Metabolismul bacterian

Fiziologia: nutritia si cresterea

bacteriana

1
 Metabolismul
= totalitatea reacţiilor biochimice necesare
pentru
- nutriţia celulei
- menţinerea în parametrii normali a tuturor
funcţiilor celulare

2
1. Reactii de conservare a energiei (catabolism)
- Reacţii degradative
2. Anabolisme - Reacţii biosintetice

• Căile metabolice sunt :

– Amfibolice – produşii obţinuţi putând fi utilizaţi în
reacţii catabolice, fie în reacţii anabolice
– Anaplerotice – produşii obţinuţi sunt utilizaţi
pentru înlocuirea substanţelor consumate şi care
nu pot fi obţinuţi din ambiental.

3
Energia = induspensabila pentru
- Converirea elementelor simple in
macromolecule -> asamblarea si multiplicarea
= anabolism
- Uneori – formarea capsula, cili, spori
- Asigurarea functiilor celulare specializate
- Mobilitate, transportul ionilor

4
 Particularitarile metabolismului bacterian
• reactiile metabolice se deruleaza intr-o
singura celula (necompartimentat)
• Metabolismul este activ
• Metabolismul este divers -> o retea compexa
a reactiilor metabolice -> sinteza tuturor
compusilor chimici si producerea de energie
– Sursa de C et N, energie
• Metabolismul este flexibil

5
• Stratégies globale pour l'identification
différentiellement exprimée gènes.
• L'analyse à la fois des niveaux
d'ARNm et de protéines est préférée
peut être des différences entre les
deux.
• Des spots individuels sur le les gels
bidimensionnels (2-D) peuvent être
identifiés comme des produits
géniques spécifiques par
spectrométrie de masse.
• L'analyse du transcriptome nécessite
une représentation de tous les gènes
concernés dans un réseau d'ADN et a
donc besoin avant connaissance
(idéalement une séquence complète)
du génome du organisme à tester.
• Ces deux approches globales
fournissent un large image de la
physiologie de l'organisme à l'étude.

6
• Toate celulele vii trebuie sa mentina un
“steady state” al reactiilor chimice pentru
– Formarea
– Utilizarea
-> Compusilor bogati in energie
- Reactie de oxido-reducere
-> energia eliberata este transferata direct unei alte
molecule (ΔGo)

7
Doar reactiile exergonice au ΔGo negativ si se deruleaza
spontan
Ex 1. PEP -----> Piruvat
ΔGo = -54 KJ/mol
Reactiile endergonice au ΔGo pozitiv si necesita energie
Ex 2. ADP +Pi -> ATP + H2O
ΔGo = 29 KJ/mol
Reactiile 1 si 2 se pot cupla, energia elibarata in prima reactie
permite formarea unei molecule ATP in reactia a doua
PEP -----> Piruvat
ADP +Pi -> ATP
……………………………………………………….
PEP + ADP + Pi ----- > Piruvat + ATP

8
Disocierea ATP poate avea loc in reactia
ATP ----- > ADP + Pi (ΔGo = -29 KJ/mol)
Acesta ultima reactie permite realizarea unei
reactii enderginice
Glucoza + Pi --------- > glucozo 6P ΔGo = 8,36KJ/mol
ATP -------------------- > ADP + Pi ΔGo = -29KJ/mol
…………………………………………….
Glucoza + ATP ------- > glucozo 6P + ADP
ΔGo = -20KJ/mol

9
Oxidarea la nivel de substrat si a metabolitilor
intermediari se realizeaza in mai multe etape
in care sunt eliberati electroni intermdiari
care sunt transferati de catre transportori

NAD (nicotin-adenine-dinucleotide)
– cel mai utilizat de catre bacterii
NADP si FAD (flavin-adenine-dinucleotide)

10
Transportorii redusi trebuie re-oxidati pentru a
impiedica blocarea metabolismului in ansamblu
-> Intervin acceptorii de electroni
• Cai citocrom-dependente
- O2 -> e- transferati – citocromi
- substrat anorganic oxigenat (nitrat / sulfat) =
respiratie aeroba
- Substrat organic reductibil (fumarat) = respiratie
anaeroba a fumaratului
• fara interventia citocromilor
- Substrat organic oxigenat = fermentatie
- Acidul piruvic este principalul acceptor de e-
11
 Tipuri nutritionale
Energia luminoasa Energie chimica
Donator de e- Donator de e-

anorganica : organica: anorganica : organica:

LITHO ORGANO LITHO ORGANO

CO2 Sursa compusi CO2, H2S, SO4 Sursa compusi

organici sau CO2 organici sau CO2

FOTOLITOAUTOTRO FOTOORGANO CHIMIOLITOAUTOTR CHIMIOORGANO

FE HETEROTROFE OFE HETEROTROFE

Alge, bacterii Bacterii non- Bacterii oxidante le Majoritatea

sulfuroase, sulfuroase verzi S,H, Fe speciilor bacteriene
cyanobacterii albastre patogene
Protozoare
mycete
12
 Glucoza
= substratul energetic tip
- In general utilizata de catre speciile bacteriene
chimioorganotrophe
Degrarea glucozei
1. Glicoliza
2. Calea Entner-Doudoroff
3. Sunt hexozo-monofosfat – calea pentozo-
fosfat

13
Fluxul de carbon si energie intr-un ecosistem

14
Principalele cai fermentative - glucoza
• Fermentaţia alcoolică:
• Levuri (Saccharomyces) - produsul final este
etanolul
• Bacterii (Enterobacteriaceae, Clostridium) –
formează acetaldehidă, dar aceasta este
redusă la etanol

15
 Fermentaţia acidă mixtă
testul roşu metil, pH-ul scăzând sub 5

Produşii finali de
fermentaţia ai zaharurilor
sunt acizii lactic, acetic,
succinic şi formic

interpretare:
test+  culoare rosie
(ph<5) (E.coli)

test -  culoare galbena

(ph>5) (Klebsiella)
 Fermentaţia acetoinică:
TESTUL VOGES-PROSKAUER
Produşii finali de
fermentaţie sunt 2,3-
butandiolul şi acetoina (3
hidroxi-2-butanonă)
interpretare :
test + inel violet la
interfata contact
KOH
Alpha-naphtol
Test + Klebsiella
Test – E.coli
• Fermentaţia lactică – produsul final este acidul lactic:
– Homolactică – acidul piruvic (din glicoliză) este acceptorul
final de electroni; este redus în acid lactic de către NADH,
(Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus).
– Heterolactică – este folosită calea pentozofosfatică
• Calea bifidă (Bifidobacterium)
• Fermentaţia propionică
• Fermentaţia glicerolului
• Fermentaţia butirică
• Fermentaţia acetono-butilică
• Fermentaţia aminoacizilor

20
 NUTRIŢIA BACTERIANĂ

Tipuri de medii de cultura

Consistenta Compozitie Tipuri functionale
lichide Definita (sintetice) De baza (utilizare
generala)
Semi-solide complexe imbogatite
solide Selective
diferentiale

21
Aplicatii ale metabolismului
in identificarea bacteriana

22
Schema de diagnostic general in bacteriologie

23
 1. Recoltarea produselor patologice
(recapitulare)

• Când, cum, cât, de unde?

• Exemple de produse patologice
• Tehnici de recoltare
• Transportul produselor patologice

24
 2. Diagnosticul bacteriologic
• Examen microscopic direct
• Cultivare
• Izolare în cultură pură
• Identificarea agentului patogen
• Caractere de patogenitate
• Antibiograma

25
 I. Examen cito-bacteriologic in
cursul infectiilor bronho-
pulmonare

- Bronsite
- Pneumonii acute
- Pneumonii cronice

26
 SINDROMUL INFECŢIOS RESPIRATOR
- Diagnostic-
 Etajul supraglotic al tractului respirator - peste 200 de specii ( bacterii şi
fungi) repartizate în diferite nişe ecologice
• Microbiocenoza bucală:
- Staphylococcus, Micrococcus, Neisseria( specii comensale),
Lactobacillus, Veillonella, Fusobacterium, Peptostreptococcus, Candida,
spirochete comensale
• Microbiocenoza nazală :
-Corynebacterium ( sp. comensale), Neisseria(sp. comensale),
Staphylococcus, Streptococcus
• Microbiocenoza faringiană :
-Streptococcus ( S. pneumoniae. S. viridans), Neisseria ( sp.
comensale), Staphylococcus, Fusobacterium, Prevotella, spirochete
 Chimioterapia antibacteriană – poate să producă disbioze cu
predominenţa levurilor şi a S. aureus.

27
leucocytes Cellulles Flore bactérienne lecture
épithéliales

<25 / champ >25 / champ Prélèvement

impropre à l’analyse
bactériologique

<25 / champ Flore bactérienne Absence de critère

polymorphe biologique
d’infection

<25 / champ <25 / champ Flore bactérienne encemencer

monomorphe

>25 / champ encemencer

28
29
30
 Izolarea şi identificarea bacteriilor şi fungilor
• Orientare :
- macroscopică
- microscopică
• Izolare- studii :
- Calitative
- Cantitative – necesită : fluidificare în soluţie enzimatică, diluţie, numărarea coloniilor

Studii Sistematice

Streptococcus Enterobacteriaceae
Haemophillus
pneumoniae Şi alţi bacilli gram negative

Geloză sânge Geloză şocolatie Drigalski

(aerobioză) (sânge) Sau alte medii selective cu
(CO2) (CO2) lactoză

Hemoliză
- identificarea biochimică a
α – identificare biochimică ptr. Pneumo
speciilor - identificare biochimică
β- latex aglutinare ptr. Strepto
- cercetarea β lactamazei
(A,B,C,D,F,G)

Antibiogramă
31
 Izolarea şi identificarea bacteriilor şi fungilor

Studii orientate Gram Caz particular

Staphilococcus Anaerobi Fungi Mycobacterium

Chapman Geloză Sabouraud După fluidificare şi decontaminare

sânge Löwenstein - Yensen
Nagler
Rosenow
(OTT)

Catalază identificare Filamentaţie: Identificare

Coagulază ! biochi + →C.albicans
mică - →identificare
biochimică ( C.
spp.)

Antibiogramă Antifungigramă Rezistenţa la antibiotice

32
 Identificarea biochimică la mycobacterii
• CERCETAREA CATALAZEI ( se
lucrează în eprubetă)
- Efervescenţa = reacţie pozitivă
- Absenţa = reacţie negativă
 My. tuberculosis şi My. bovis –
activitatea catalazică dispare
după încălzirea la 70ºC
 My.atipice – îşi consumă
activitatea catalazică şi după
încălzire la 70ºC
 My.tuberculosis şi My. bovis INH
rezistente – pierd activitatea
catalazică la 22ºC
• REDUCEREA NITRAŢILOR ( se
lucreză în eprubetă)
- Cu o suspensie dintr-o cultură
tânără de My.tuberculosis în apă
distilată sterilă
- Termostatată 2 ore la 37ºC
- Reacţia se developează cu un
amestec de acid sulfomilic în acid
acetic şi alfa-naftilamină în acid
acetic
- R. pozitivă – roşu violet
- R. negativă- incolor
- My.tuberculosis – R. pozitivă
- My.bovis – R. negativă
33
 Caractere biochimice
identificare bacteriana

34
• SCOPUL
Incadrarea tulpinii izolate din produs patologic in gen si
specie

• TEHNICA
Inocularea tulpinii bacteriene pe mediu si incubarea
corespunzatoare.

• INTERPRETAREA REZULTATULUI
Se apreciaza daca bacteria are sau nu capacitatea de a
metaboliza substratul respectiv

35
36
 CLASIFICAREA TESTELOR BIOCHIMICE

• Teste rezultate din metabolismul energetic

• Testarea proceselor de fermentaţie

• Testarea metabolismului compuşilor azotaţi

• Testarea necesităţilor nutritive minimale

37
TESTE REZULTATE DIN METABOLISMUL ENERGETIC

• PRECIZAREA TIPULUI DE RESPIRATIE

• PROBA OXIDARII SI A FERMENTARII

• PREZENŢA CATALAZEI

• REDUCEREA NITRATILOR LA NITRITI

• TESTUL OXIDAZEI

38
 PRECIZAREA TIPULUI DE RESPIRATIE
• geloza Veillon → însămânţare prin încorporare
• incubare 24h la 37°C
- bacteriile aerobesuprafaţa mediului
(Bacillus)
- bacteriile strict anaerobeprofunzimea
mediului (Clostridium)
- bacteriile aerob-anerob facultativetoata coloana
mediului (Enterobacteriaceae)
39
40
 OXIDATIE-FERMENTATIE
• Geloza dreaptă
• Substrat : glucoza
• Indicator de pH
- degradare oxidativă  la suprafaţa
(Pseudomonas)
- degradare fermentativă  în profunzime
(Clostridium)
- degradare mixtă în toată masa mediului
(Enterobacteriaceae)

41
42
43
 REDUCEREA NITRATILOR LA NITRITI

• Substrat: apa peptonata + KNO3

• demonstrează prezenţa nitrat-reductazelor
• reduc nitratul la nitrit în prezenţa unui donator de
electroni
• Incubare: 24h la 37°C

• Substanta indicatoare: ac sulfanilic/acid acetic, alfa-

naftilamina/ac acetic

44
REDUCEREA NITRATILOR LA NITRITI

Interpretare
test +  viraj spre rosu al indicatorului
(Enterobacteriaceae)
45
 CATALAZA

H2O2
+
-
H2O
+ O

46
 CATALAZA
• eliberarea de oxigen din peroxizi de hidrogen

• Se emulsioneaza o colonie bacteriana intr-o

picatura de apa oxigenata

• Interpretare: test+ efervescenţă

47
48
 Proprietăţi biochimice

Catalaza

H2O2
+
-
H2O
+ O

49
 CATALAZA
• test pozitiv: • test negativ:
–stafilococi –streptococi

50
 Testul coagulazei
https://youtu.be/TlO3_Xy3CAo

https://www.youtube.com/watch?v=UhGpGkdw
PDU&feature=youtu.be

51
 Staphylococcus spp.
• Coagulaza libera
• Proteina A
• Coagulaza “legata” (clumping factor)

52
 Coagulaza libera
• Se realizeaza in eprubete
– 0.5 ml cultura bacteriana in mediu BHI / 18 ore la 35°C
– 0.5 ml plasma de iepure liofilozata si reconstituita
• Coagulaza plasmei se observa, de obicei in 3-4 ore
• In 18 ore coagularea plasmei este totala
• Test pozitiv
– S.aureus
– S. intermedius
– S. hyicus
– S.delphini
– S.scheiferi subsp coagulans
• Alte specii bacteriene – Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcencens,
Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis -> pot coagula plasma -> rezultate
eronate in cazul unor culturi de stafilococi coagulazo-negativi contaminate
cu speciile mentionate anterior
• Unele specii S.aureus au activitate procoagulanta prin actiunea unor
proteaze / pseudocoagulaza care actioneaza -> protrombina -> antreneaza
formarea trombine
– Aceasta se poate evita prin adagarea unor inhibitori de proteaza
53
 Proteina A
= antigen structural, caracteristic S.aureus (90%
din tulpini)
- Se poate fixa la nivelul fragmentului Fc al Ig.
- Reactivi comerciali
- Agglutinare

54
 Coagulaza legata Clumping factor
= factor de afimitate pentru fibrinogen
- Constituent superficial al stafilococilor care se fixeaza
de fibrinogen
- Plasma umana diluata pana la 1/5 -> nu agglutineaza
rapid stafilococul (nu are loc reactia antigen-anticorp)
- Kituri comerciale
- Test pozitiv
- S.aureus
- S.lugdunensis
- S.schleiferi subsp schleiferi
- S.intermedius (unele tulpini)

55
 OXIDAZA
• evidentierea citocromoxidazei c
• metoda colorimetrică cu tetrametil-p-
fenilendiamnină
• Tehnica:
- se umecteaza banda indicatoare cu apa
distilata
- se descarcă o colonie bacteriană cu ajutorul
ansei pe banda indicatoare
• Interpretare: test+ coloratie albastra

56
57
TESTUL OXIDAZEI

58
 TESTUL OXIDAZEI
• test pozitiv: • test negativ:
– Pseudomonas – enterobacteriile
aeruginosa
– N.meningitidis
– N.gonorrhoeae

59
 Testele IMViC
Grup de teste biochimice → identificarea
anumitor specii bacteriene:

1. Testul producerii de indol din triptofan

2. Testul roşu metil
3. Testul Voges-Proskauer
4. Testul utilizării citratului

60
 TESTE REZULTATE DIN TIPURILE DE
FERMENTATIE

• TESTUL ROSU-METIL

• TESTUL VOGES-PROSKAUER

61
 TESTUL ROSU-METIL
• detectarea producerii de acid în timpul
fermentării glucozei
• pH-ul mediului scade sub 5
• Tehnica:
– tulpina bacteriana testata se insamanteaza in apa
peptonata glucozata
– incubare 18h la 37°C.
– developare cu solutie rosu fenol

62
Interpretare:
test+  culoare rosie
(ph<5)

test -  culoare galbena

(ph>5)

63
64
 TESTUL ROSU-METIL
• test pozitiv: • test negativ:
–E.coli –Klebsiella
pneumoniae

65
 TESTUL VOGES-PROSKAUER
• Scop: evidentierea fermentatiei acetoinice
(detectarea producerii de acetil-metil-carbinol în
timpul fermentării glucozei)
• Tehnica:
- tulpina bacteriana se insamanteaza in apa
peptonata glucozata.
- Se incubeaza 18h la 37°C.
- Se alcalinizeaza.
- Developare cu alfa-naftol.
66
 TESTUL VOGES-PROSKAUER
• test pozitiv: • test negativ:
–Enterobacter –E.coli
aerogenes

67
TESTE REZULTATE DIN METABOLIZAREA COMPUSILOR
AZOTATI

• TESTUL INDOL

• PRODUCEREA DE H2S

• TESTUL FENILALANINDEZAMINAZEI

• TESTUL UREAZEI
68
 TESTUL INDOL
• Scop:
- evidentiaza prezenta triptofanazei
- descompunerea triptofanului la indol
• Tehnica:
- cultura bacteriana de 24h in apa peptonata
- benzi indicatoare cu reactiv reactiv Kovacs:
p-metil-aminobenzaldehidă dizolvat în alcool izoamilic cu adaos de
HCl concentrat

69
 TESTUL INDOL
• test pozitiv: • test negativ:
– Klebsiella oxytoca – Enterobacter
aerogenes
– E.coli
– Proteus mirabilis
– Proteus vulgaris

70
 PRODUCEREA DE H2S
• Scop: evidentierea cisteindesulfhidrazei
- descompunerea aminoacizilor sulfuraţi cu formarea
de H2S
• Substrat: agar ce contine acetat de Pb

• Tehnica:
- tulpina testata se insamanteaza cu ansa drepta in
toata coloana mediului.
- Incubare 18h la 37°C
71
PRODUCEREA DE H2S
Interpretare:
test +  culoare neagra a
mediului

72
 Testul producerii de hidrogen sulfurat

• test pozitiv: • test negativ:

– Salmonella sp. – E.coli
– Proteus vulgaris – Enterobacter
aerogenes

73
 Testul decarboxilării unui aminoacid
• demonstrează prezenţa unor decarboxilaze
• descompun anumiţi aminoacizi la amine cu
eliberarea ce CO2

a) Lizindecarboxilaza
b) Testul dezaminării fenilalaninei

74
 TESTUL FENILALANINDEZAMINAZEI
• Scop: evidentierea prezentei FAD

• Substrat: agar inclinat ce contine fenilalanina

• Tehnica: tulpina bacteriana se insamanteaza pe

panta agarului.
• Developarea reactiei → cu FeCl3

75
TESTUL FENILALANINDEZAMINAZEI

76
TESTUL FENILALANINDEZAMINAZEI

Interpretare:
test+  aparitia
culorii verzi

77
 Testul dezaminării fenilalaninei
• test pozitiv: • test negativ:
– Proteus vulgaris – E.coli
– Providencia sp.

78
 Lizindecarboxilaza
• test pozitiv: • test negativ:
– E.coli – Shigella sp.

79
 Ureaza
= enzima care catalizeaza hidroliza ureei
Uree + 2 H2O -> CO2 + H2O + 2 NH3 -> NH4+ + CO32-
Resultatul -> alcalinizarea mediului
pH 7 = optim al ureazei
Deoarece in majoritatea cazurilor este o enzima
constitutiva - > hidroliza ureei se realizeaza rapid
intr-o cultura bacteriana (cateva minute – 2 ore :
Proteus)
- Uneori – este inductibila – se exprima in prezenta
ureei, alcalinizarea este mai tardiva

80
 TESTUL UREAZEI
• Scop : demonstrează prezenţa ureazei
- descompunerea ureei cu producere de amoniac

• Substrat: mediul Christensen → conţine uree şi

indicator colorimetric (de pH).

• Tehnica: tulpina bacteriana testata se inoculeaza in

mediu. Se incubeaza 18h la 37°C.

81
TESTUL UREAZEI

82
 TESTUL UREAZEI
• test pozitiv: • test negativ:
–Proteus sp. –Salmonella sp.
–E.coli

83
TESTE REZULTATE DIN NECESITATILE NUTRITIVE
MINIMALE

• UTILIZAREA CITRATULUI
• UTILIZAREA ACETATULUI

84
 UTILIZAREA CITRATULUI
• demonstrează capacitatea folosirii citratului ca
unică sursă de carbon, în prezenţa unei sări de
amoniu ca unică sursă de azot
• mediul Simmons
• Tehnica: inocularea bacteriei de testat pe panta
agarului. Incubare 18h la 37°C

85
UTILIZAREA CITRATULUI SIMMON’S

• Interpretare:
test +  dezvoltarea
coloniilor
bacteriene si viraj
verdealbastru al
culorii mediului

86
 Testul utilizării citratului
• test pozitiv: • test negativ:
– Salmonella sp. – E.coli
– Enterobacter sp. – Shigella sp.
– Klebsiella sp.

87
 Testul utilizării acetatului
• demonstrează capacitatea folosirii acetatului
ca unică sursă de carbon şi energie

88
Testul utilizării acetatului
Test pozitiv: E.coli
Test negativ: Proteus sp.

89
Teste adiţionale-mobilitatea

90
Mediul TSI (triple sugar iron)

91
93
94
API 10S - Escherichia coli

95
Stafilococcus xylosus

96
BioMerieux VITEK2

97
98
99
100
101
MALDI-TOF

102