MICROBIOLOGIE ALIMENTAR LP.

EXAMINAREA CARACTERELOR BIOCHIMICE SAU METABOLICE N SCOPUL IDENTIFICRII BACTERIILOR.

Deoarece caracterele culturale i morfologice, de cele mai multe ori, sunt insuficiente pentru identificarea tulpinilor bacteriene izolate (ncadrarea lor n gen i specie), este necesar s se efectueze n continuare examenul caracterelor biochimice sau metabolice. Acest examen const n evidenierea echipamentului enzimatic al bacteriilor, diferit de la o specie bacterian la alta, prin reacii sau teste biochimice. n funcie de modalitatea de punere n eviden a aciunii enzimelor metabolice asupr a substratului specific fiecreia, testele biochimice pot fi grupate n 2 categorii: 1. teste care evideniaz n mod direct aciunea enzimelor, prin nsi modificarea fizic sau chimic a substratului (ex. lichefierea gelatinei, lichefierea serului coagu lat etc.). 2. teste care evideniaz indirect aciunea enzimelor prin punerea n eviden, cu ajutorul diferiilor reactivi, a metaboliilor rezultai din scindarea substratului (ex. triptofanaza nu se pune n eviden printr-o modificare vizibil a triptofanului din mediu, ci prin punerea n eviden a indolului, metabolit rezultat din descompunerea triptofanului). Clasificarea reaciilor biochimice n funcie de natura enzimelor bacteriene i a substraturilor asupra crora acioneaz, reaciile biochimice pot fi mprite n cinci grupe: 1. reacii prin care se pun n eviden enzimele active fa de substanele hidrocarbonate (glicide i polialcooli); 2. reacii prin care se pun n eviden enzimele active fa de substane organice care conin n molecula lor azot (de la uree la proteinele macromoleculare); 3. reacii prin care se pun n eviden enzimele bacteriene oxidante sau reductoare; 4. reacii de evideniere a posibilitii de utilizare ca surs de hran a unui anumit substrat nutritiv (ex., posibilitatea de a folosi citraii ca unuc surs de carbon); 5. sistemele multitest i microtest de identificare a bacteriilor . 1. Reacii de punere n eviden a activitii enzimatice fa de glucide i polialcooli Acest grup de reacii pune n eviden aa-numitele proprieti bacteriene zaharolitice, glucidolitice, sau de fermentare a glucidelor. Mai frecvent se testeaz activitatea bacteriilor fa de: monoglucide: pentoze (arabinoza, ramnoza, xiloza); hexoze (glucoza, fructoza, galactoza, manoza, sorboza); diglucide: zaharoza, lactoza, maltoza, trehaloza; triglucide: rafinoza, melizitoza; poliglucide: amidonul, dextrina, inulina, glicogenul; polialcooli: glicerol, manitol, sorbitol, inozitol; glucozide: salicina, esculina. n acest scop, bacteriile se cultiv pe medii lichide sau pe medii solide la care s-a adugat n proporie de 0,5-1% substana hidrocarbonat ce constituie substratul enzimei pe care dorim s o evideniem i o substan indicatoare de pH. Mediile se prepar la un pH uor alcalin. Deoarece din fermentarea glucidelor rezult acizi, substana indicatoare va vira culoarea mediului oferind astfel un indiciu c bacteria a fermentat glucidul respectiv. Examinarea proprietilor glucidolitice n ap peptonat cu o substan indicatoare de pH (fig.1).

Apa peptonat se prepar din 100 ml ap distilat, pepton 2 g i clorur de sodiu 0,5 g. La mediul astfel preparat se adaug un glucid i ca indicator de pH, albastru de bromtimol sau rou fenol. Unele bacterii fermenteaz substanele hidrocarbonate cu producie de gaze. Pentru a pune n eviden acest caracter, n eprubeta cu mediu se introduce un tubule Durham cu gura n jos, astfel nct s se umple cu mediu. Tehnica de lucru: tulpina bacterian de identificat se nsmneaz n tuburi cu ap peptonat coninnd glucidele fa de care vrem s -i testm activitatea fermentativ. Tuburile nsmnate se incubeaz la 370 C, 1-2 zile. Interpretare: reacia pozitiv se manifest prin virarea culorii mediului acidifiat, de la albastru la galben cnd indicatorul de pH este albastru de bromtimol i de la rou la galben cnd indicatorul este rou fenol; prezena gazelor n tubul Durham atest fermentarea glucidului cu producie de gaz. reacia negativ echivaleaz cu lipsa modificrilor .

Fig.1 Culturi bacteriene n ap peptonat cu glucoz i rou fenol: primul tub bacteria fermenteaz glucoza fr producie de gaz; al doilea tub reacie negativ; al treilea tub - bacteria fermenteaz glucoza cu producie de gaz. Testarea proprietilor fermentative ale bacteriilor pe medii solide cu substane hidrocarbonate se bazeaz pe acelai principiu: modificarea culorii indicatorului de pH introdus n mediu, ca urmare a acidifierii. Medii solide utilizate pentru testarea proprieti lor fermentative ale bacteriilor: Mediul Levine (agar cu lactoz, eozin i albastru de metilen) fig.2: -coloniile bacteriilor care nu fermenteaz lactoza sunt roz -pal; -coloniile bacteriilor care fermenteaz lactoza au o culoare negricioas i l uciu metalic verzui.

Fig.2 Aspectul culturilor pe mediul Levine: 1 i 2 bacterii lactoz negative; 3 bacterie lactoz pozitiv. Mediul Chapman (agar hiperclorurat 75 g NaCl, manitol, rou fenol) mediu selectiv pentru stafilococi prin concentraia mare de sare (stafilococii fiind halofili) i de difereniere a acestora pe baza capacitii de a fermenta manitolul (fig.3): - safilococii manitol pozitivi, acidifiaz mediul virnd culoarea din rou n galben; - stafilococii manitol negativi nu modific culoarea mediului.

Fig.3 Mediul Chapman: n stnga, o tulpin de stafilococ manitol pozitiv; sgeata indic o cultur de stafilococ manitol negativ. Testul de hidroliz a amidonului Bacteriile se nsmneaz ntr-o plac cu geloz care conine 0,2% amidon solubil. Dup dezvoltarea culturii suprafaa mediului se acoper cu soluie Lgol sau cu soluie saturat de iod. Mediul se va colora n albastru-violaceu datorit amidonului, iar n jurul coloniilor se vor observa zone neco lorate. 2. Reacii de punere n eviden a activitii enzimatice fa de substanele organice ce conin azot A. Testul ureazei (fig.4) Acest test este utilizat pentru identificarea bacteriilor capabile s hidrolizeze ureea utiliznd enzima numit ureaz. Punerea n eviden a acestei enzime se face pe diferite medii de cultur lichide sau solide care conin ca substrat uree, cum este, de exemplu, mediul Christensen. Mediul Christensen (agar cu rou fenol,glucoz (1 g), KH 2PO4 (2 g)) PH-ul se ajusteaz la 6,8 Dup sterilizarea mediului se adaug, nainte de solidificare, 20 ml dintr -o soluie de uree 20%, sterilizat prin filtrare. Datorit reaciei slab acide, mediul are o culoare glbuie (rou fenol este galben n mediu acid i devine rou n mediu alcalin). n urma nsmnrii unei bacterii care hidrolizeaz ureea transformnd -o n dou molecule de amoniac alcalin, mediul, iniial galben, se coloreaz n rou.

Fig. 4 Testul ureazei pe mediul Christensen: tubul din stnga bacterie ureaz negativ; tubul din mijloc bacterie ureaz pozitiv (Proteus mirabilis); tubul din dreapta mediu steril. B. Metode pentru punerea n eviden a produilor rezultai din dezintegrarea unor aminoacizi 1. Metode pentru punerea n eviden a indolului (fig.5). Unele bacterii cultivate n bulion sau n ap peptonat au proprietatea de a dezintegra triptofanul. Triptofanaza oxideaz lanul lateral al triptofanului, rezultnd indolul. Cea mai utilizat metod de evideniere a acestui catabolit utilizeaz soluia Erlich-Kovacs o soluie de culoare glbuie, care n prezena indolului se coloreaz n rou. Tehnica de lucru:

Din cultura de 24 de ore a bacteriei de testat se transfer ntr -un tub de reacie 1-2 ml, la care se adaug cteva picturi de reactiv Erlich-Kovacs, nct acesta s formeze un inel cu o grosime de 1 -2 mm. Reacia se citete imediat n funcie de culoarea inelului de reactiv Interpretare: reacia este pozitiv cnd inelul de reactiv vireaz n rou; reacia este negativcnd culoarea reactivului nu se modific. Punerea n eviden a indolului cu hrtie indicator: o band de hrtie de filtru imbibat cu reactivul Erlich-Kovacs (benzile se gsesc n comer gata de folosire) se introduce n tub dup nsmnarea bacteriei de testat, fixnd-o ntre dop i gura tubului. Banda nu terbuie s ating mediul de cultur. Reacia este pozitiv cnd captul liber al benzii se nroete.

Fig. 5 Testul indolului: stnga reacie negativ; dreapta reacie pozitiv. 2. Metode pentru punerea n eviden a H2S Hidrogenul sulfurat (H2S) este un produs rezultat din dezintegrarea aminoacizilor care conin sulf (cistin, cistein, metionin) sub aciunea fermenilor unor bacterii. Producia de H 2S se pune n eviden prin mai multe metode. Metoda cultivrii pe medii cu acetat de plumb La 100 ml agar nutritiv se adaug 1 g acetat de Pb. Mediul se repartizeaz n tuburi i se sterilizeaz. Bacteriile se nsmneaz pe suprafaa mediului nclinat sau turnat n plci Petri. Dac bacteria testat produce H2S, mediul se negrete n jurul coloniei datorit sulfurii de Pb care rezult din combinarea H 2S i a acetatului de Pb. Metoda benzilor cu acetat de plumb identic ca tehnic de lucru cu metoda descris la testul indolului. Benzile sunt mbibate cu cu o soluie 10% de acetat de Pb. Dac bacteria produce H2S, banda se negrete n poriunea inferioar dup 24 ore sau mai multe zile de incubare la 37C. C. Tehnici de evideniere a proprietilor proteolitice Testul de gelatinoliz Unele bacterii posed enzime proteolitice, fiind capabile s produc liza gelatinei. Pentru efectuarea acestui test se prepar un mediu din bulion nclzit la 55C, n care se dizolv gelatin 10-15%. Mediul obinut are o consisten solid pn la temperatura de 22C. Mediul se toarn n tuburi i se solidific n poziie orizontal apoi este nsmnat prin nepare, introducnd acul drept n centrul coloanei, astfel nct s ajung pn la fundul tubului. Tuburile se incubeaz n poziie vertical, la temperatura de 20 -22C i se controleaz caracterul creterii i al lichefierii la diferite intervale de timp (prima zi, a zecea i a 12 -a zi). Rezultatul testului: poate avea loc creterea bacteriei cu sau fr lichefierea mediului cu gelatin (fig.6). Dac bacteria nu se dezvolt la 20C poate fi cultivat n gelatin la 37C. n acest caz, pentru citirea rezultatului eprubeta se rcete introducnd -o la frigider, notndu-se apoi gradul de lichefiere n comparaie cu mediul nensmnat.

Fig.6 Testul de gelatinoliz: sus test pozitiv; jos test negativ. Testul de lichefiere a serului coagulat Serul recoltat n mod aseptic se distribuie n tuburi sterile apoi se coaguleaz la 70 -75C n coagulator, aeznd tuburile n poziie nclinat. Dup coagulare, mediul capt o culoare alb -cenuie. Bacteriile se dezvolt pe suprafa iar proteoliza se manifest prin lichefierea mediului i formarea unor depresiuni n dreptul coloniilor. 3. Teste prin care se pun n eviden enzimele oxidante i reductoare Testul de reducere a unor substane colorate Unele bacterii au proprietatea de a decolora (reduce) anumii colorani organici, transformndu -i n leucobaze incolore. Reacia este reversibil, astfel c, ulterior, n prezena oxigenului, redobndesc culoarea iniial. n vederea executrii acestui test se pot utiliza diferite substane colorate: albastru de metilen, clorura de trifeniltetrazolium (CTT), verde malachit, indigo-carmin etc. Mai frecvent se ntrebuineaz albastru de metilen, procedndu-se astfel: la 5 ml cultur n bulion de 24 ore se adaug o pictur din soluia apoas de albastru de metilen 1%. Dup omogenizare se acoper suprafaa mediului cu cteva picturi de ulei de parafin pentru a mpiedica ptrunderea oxigenului.Se incubeaz la 37 0 C i se urmrete reacia din or n or: reacia pozitiv const n decolorarea mediului n decurs de 1 -3 ore; reacia negativ culoarea mediului rmne nemodificat (albastr). Teste pentru punerea n eviden a cii de metabolizare a glucozei 1. Testul Voges-Proskauer (VP)- pune n eviden fermentarea glucozei pe cale butilenglicolic, prin depistarea acetilmetilcarbinolului, un metabolit rezultat din oxidarea butilenglicolului . Se cultiv bacteria de examinat n mediul Clark=Lubs (pepton -5 g, glucoz -5 g, fosfat bipotasic -2 g, ap distilat -1.000 ml) La cultura de 5 zile se adaug un volum egal de hiroxid de potasiu 10%. Tuburile se in sub observaie timp de 6 ore, la 37C. n cazul reaciei pozitive, n acest interval de timp, apare o culoare roie. 2. Testul roului metil (RM) Testul evideniaz fermentarea glucozei pe cale acid mixt (cu producere de acid lactic, acetic, formic, succinic,) care are ca rezultat acidifierea mediului la pH<4,5. Testul se execut n acelai mediu ca i reacia Voges-Proskauer. La 5 ml cultur de 48 ore se adaug 5 picturi dintr -o soluie de rou-metil (0,1 g rou-metil, 300 ml alcool i 500 ml ap distilat), care are culoarea roie la pH sub 5,0 i galbenla pH peste 5,8. n cazul reaciei pozitive mediul se coloreaz n rou, iar n cazul reaciei negative, n galben (fig.7). O cultur testat nu poate fi pozitiv dect la unul din cele dou teste: VP+sau RM+.

Fig. 7 Testul roului metil Testul catalazei Catalaza este o enzim prezent la unele bacterii, cu ajutorul creia acestea descompun peroxidul de hidrogen n ap i oxigen, conform reaciei: Testul se poate efectua folosind culturi pe mediu lichid sau solid. n primul caz se amestec 5 ml din cultura n bulion de 24 ore, cu 3 ml soluie de H2O2 3%. Reacia pozitiv se manifest printr -o efervescen accentuat cu formarea de spumoziti la suprafaa culturii. Reacia devine mai evident dac se adaug n prealabil la cultura n bulion, o cantitate egal dintr-o soluie de spun 10%. n cazul culturilor pe medii solide, se recolteaz cu acul de nsmnare o cantitate mic de cultur, care se omogenizeaz ntr-o pictur de ap oxigenat depus n prealabil pe suprafaa unei lame de sticl, sau se depune 1 ml de ap oxigenat pe suprafaa culturii (fig.8). Pentru acest test nu se folosesc culturi de pe agar cu snge.

Fig. 8 Testul catalazei: A- reacie pe lam (stngatest negativ; dreapta test pozitiv); B test efectuat n plac, reacie pozitiv. Testul oxidazei Testul evideniaz citocromoxidaza, enzim prezent la bacteriile aerobe, care realizeaz transferul electronilor de hidrogen, oxigenului molecular. Cultura de 2-4 zile pe mediu solid se acoper cu soluie apoas 1% de tetrametylparafenilendiamin hidroclorid, proaspt preparat. Rezultat: coloniile bacteriene oxidazo-pozitive se coloreaz n roz-rou sau purpuriu-brun pn la negru, n timp de 15 minute. Se pot utiliza i benzile sau rondelele de hrtie de filtru mbibate cu reactiv, reacia fiind efectuat direct pe un fragment de hrtie umectat n prealabil cu ap distilat (fig.10).

Fig.10 Testul oxidazei: stnga reacie negativ; dreapta reacie pozitiv. 4. Teste prin care se pune n eviden posibilitatea metabolizrii anumitor substane Testul folosirii ca unic surs de carbon a citratului de amoniu sau de sodiu din mediul Simmons Mediul de cultur are urmtoarea compoziie: - clorur de sodiu (5 g), - sulfat de magneziu (0,2 g), fosfat de amoniu biacid (1 g), - citrat de amoniu sau sodiu cristalizat (2,77 g), - ap distilat (1.000 ml); geloz (20 g). Amestecul se nclzete pn la topirea gelozei, se ajusteaz pH-ul la 7,2 , se adaug 10 ml soluie alcoolic 1,5% de albastru de bromtimol. Se sterilizeaz timp de 15 minute la 120C. La preparare mediul are culoarea verde. Bacteriile capabile s metabolizeze citratul de amo niu sau sodiu, dau culturi care alcalinizeaz mediul virnd culoarea din verde, n albastru intens. Bacteriile care nu utilizeaz citraii, nu modific culoarea mediului (fig.11).

Fig.11 Testul folosirii ca unic surs de carbon a citratului de amoniu sau de sodiu. 5. Sistemele multitest i microtest de identificare a bacteriilor A. Sistemele multitest ( mediile politrope) s-au impus n practica diagnosticului bacteriologic deoarece permit efectuarea concomitent a mai multor teste de identificare a bacteriilor pe un singur mediu de cultur. Dintre acestea, mediile TSI, MIU i MILF se utilizeaz ndeosebi pentru identificarea preliminar a enterobacteriaceelor. Mediul TSI (Triple Sugar Iron) Compoziia mediului: - extract de carne (3 g), - extract de drojdie (3 g), - pepton bacto (1 g), lactoz (10 g), - sucroz (10 g), - glucoz (1 g), - sulfat feros (0,02 g), - clorur de sodiu (5 g) + proteos pepton (5 g); lactoz (10 g), - tiosulfat de sodiu (0,3 g), - agar (15 g), - rou fenol (0,024 g sau 2,4 ml soluie 1/100), - ap distilat (1.000 ml). Se ajusteaz pH-ul la 7,4; se repartizeaz cte 5-6 ml n tuburi Wassermann i se autoclaveaz 20 minute. Se solidific n coloan 2,5 cm i n pant, 4 cm. Mediul are culoare roz nchis. nsmnarea se face prin nepare n poriunea dreapt i prin striere pe suprafaa nclinat Tuburile nsmnate se incubeaz la 37C, timp de 24 ore.

Interpretare (fig. 12): - fementarea glucozei se consider pozitiv dac n poriunea dreapt a mediului culoarea vireaz n galben. Dac fermentarea a avut loc cu producie de gaz , se observ bule de gaz sau gaz n cantitate mare, care detaeaz mediul de fundul eprubetei.; - fermentarea lactozei/ zaharozei se manifest prin virarea n galben a poriunii nclinate a mediului. - producia de H2S este pozitiv dac mediul se nnegrete n zona de trecere ntre poriunea dreapt i cea nclinat.

Fig. 12 Aspecte culturale pe mediul TSI: tubul1 (G+;L+; H2S-); tubul 2 (G+;L-; H2S-);tubul 3(G?;L-; H2S+); tubul 4 (G-;L-; H2S-). Mediul MILF (mobilitate, indol, lizin decarboxilaza,fenilalanin-dezaminaza). Compoziie: - extract de drojdie (3 g), - glucoz (0,75 g), - L-lizin (5 g), - DL-triptofan (1 g), - DLfenilalanin (4 g), - NaCl (5 g), - agar (3 g), - bromcrezol purpur 1/500 (8 ml), - ap distilat (1.000 ml). Ingredientele se dizolv la cald i dup ajustarea pH-ului la 6,8 mediul se repartizeaz n eprubete 10/10 mm i se sterilizeaz 30 minute la 110C. Dup sterilizare, mediul trebuie s fie perfect limpede. Solidificarea se face n poziie vertical iar nsmnarea se execut prin nepare pe toat nlimea coloanei. Tuburile se incubeaz 24 ore la 37C. Interpretare: - mobilitatea se apreciaz prin apariia turbiditii n toat coloana mediului. La tulpinile imobile dezvoltarea culturii are loc numai pe traiectul nepturii; - reacia indolului este pozitiv dac banda de hrtie impregnat cu reactiv ErlichKovacs, intodus n tub imediat dup nsmnare, se coloreaz roz -rou; - pentru testarea producerii de fenildeaminaz se adaug cteva picturi dintr -o soluie apoas de clorur feric (FeO2Cl6 6H2O) acidifiat prin adugarea de acid clorhidric soluie 10%.Dac testul este pozitiv, inelul format de reactiv se coloreaz n verde datorit reaciei dintre srurile ferice i acidul fenilpiruvic aprut sub aciunea fenildeaminazei produs de bacterie. - testul lizindecarboxilazei este pozitiv dac are loc alcalinizarea mediului, vizibil prin colorarea n violet, datorit trecerii lizinei n cadaverin prin pierderea gruprii carboxilice. n cazul reaciei negative, mediul are culoarea galben deoarece nu are loc decarboxilarea lizinei, ia r acidul carbonic rezultat din metabolizarea glucozei existente n mediu produce o acidifiere care, nemaifiind tamponat de cadaverin ca n situaia de mai sus, determin virarea culorii n galben. Testul MIU (mobilitate indol uree) Compoziia mediului de baz: - pepton protease Difco (10 g), - extract de carne (5 g), - clorur de sodiu (5 g), - fosfat monopotasic (2 g), - agar (3 g), - rou fenol soluie 1/500 (6 ml), - ap distilat (900 ml). Se dizolv substanele, se ajusteaz pH-ul la 6,8-6,9 , se repartizeaz n baloane de 90 sau 180 ml. La 91 ml mediu de baz topit se adaug 10 ml soluie uree -glucoz (20 uree g + 1 g glucoz la 100 ml ap), sterilizat n prealabil prin filtrare. Se solidific n poziie vertical. Mediul este galben - transparent. nsmnarea se face prin nepare n profunzimea coloanei de mediu. Pentru detectarea indolului se introduce o band impregnat cu reactiv Ehrlich, fixnd -o cu ajutorul dopului astfel nct captul colorat n galben s rmn la aproximativ 1 cm distan de suprafaa mediului. Interpretare: - mobilitatea se consider pozitiv dac mediul devine opalescent uniform i negativ dac apare cultura numai pe linia de nsmnare,

- testul ureazic este pozitiv cnd culoarea mediului este virat din galben n rou, datorit formrii NH3 care alcalinizeaz mediul; - testul indolului este pozitiv dac se schimb culoarea reactivului de pe band, din galben, n rou sau violet. Dac lipsesc benzile, prezena indolului se poate pune n eviden prin adugarea reactivului Ehrlich-Kovacs la suprafaa mediului, dup 24-48 ore de incubare. B. SISTEMELE MICROTEST Pentru a reduce volumul considerabil de munc, materiale i timp pe care la reclam deseori testele utilizate n vederea ncadrrii taxonomice a unei tulpini nou izolate, n ultimi ani se recurge tot mai mult la miniaturizarea metodelor convenionale de lucru, mai ales n cadrul examinrii caracterelor metabolice ale bacteriilor. Iniial propuse pentru identificarea enterobacteriaceelor, ele au fost extinse ulterior i pentru alte grupri taxonomice. n aceste sisteme, testele sunt selectate ntr -o anumit formul care s permit identificarea unui grup de microorganisme. n ultimii ani au fost propuse numeroase sisteme microtest, cunoscute sub diverse denumiri comerciale (API; Enterotub II, ID32 etc.). Sistemele API , de exemplu, permit efectuarea comcomitent a 20 de teste biochimice i o bun identificare a celor mai importante bacterii de interes medical. Acest sistem utilizeaz stripuri din material plastic, cu 20 de microtuburi n care se gsesc medii speciale deshidratate. Se efctueaz o suspensie n ser fiziologic a 1 -2 colonii de pe agar a bacteriei de identificat, care se distribuie apoi n godeurile (microtuburile) stripului. Pentru realizarea condiiilor de anaerobioz n unele godeuri (menionate n prospect), se adaug ulei mineral steril. Dup o incubare de 24 de ore la 370 C, se citesc i se noteaz reaciile pozitive pe baza modificrilor de culoare din fiecare godeu (fig 13). Identificarea bacteriei testate poate fi fcut pe baza unor tabele de identifi care sau computerizat.

Fig.13 Sisteme de identificare API 20 E pentru identificarea enterobacteriaceelor.