BIOSENZORI

1. Definitie
2. Elemente biologice
3. Metode de imobilizare a elementului biologic
4. Traductori
5. Aplicatii
 Ce este un biosenzor?
Un biosenzor este un dispozitiv format dintr-un element biologic (enzimă,
biomoleculă, anticorp, celule microbiane, ţesut, etc) ce este imobilizat în vecinătatea
unui traductor (electrochimic, optic, termic, etc) ce transformă un semnalul chimic
rezultat în urma interacţiei analitului cu elementul biologic într-un răspuns
măsurabil, de obicei într-un răspuns electronic.

Analit / bioreceptor / traductor / procesor

Analiti
• microorganisme
anthrax, tularemia, E. coli, Candida

• molecule mici
glucoza, alcool, CO, CO2, agenti paralizanti, uree, pesticide, aspirina, paracetamol,
penicilina, TNT, colesterol, aminoacizi

• biomacromolecule
DNA, RNA, enzime, proteine, hormoni, virusi
 Elemente biologice
1) ENZIME
- cele mai utilizate in constructia biosenzorilor
- catalizatori ai unor reactii
- se poate utiliza o enzima sau se pot cupla doua sau
mai multe reactii enzimatice cu producerea unui compus ce
poate fi determinat prin diverse metode

Enzime utilizate in biosenzori

- cele mai multe sunt enzime REDOX (reductaze, oxidaze) producatoare /
consumatoare de electroni: detectie amperometrica sau colorimetrica
- enzimele hidrolitice (proteaze, lipaze, esteraze) producatoare /
consumatoare de electroni: detectie potentiometrica sau conductometrica
- sisteme enzimatice cuplate, cum ar fi peroxidaza cuplata cu luciferaza
ce duce la obtinerea unui produs colorat sau la emisia de fotoni: detectie optica

2) ANTICORPI / ANTIGENI
Anticorpii
- proteine ce pot recunoste in mod specific o substanta
specifica (antigen) ca mijloc natural de aparare
- caracterizati de interactii extrem de selective si
puternice cu antigenii specifici
- pot fi obtinuti anticorpi pentru aproape orice antigen
 Anticorpii in biosenzori

Avantaje:
- selectivitate foarte inalta; realizare de legaturi
puternice Antigen binding sites

Dezavantaje:
- nu prezinta efect catalitic, fiind necesara Light
Chain
determinarea lor indirecta prin marcarea lor cu diversi
agenti de marcare Heavy
Chain
Agenti de marcare: radio-izotopi, enzime, fluorofori,
compusi chemiluminiescenti

Obs. In cazul traductorilor Piezoelectrici se poate face o

determinare directa datorita modificarilor in frecventa de
vibratie a cristalului in urma legarii antigenului
Enzyme Linked Immuno-Sorbant Assay (ELISA)

YYY YYY
YYY

YYY
YYY
YYY
3) PROTEINE RECEPTOR
- proteinele receptor se afla de obicei la suprafata celulei
sau in membrana celulara.
- pot fi utilizate in special la determinarea neuro-
transmitatorilor, hormonilor, medicamentelor neuro-active,
anestezicelor, etc.
- extrem de selective, dar adesea greu se izolat, putandu-
se utiliza si biomembrane intacte sau celule intregi.

4) ACIZI NUCLEICI
- ADN-ul si ARN-ul pot fi utilizati pentru realizarea unor
senzori in format chip
- biosenzorii bazati pe ADN si ARN se utilizeaza pentru
detectia mutatiilor genetice si pentru determinarea
nivelurilor de expresie a proteinelor.

5) CELULE / TESUTURI
- biosenzorii bazati pe celule sau tesuturi sunt mai putin
selectivi
- utilizati in special pentru determinari semicantitative;
pentru determinarea indicilor de toxicitate
Metode de imobilizare a componentei biologice

Adsorbţie

Reţinere fizică în spatele

Fizică unei membrane
permeabile pentru
molecule mici

Înglobare în reţeaua unui

IMOBILIZARE polimer

Legare covalentă
Chimică
Legare încrucişată
Imobilizare eficienta:
- orientare corecta a elementului biologic
- accesibilitatea analitului la elementul biologic
- retinerea activitatii biologice
- difuzie usoara a analitului catre elementul biologic
- Stabilitate operationala si durata de viata

In cazul imobilizarii chimice este necesara prezenta unor grupari functionale

la nivelul elementului biologic sau functionalizarea acestuia.
In cazul imobilizarii proteinelor pot fi exploatate urmatoarele grupari
functionale ale aminoacizilor

Lizina (NH2) Cisteina (SH) Serina (OH) Acid Aspartic (COOH)

 IMOBILIZAREA FIZICA
+ Nu este afectata structura elementului biologic
+ Limiteaza contaminarea cu proteine prezente in proba
+ Limiteaza biodegradarea elementului biologic

- Difuzia analitului catre elementul biologic poate fi incetinita

- Retinerea unor molecule nedorite (interferente) in spatele membranei sau in
reteaua polimerului
- Pierderea elementului biologic

IMOBILIZAREA CHIMICA
+ Stabilitate marita
+ Un bun control asupra orientarii elementului biologic in cazul imobilizarii
covalente
+ In cazul utilizarii unui electrod ca traductor, la imobilizare se poate utiliza un
agent de legare conducator de electroni ducand la o eficienta mai mare a
semnalului electronic

- Afectarea structurii elementului biologic si pierderea selectivitatii / activitatii

catalitice in timpul reactiilor chimice de imobilizare (in special in cazul legarii
incrucisate)
- Rezistenta mecanica a sistemului poate fi slaba
IMOBILIZAREA BAZATA PE AFINITATE BIOLOGICA

Element biologic

Biotina
1. Sistemul
Avidina (proteina tetramerica)
avidina - biotina
Biotina

Traductor

Element biologic

Antigen
2. Sistemul
Anticorp antigen - anticorp

traductor
3. Imobilizarea celulelor bazata pe afinitate biologica

Celule cu ‘integrine’ de suprafata

Matrice extra-celulara (EMC)

fibronectin tri-peptida RGD (Arg-Gly-Asp) in EMC

Peptide RGD

Integrine (factori de atasare)

traductor

Timp de viata
• Adsorbtie 1 zi
• Inglobarea in polimer 1 saptamana
• Legare incrucisata 3- 4 saptamani
• Imobilizare covalenta 4-14 luni
• Afinitate biologica saptamani - luni (variabil)
 Functionalizarea suprafetei traductorilor
1) Monostraturi auto-asamblate (Self-assembled Monolayers - SAMs)
• se formeaza prin adsorbtia pe suprafete de aur a unor derivati alcan-tiolici
X(CH2)nSH
• sunt caraterizate printr-o orientare foarte precisa

Grup functional :
OH, NH2, COOH

Alcan
Tiol dizolvat in etanol

SH

Suprafata de aur
imersata in solutie

Monostrat auto-asamblat
2) Silanizarea oxizilor metalici

Grup functional
X
Alcan
Hidroliza
+ H 2O +
Si Condensare
O OO O
C2 H5 O CHO Sticla (SiO2)
C2H5O 2 5
sau alt oxid metalic

O O O
 Agenti pentru prevenirea adsorbtiei non-specifice

PEG (poli-etilenglicol)

Fosfocolina
- componenta a membranelor biologice

Albumina serica
- proteina serica neadeziva

Heparina
- Zahar ce previne coagularea sangelui
 TRADUCTORI
1. Traductori electrochemici
a)Potentiometrici:
- se masoara potentialul celulei electrochimice la curent zero. Potentialul
celulei este proportional cu concentratia ionilor.

- in constructia biosenzorilor potentiometrici intra de obicei enzime ce

determina schimbari semnificative ale pH-ului: penicilinaza, ureaza,
esteraza.

V
Electrod de lucru

Proba
Punte de sare
Enzima imobilizata la suprafata
Electrod de electrodului
referinta
b) Amperometrici Glucoza Acid gluconic
- se aplica un potential intre un electrod de lucru
si un electrod de referinta, masurandu-se in Glucozoxidaza
mod continuu curentul din celula.
Oxigen Apa oxigenata
- cele mai utilizate enzime sunt 2H+, 2e-
oxidoreductazele: glucozoxidaza, colesterol
oxidaza, aminoacid oxidaza, etc. ELECTRODE
ELECTROD

c) Conductometrici curent
5.4mM
- se masoara conductanta / rezistenta unei solutii
- se pot utiliza cand in timpul conversiilor enzimatice sunt generate sarcini electrice
(amidase, esterase, kinaze).
Examplu: determinarea ureei (in urina) utilizand ureaza:

ureaza
Urea + 2H2O 2NH4+ + HCO3

(Dez)avantaje ale biosenzorilor electrochimici

+ usurinta in operare
+ interfata directa cu sistemul electronic
+ posibilitate de miniaturizare
- selectivitate limitata, fiind necesara utilizarea mediatorilor pentru imbunatatirea acesteia
- poate fi aplicata numai sistemlor la car eparticipa specii electrochimic active
2. Traductori optici
Tehnici optice ce pot fi utilizate in domeniul biosenzorilor:
• absorbtia in UV / Vizibil
• emisie de fluorescenta (fosforescenta)
• Bio-luminescenta
• Chemi-luminescenta
• Spectroscopie de Reflexie Interna (IRS)
• Metode bazate pe dispersia luminii

Despozitive necesare: tuburi fotomultiplicatoare, spectrofotometre,

fluorimetre, fibre optice, ghiduri de unda
Fluorescenta
Proprietatea unor molecule (fluorofori) de a absorbi
lumina la o anumita lungime de unda (de obicei in
UV) urmata de emisie de lumina la o alta lungime
de unda (in Vizibil).

Aplicatii: chip-uri ADN, imunoanaliza

Fluorescenta de transfer a energiei de rezonanta (FRET)

FRET consta intr-o interactie, dependenta de

distanta, dintre doi fluorofori, in care energia de
excitare a unuia (donor) este transferata la celalalt
(acceptor) fara emisie de fotoni.
Eficienta FRET este dependenta de distanta
intermoleculara si este utila la distante comparabile
cu dimensiunea macromoleculelor biologice.
 (Dez)avantajele traductorilor optici

+ usurinta in operare
+ pot raspunde simultan la analiti diferiti
+ precizie mare
+ posibilitatea utilizarii fibrelor optice pentru un ‘transport al fotonilor’ mai
eficient
+ extrem de sensibili (in special in cazul celor bazati pe fluorescenta si
luminescenta)

- depind de disponibilitatea compusului cu proprietati optice

- domeniu dinamic de aproximativ 102 (in cazurile in care se aplica legea Lambert-
Beer)
- dificultati in miniaturizare
- timpul de raspuns poate fi mare
- interferenta altor compusi prezenti in matrici complexe
- interferenta luminii exteriaore in cazul traductorilor luminescenti
Traductori termici
- formarea / ruperea legaturilor chimic in reactiile enzimatice duc la modificari de
entalpie
- pot fi detectate modificari ale temperaturii solutiilor de 10-3 K
- pentru o detectie mai buna reactiile de interes pot fi cuplate cu alte sisteme
enzimatice ce produc mai multa caldura (de ex., glucozoxidaza poate fi cuplata cu
catalaza)
+ pot fi utilizate pentru majoritatea reactiilor
- selectivitate scazuta
- dificultati in miniaturizare

Traductori piezoelectrici
Frecventa (f) oscilatiilor cristalului depinde de masa anticorp
cristalului (m) si de cea a oricarui material adsorbit pe
suprafata sa (A).
Cristal piezo-electric
Frecventa oscilatiilor descreste cu masa adsorbita.
Materiale piezolectrice : cuartz, materiale ceramice, polimeri antigen
organici
+ extrem de sensibili (determinarea antigenului in domeniul picogramelor)
+ posibilitate de determinare a antigenilor atat in faza gazoasa, cat si in faza lichida
+ portabilitate
+ Timp scurt de raspuns
+ Nu necesita marcare
- adsorbtia nespecifica a proteinelor poate duce la rezultate false
 Membrane conductoare (poli-
pirol)

Biosenzori amperometrici bazaţi pe

imobilizarea componentei biologice pe / în
membrane obţinute prin electro-
polimerizare direct la suprafaţa
electrodului de lucru.

Membrane ne-conductoare (poli-

tiramina)
BIOSENZORI BAZAŢI PE ELECTROZI SERIGRAFIAŢI

RE CE 1 cm
WE
Producţie de serie
Preţ de cost scăzut
Uşor de înlocuit
Necesită volume mici de probă
Potriviţi pentru determinări pe teren
Voltamograma înregistrată la obţinerea biosenzorului pentru
glucoză prin electropolimerizare pe electrozi serigrafiaţi
0.700x10-5

0.600x10-5

0.500x10-5

0.400x10-5
i/A

0.300x10-5

0.200x10-5

0.100x10-5

-0.100x10-5
0 0.250 0.500 0.750 1.000

E/V
 PERFORMANŢE CERUTE ALE BIOSENZORILOR

1. Precizie
2. Sensibilitate si selectivitate
3. Domeniul de analiză
4. Viteza de răspuns
5. Capacitate de reutilizare
6. Calibrare simplă
7. Robusteţe fizică
8. Preţul de cost
9. Uşurinţa în utilizare
10. Siguranţa produsului
 Environmental factors that affect bio- interactions and biosensor
performance
• Presence of interfering molecules (e.g. enzyme inhibitors)
• Denaturing agents (organic solvents and detergents)

• Hydrophobic surfaces

• Ionic strength, unfavourable pH

• Analyte concentration (Saturation; e.g. all antibody binding sites

Thesefilled)
factors can significantly affect the selectivity, specificity and tightness of binding.

Hence, analyte solutions commonly need to be prepared prior to analysis (neutral pH, no
detergents, certain concentrations).
 Application areas
• medical
glucose, alcohol, DNA, RNA, proteins, hormones, aspirin,
paracetamol, penicillin

• industrial bio-processes
amino acids, yeast, lactic acid, ethanol, etc.

• environmental
pesticides,fertilizers,oestrogen mimicks, CO, CO2

• defense/forensic
anthrax, small pox, ricin, nerve agents, TNT, cocaine Glucoza
Test de sarcina Antrax