HISTOCHIMIE

SI HISTOENZIMOLOGIE METODA FROTIURILOR n se realizeaz intinderea celulelor n monostrat pe o lamel de sticl. n Pot fi examinate : 1. celulele sangvine 2. celulele epiteliale descuamate sau exfoliate 3. sedimentele celulare 4. amprente de esuturi sau organe parenchimatoase TIMPII n recoltare n ntindere: se folosesc dou lame de sticl u lama portobiect cea pe care se efectueaz frotiul u lama executoare cu care se ntinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45. n uscare METODA PANOPTICA PAPPENHEIM n pentru colorarea frotiului sangvin. 1. solutia May-Grunwald conine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic i glicerin neutr 2. solutia Giemsa contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra Frotiul trebuie sa fie : n subire cu un singur strat de celule n ntins uniform n ambele margini pe lama n se termin n franjuri pe lam , ocupnd cca. 2/3 din aceasta n la margine se scrie numele pacientului sau un nr. de ordine REZULTATE n nuclei violet n citoplasmele agranulocitelor albastru citoplasmele granulocitelor roz n granulaii: u neutrofile rou- violet u bazofile albastru nchis spre negru u eozinofile rou portocaliu HISTOCHIMIA n interpretarea biochimic a celulelor sau esuturilor n raport cu oranizarea lor celular. PRINCIPIU Se bazeaz pe afinitatea pe care o au unii colorani pentru anumite grupri chimice pe care vrem s le localizm. n Substanele chimice celulare i tisulare se identific prin reacii chimice care duc la obinerea de compui colorai , insolubili i observabili la M.O. n HISTOFOTOMETRIA = analiz cantitativ, n funcie de intensitatea culorii Conditiile minime necesare unei reactii histochimice n substana analizat

u s se conserve in situ , u fixarea utilizat trebuie s conserve structura celulei i s mpiedice deteriorarea componentelor celulare u metoda folosit trebuie s fie specific pentru substana sau gruprile chimice care vor fi examinate. Conditiile minime necesare unei reactii histochimice n produsul de reacie - insolubil previne dispersia sau difuzia produsului de reactie - colorat permite examinarea n reactivul histochimic trebuie s fie specific. HISTOCHIMIA GLUCIDELOR n monozaharide solubile n oligozaharide n polizaharide - libere sau combinate cu proteine n METODA PAS ( per-iodic acid Schiff) n METODA CU CARMIN AMONIACAL BEST n BAZOFILIA n METACROMAZIA METODA PAS n evidenierea glicogenului, GAG, glicoproteinelor si glicolipidelor. n PRINCIPIU grupri glicol oxidare cu acid periodic grupri aldehidice + cu reactivul Schiff precipitat rosu violaceu vizibil la M.O. METODA PAS- GLICOGEN n specificitatea metodei depinde de pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei salivare. Se consider c structurile colorate PAS care dispar n urma pretratamentului cu amilaz conin glicogen CARMIN AMONIACAL BEST n evideniaz glicogenul - polimer cu solubilitate redus n ap . Daca fixarea lui nu este prompt, enzimele hidrolitice l descompun n glucoz care este foarte solubil n ap i difuzeaz. n REZULTATE : granule roii n citoplasm BAZOFILIA n proprietatea substanelor glucidice de a se colora cu colorani bazici de tipul albastru alcian i albastru de metil. n poate fi utilizat i pentru evidenierea lipidelor i proteinelor cu caracter acid METACROMAZIA n Capacitatea unui substrat de a se colora ntr-o alt culoare dect cea a colorantului. n PRINCIPIU: - existena unor grupri anionice aflate la o distan foarte mic una de alta formnd agregate cu proprieti de absorbie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate.

HISTOCHIMIA LIPIDELOR n PRINCIPIU: colorantul trebuie s fie mai solubil n lipide dect n propriul solvent SUDANOFILIA Colorani Sudan : III rou-portocaliu IV rou B negru BB albastru HISTOCHIMIA PROTEINELOR n detecteaz structura primar a proteinelor n Reacii nespecifice proteinele celulare i tisulare sunt identificate pe seama aminoacizilor n Reacii specifice folosite pentru identificarea heteroproteinelor HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reacii nespecifice u Tirozina Reacia MILLON u Arginina Reacia SAKAGUSHI pentru studiul distributiei proteinelor bazice in nucleu u Triptofan Reactii specifice n folosite pentru identificarea heteroproteinelor de ex. nucleoproteinele care se evideniaz pe seama acizilor nucleici. 1. Metoda FEULGEN 2. Bazofilia 3. Metoda BRANCHET Reactii specifice n METODA FEULGEN Molecula AND hidroliza acida dezoxiriboza + reactiv Schiff precipitat rou-violaceu Reactii specifice METODA BRANCHET( verde metil-pironin) n cercetarea bazofiliei dat de acidul fosforic din structura acizilor nucleici n verde de metil are afinitate pentru ADN-ul nuclear pe care l coloreaz n verde n pironina ARN-ul nucleolar si citoplasmatic, pe care l coloreaz n rou HISTOCHIMIA ENZIMELOR n evideniaz localizarea i activitatea enzimelor. n PRINCIPIU: - reacii chimice care au ca rezultat un compus colorat i insolubil. In cazul n care produsul rezultat este solubil , se insolubilizeaza printr-o reacie de CAPTUR. ETAPELE OBINERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC n recoltarea n fixarea prin congelarea rapid la temparaturi foarte joase n secionarea

n incubarea ntr-un mediu care ofer enzimei conditii ct mai apropiate de cele n vivo. n montarea se realizeaza n mediu hidrosolubil glicerina sau sirop Apathy REACII CITOENZIMOLOGICE n METODA PEARSE- evideniaz dehidrogenazele n METODA GMRY ( captura de ioni metalici)- evidentierea hidrolazelor METODA PEARSE n peroxidaze n Succinatdehidrogenaz APLICAII PRACTICE - SDH enzima marker a mitocondriilor METODA GMRY( captura de ioni metalici) n pentru evidentierea fosfatazelor n PRINCIPIU - o reacie de precipitare a acidului fosforic eliberat de enzim de la nivelul substratului Compusul rezultat din aciunea enzimei reacioneaz cu: u sulfura de amoniu pentru a produce un precipitat negru u sulfura de cobalt pentru hidrolaza alcalin u sulfura de plumb pentru cea acid n APLICAII PRACTICE - evidenierea fosfatazei alcaline enzim cu rol de transport