Biocel-LP4- Coloratii histologice

COLORAREA / IMPREGNAREA
- etapă importantă în realizarea preparatului microscopic permanent pentru MO
- în ME, există corespunzător contrastarea (citrat de plumb şi acetat de uranil)
COLORAREA
-etapa prin care se urmăreşte creşterea contrastului dintre diferitele componente
celulare/tisulare prin capacitatea substratelor morfologice (care conţin proteine, acizi nucleici,
alte macromolecule) de a lega diferenţiat coloranţii.
Metoda de colorare depinde de natura fixatorului utilizat şi de ţesutul pe care dorim să îl
examinăm.
COLORANTUL HISTOLOGIC
-substanţă colorată, de obicei de natură organică, ce poate intra în celulă ataşându-se la nivelul
componentelor celulare şi permiţând astfel diferenţierea lor optică.
N.B. Nu toate substanţele colorate sunt coloranţi!
COLORANŢII (caracteristici chimice)
- grupări cromofore – purtătoare de culoare
- grupări auxocrome – capacitatea de a colora
1. Ionizate (principale) – formează legături electrochimice cu substratul
2. Neionizate (secundare) – formează legături de hidrogen cu substratul. Acest tip de legatură
măreşte stabilitatea interacţiunii colorantului cu substratul
CALASIFICAREA COLORANTILOR
După provenienţă:
Naturali:- vegetali: hematoxilina, safranina, orceina, turnesolul
- animali: carminul
Sintetici: albastru de metil, eozina, acid picric, fuxina
După caracterele chimice:
Acizi (sunt de obicei săruri de acizi organici) ex. eozina
- gruparea auxocromă principală are sarcină (-)
- se ataşează pe un substrat morfologic cu sarcini (+)
Bazici
- gruparea auxocromă principală încărcată electric (+)
- deci se va ataşa pe un substrat încărcat (-) ex. Hemalaun
Neutri
- amestecuri de coloranţi bazici şi acizi într-o anumită proporţie
- tetraoxid de osmiu
MECANISMUL COLORĂRII
Fixarea coloranţilor, prin grupările auxocrome, de componente biochimice din celule/ţesuturi
(grupările funcţionale din proteine, acizi nucleici, structuri glucidice oligo-, poli-zaharide).
Colorantul bazic (ex. hemalaunul) leagă substrat acid (acizii nucleici) din nucleu, colorându-l
în albastru-închis / violet
Colorantul acid (ex. eozina) leagă substrat bazic (proteinele ) din citoplasmă care va fi
colorată în roz/roşu
ETAPELE COLORĂRII
1. Deparafinarea
2. Hidratarea
3. Mordansarea (la nevoie)
4. Colorarea propriu-zisă
5. Spălarea
6. Deshidratarea
7. Clarificarea
METODE DE COLORARE
1. În funcţie de momentul colorării
2. După nr. de coloranţi utilizaţi
3. După mecanism
4. După metoda de obţinere a coloraţiei optime
5. În funcţie de raportul dintre rezultatul colorării şi culoarea colorantului
1. Momentul colorării
Coloraţii vitale:
- colorant vital care este încorporat de animal în timpul vieţii;
- colorant vital folosit pentru evidentierea viabilitatii celulelor din culturi celulare; (persistă
numai atât timp cât celulele supravieţuiesc in vitro)
Coloraţii permanente:- pentru colorarea preparatelor permanente
Coloraţii vitale:-verde Janus B-( pentru evidentierea mitocondriilor),
- albastru de tripan.
Colorații permanente: COLORAȚIA MASSON (colorație tricromă)
1. hematoxilină ferică
2. soluţia colorantă A (cu fuxină acidă)
3. soluţia colorantă B (cu albastru de anilină)
REZULTATE
1. Nuclei – negru
2. Citoplasma – roşu – violet deschis
3. Fibrele de colagen – albastru intens

2. Număr de coloranți
a. colorații simple – folosesc un singur colorant ( colorația Giemsa ex:fibroblaste in cultura)
b. colorații combinate (policrome) – folosesc 2 sau mai mulți coloranți:
 Succesivă - ex. hemalaun - eozină
 Simultană - ex . azan (coloraţie tricromă)
Colorații combinate- COLORAȚIE AZAN
1. azocarmin C
2. albastru Heidenhein (cu anilină şi orange G)
REZULTATE
Nuclei – roşu – viu
Citoplasma – roşu
Fibre de colagen – albastru deschis
Ţesut muscular striat – roşu , orange sau galben
3. Mecanismul colorării
- colorație directă: asigurată de simpla interacţiune dintre colorant şi substrat
- colorație indirectă: necesită prezenţa unui mediator (MORDANT- ex ac. tanic), între
colorant şi substrat. Acesta intermediază fixarea colorantului de componentele
celulare/tisulare.
4. Metoda de obţinere a coloraţiei optime
- progresive – prin imersări succesive până se ajunge la momentul optim de colorare (ex.H.E.)
- regresive – prin acţiunea prelungită a colorantului, până la obţinerea unei supracolorări, apoi
se acţionează cu un agent chimic decolorant (diferenţiator): ex. coloraţia Nissl- corpii Nissl se
coloreaza in violet (SN))
Colorație progresiva:
COLORAŢIA HEMALAUN-EOZINĂ (HE)
-cea mai utilizată colorație;
-foloseşte 2 coloranţi:
1. hemalaunul – colorant bazic
2 . eozina – colorant acid
REZULTATE
nucleu: albastru – violet
citoplasma: roz – roşu
5. Rezultatul colorării şi culoarea colorantului
- ortocromatică – substratul se colorează în aceeaşi culoare ca şi cea a colorantului
(majoritatea)
- metacromatică – substratul se colorează în altă culoare decât cea a colorantului (ex. albastru
de toluidină)
Colorație ortocromatică – VAN GIESON
(colorație tricromă) folosită în anatomia patologică
1. hematoxilină ferică
2. acid picric
3. fuxină acidă
REZULTATE
1. Nucleii – negri
2. Citoplasma – galben
3. Fibrele de colagen – rou intens
METACROMAZIA
Capacitatea unui substrat de a se colora într-o altă culoare decât cea a colorantului.
Principiu:
- existenţa unor grupări funcţionale aflate la o distanţă foarte mică una de alta;
- colorantul se dispune ordonat şi foarte aproape moleculă de moleculă permiţând reaşezări
ale electronilor la alte nivele energetice şi absorbţia de alte lungimi de undă din spectrul
vizibil.
Colorație metacromatică –ALBASTRU DE TOLUIDINĂ
granulaţiile din mastocite se coloreaza metacromatic în roşu – violet
IMPREGNĂRILE METALICE
Principiu: precipitat de metal redus, după ce se leagă în formă ionică pe diferitele elemente
din ţesuturi, evidenţiind structuri care în mod obişnuit nu se colorează. (cele mai folosite sunt
impregnările cu săruri de Ag, Au, Os, Hg)
- IMPREGNAREA ARGENTICĂ – folosită pentru evidenţierea elementelor din ţesutul
epitelial sau conjunctiv şi în studierea sistemului nervos (structurile vizate apar brun-negre,ex:
fibrele de reticulină apar colorate în negru, evidentierea prelungirilor neuronale in negru).
COLORATII TOPOGRAFICE - utilizate pentru evidențierea celulelor în ansamblul
țesutului(cele prezentate pană acum)
COLORATII CITOLOGICE - utilizate pentru evidențierea anumitor organite celulare
METODA CAJAL DA FANO-evidenţierea complexului Golgi
Rezultate:
Nucleii: necoloraţi
Aparatul Golgi – reţea perinucleară de culoare neagră
Citoplasma – aurie
METODA HEMATOXILINA FERICĂ REGAUD - evidenţierea mitocondriilor
Rezultate:
Nucleii – necoloraţi
Nucleolul – negru
Mitocondriile – granulaţii negre
METODA FROTIURILOR se realizează întinderea celulelor în monostrat pe o lamă de sticlă.
Pot fi examinate :
1. celulele sangvine
2. celulele epiteliale descuamate sau exfoliate
3. sedimentele celulare
4. amprente de ţesuturi sau organe parenchimatoase
Calitățile unui bun frotiu:
• subţire – cu un singur strat de celule
• întins uniform
• ambele margini pe lamă
• se termină în franjuri pe lamă, ocupând cca. 2/3 din aceasta
• (la marginea liberă se scrie numele pacientului sau un nr. de ordine)
METODA PANOPTICĂ PAPPENHEIM ( M.G.G.) – colorație topografică
• pentru colorarea frotiului sangvin
1. soluţia May-Grünwald – conţine eozinat de albastru de metilen solubilizat în amestec de
alcool metilic şi glicerină neutră
2. soluţia Giemsa – contine eozinat de azur de metilen solubilizat în amestec de alcool metilic
si glicerină neutră
Timpii executării unui frotiu sangvin:
-recoltare
-întindere (se folosesc două lame de sticlă)
-lama portobiect – cea pe care se efectuează frotiul
-lama executoare – cu care se întinde frotiul, prin glisare la un unghi de 45°
-uscare (fixare fizică)
-colorare - FROTIUL SANGVIN- coloratie M.G.G.
Rezultate:
Nucleu: violet Nucleu: violet
Citoplasma granulocitelor – roz
Granulaţii:- neutrofile : roşu-violet
- bazofile : albastru închis spre negru
- eozinofile: roşu-portocaliu
Citoplasma agranulocitelor – albastru
HISTOCHIMIA – Modalitate de evidenţiere specifică a unor biomolecule în ţesuturi.
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR – permite evidenţierea:
- structurilor glucidice de pe proteine (glicoproteine, proteoglicani) şi de pe lipide(glicolipide)
- polizaharidelor (glicogen)
!N.B. Mono- sau di-zaharidele nu se pot evidenţia deoarece sunt solubile şi se pierd în timpul
pregătirii probelor
• METODA PAS(periodic acid-Schiff) -evidentierea glicoproteinelor (ex. cel. caliciforme din
mucoasa intestinala)
• METODA CU CARMIN AMONIACAL BEST- identificarea glicogenului (ex.cel. hepatice
• BAZOFILIA (pentru cele încărcate negativ)
• METACROMAZIA
HISTOCHIMIA LIPIDELOR
Principiu: colorantul este mai solubil în lipide decât în propriul solvent, acumulându-se în
incluziunile lipidice
SUDANOFILIA
• Coloranţi Sudan :– III – roşu-portocaliu
– IV – roşu
– B – negru
– BB – albastru
Exemplu: celule adipoase din mezenter
HISTOENZIMOLOGIA: evidenţiază localizarea enzimelor pe baza activităţii lor
Etapele obţinerii unui preparat citoenzimologic:
• recoltarea
• fixarea – prin congelarea rapidă la temparaturi foarte joase
• secţionarea
• incubarea cu substratul – într-un mediu care oferă enzimei condiţii cât mai apropiate de cele
în vivo.
• montarea – se realizează în mediu hidrosolubil – glicerină sau sirop Apathy
METODA PEARSE: evidenţiază dehidrogenazele (succinatdehidrogenaza- SDH enzima
marker a mitocondriilor)---celule musculare striate
METODA GÖMÖRY: captură fosfat de plumb (incolor) care se transformă în sulfură
deplumb (neagră) – evid. activităţii fosfatazelor acide---pol apical al nefrocitelor