două
exponenţiale alimentează Vforma.
Compensarea rezistenţei serie este prezentată în figura 6.5 obiectivul aici este de a
creşte capabilitatea înregistrării unor curenţi rapizi şi de a limita erorile din reprezentarea I-U.
Ideea de bază este de a lua curentul de ieşire, modificat cu amplificarea şi adăugarea
rezultatului la tensiunea de comandă. În timpul pulsului, acest rezultat este o suprapunere
peste potenţialul efectiv aplicat. De asemenea, sistemul corectează automat V P dacă apare un
curent ionic. Corecţia se obţine, în esenţă, prin inversarea graficelor, utilizată pentru a trece de
la graficul I(V) la I(VP).

Rf
Ch
Vforma
-
Icap
+
Icap
Vp

Figura 6.4. Anularea curenţilor capacitivi

Deoarece compensarea rezistivă implică o reacţie pozitivă, se poate intra în oscilaţie.
Din acest motiv este imposibil de realizat o compensare de 100%. Compensarea lucrează bine
pentru o valoare a lui Rs determinată corect, din analiza regimului tranzitoriu.

-
+
I

Vc
Vp+ I
Figura 6.5. Compensarea rezistenţei serie
 Compensarea rezistenţei serie este de obicei realizată după anularea completă a
curenţilor capacitivi ai pipetei, dispozitivului şi membranei celulare. Nu este obligatoriu, însă
acest lucru.
Când ambele tehnici, de anularea a capacităţii şi de compensarea rezistenţei serie, sunt
angajate, anularea capacităţi elimină o parte din curent, care nu apare la primul amplificator. Ca
rezultat, câştigul aşteptat de viteză din compensarea rezistenţei serie poate fi pierdut. Din
fericire problema poate fi rezolvată prin adăugarea unui semnal corespunzător curentului
capacitiv la curentul înregistrat la sfârşitul lanţului de înregistrare.
6.3. Chestiuni de studiat

Determinarea rezistenţei şi capacităţii pentru fiecare tip de celulă.

Determinarea suprafeţei celulei, pentru tipurile de celule studiate.
Trasati curbele I-V pentru fiecare tip de canal identificat in celulele ganglionare.
Studiul variaţiei cu temperatura a conducţiei canalelor ionice de Na+ şi Ca2+.
Influenţa concentraţiei ionilor de K+ asupra conducţiei canalelor ionice.

6.4. Desfăşurarea experimentului

Se pornesc aparatele în succesiunea indicată.

Se alege un tip de celulă, din cele indicate.
Se aplică un singur stimul cu ajutorul generatorului. Pe osciloscop apare un
semnal cu 2 descărcări exponenţiale corespunzatoare începutului şi sfârşitului
pulsului. Acestea sunt descărcările capacitive lente ale membranei celulare, care
din punct de vedere electric este un circuit rezistor-condensator tip paralel.
Se porneşte circuitul de compensare al amplificatorului
Se rotesc comutatoarele corespunzatoare rezistenţei în serie şi capacităţii
membranare până când semnalul devine o linie dreaptă. Ce valoare a capacităţii
membranare a fost stabilită? Care este suprafaţa celulară ştiind ca membrana
are o capacitate specifica de 1 F/cm2?
Se aplică o familie de stimuli cu ajutorul generatorului. Se reglează scala
osciloscopului astfel încât să intre tot semnalul cules. Dacă osciloscopul afişează
canalul 2, se poate vedea curentul generat prin membrana celulară, la diferite
potenţiale, ca urmare a deschiderii canalelor ionice dependente de voltaj.
Aşa cum s-a arătat după etapa de compensare a rezistenţei serie Rs şi anulare a
capacităţii proprii, pentru studiul canalelor se aplică o familie de impulsuri astfel încât să se
treacă de la hiperpolarizarea membranei la depolarizarea ei. Potenţialul se alege astfel încât să
se poată investiga trecerea de la închis la deschis a canalelor. Practic se porneşte de la
aproximativ –90mV cu trepte de 10mV sau 20mV. Numărul de trepte este de 16 (sau alt număr,
corespunzător). Se completează tabelul 6.2, indicând prezenţa canalelor ionice respective. Un
exemplu de grafic, pentru ionii de calciu, este prezentat în anexa 6.1. Se trasează pentru fiecare
tip de celulă, graficul conducţiei ionice, pentru ionii de Na+, K+ şi Ca2+.
Se va urmării alura graficului pentru determinarea potenţialului de reversie şi pentru
analiza tipului de canal ionic.
 Tabelul 6.2. Date experimentale
Tip de celula Cm RS S

[pF] [ ] [ m2] Canale de Canale de Canale de Canale

Na+ Ca2+ K+ de Cl-

Fotoreceptori

Celule bipolare

Celule orizontale

Celule amacrine

Celule
ganglionare

Se vor reprezenta grafic curenţii canalelor ionice, I, funcţie de tensiunea aplicată, U. Se

mai poate analiza conducţia canalelor ionice prin simularea schemei electrice echivalente a
celulei, folosind programul LTSpice.
6.5. ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE

6.5.1. Care este efectul combinaţiei TEA + TTX asupra conducţiei?

6.5.2. Care este efectul temperaturii asupra conducţiei? Depinde aceasta de tipul de ioni?
6.5.3. Care este ordinea recomandabilă de eliminare a tranziţiilor datorate capacitaţi şi
rezistenţei serie?
6.5.4. Ce este potenţialul de reversie? Dar cel de echilibru?
6.5.5. Care este deosebirea principală între canalele de Na+, Ca2+, K+, pe de o parte şi canalele de Cl-,
pe de altă parte?
6.5.6. Realizaţi simularea schemelor pentru anularea curenţilor capacitivi şi compensarea rezistenţei
serie.
 ANEXA 6.1

Conducţia canalelor de Ca2+ la celule bipolare.

600

500

400

300

200
I[pA]

100

0
-90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60
-100

-200

-300
U[mV]
 ANEXA 6.2

Circuitul electric echivalent al unei celule

Pentru o celulă rezonabilă (cel mult 100 m) avem o rezistenţă de repaus de ordinul
1G şi o capacitate de intrare de ordinul a 10-100pF. Aceasta corespunde pentru un număr
mare de celule animale.
Celula este studiată cu o pipetă care are o rezistenţă Rs în timpul înregistrării (Rs este
diferită de rezistenţa proprie inainte de contactul cu celula). Circuitul echivalent este ilustrat în
figura de mai jos.
 ANEXA 6.2

(continuare)

Rezultatele simulării sunt pentru R=1G , Rs=10M si C=100pF, C=10pF. În cea de-a
doua situaţie curentul in regim de stabilire este mai vizibil. Dacă Vp este potenţialul pipetei,
urmărind un impuls de amplitudine V, curentul I printr-un asemenea circuit este descris de o
funcţie exponenţială. Dacă presupunem că Rs>>R (valorile tipice sunt de 10M , respectiv
1G ), se obţine:
ΔV
I in (1)
Rs
ΔV
I SS (2)
R
τ Rs C (3)

unde semnificaţia mărimilor este:

Iin- curentul instantaneu (iniţial) determinat de treapta de tensiune
- constanta de timp a curentului de descărcare
ISS – curentul în regim stabilizat.
Iin, şi ISS pot fi măsurate şi utilizate pentru calculul lui R, Rs şi C.

Astfel o simplă analiză a schimbului de curenţi înregistraţi ca răspuns la impuls, produce

toţi parametrii circuitului electric echivalent al celulei cu execepţia unuia (ER – potenţialul de
repaus al celulei). Valoarea RS, calculabilă din ecuaţia (1) are o valoare diferită faţă de rezistenţa
pipetei înainte de a face contactul cu celula, Rif. Raportul tipic Rs/Rif este de 2-5. Aceasta este
probabil datorat elementelor citozol, care impun o conductivitate mică porţiunii din celulă
absorbită în pipetă, comparativ cu soluţia din incintă.