Lp5-Biocel

Procedee microscopice de investigare celulară prin folosirea anticorpilor

Definiţia noţiunii de anticorp

 ANTICÓRP s. m. proteină specifică elaborată de organism ca răspuns la pătrunderea unui
antigen. (< fr. anticorps) (DEX)
N.B. Prin antigen înţelegem orice proteină străină de organismul care produce anticorpul.
 imunoglobulină, în forma literei “Y”, produsă de limfocitele B, folosită de sistemul imun pentru
identificarea și neutralizarea particulelor străine.
 Interacționează specific cu o secvență de aminoacizi (EPITOP) din structura unei proteine
(ANTIGEN)
 Fiecare braț al anticorpului conține un paratop, care este specific pentru un singur epitop.
Structura generală a anticorpilor
1. Regiunea Fab
2. Regiunea Fc
3. Lanț greu
4. Lanțurile ușoare
5. Paratop
6. Regiune balama
Metode de utilizare a anticorpilor în microscopie
• Imunomarcare pentru microscopia optică
– Imunohistochimia
– Imunofluorescența
• Imunomarcare pentru microscopia electronică
– Imuno-electrono-microscopia
Metode de imunomarcare pentru microscopie
• Metoda directă(anticorp primar marcat)
• Metoda indirectă(anticorp primar nativ și anticorp secundar marcat)
Imunomarcarea
 Reprezintă totalitatea tehnicilor care folosesc anticorpi pentru localizarea antigenelor
corespunzătoare
– pe secțiuni tisulare
• Criosecțiuni
• Secțiuni la parafină
– pe celule în cultură
• Face posibilă vizualizarea distribuției și localizării componentelor celulare în microscopie optică
Principiul metodei:
• Recunoașterea specifică a unui antigen (Ag) de către un un anticorp (Ac)
• Ac sunt purificați din serul animalelor de laborator
• Ac vor fi cuplați cu un sistem de detecție
– ENZIMĂ căreia i se furnizează un SUBSTRAT care va fi transformat într-un compus colorat
(IMUNOHISTOCHIMIE)
• Vizualizare în microscopie optică, cu lumină directă
– MOLECULE FLUORESCENTE (IMUNOFLUORESCENȚĂ)
• Vizualizare în microscopie de fluorescență
Imunohistochimia
Enzima Substrat Culoare
Proxidaza de hrean Horseradish 3,3'-diaminobenzidină (DAB) Brun-negru
peroxidase (HRP)
Forfataza alcalină Combinație de clorură de Negru – violet
Alkaline phosphatase (AP) tetrazoliu (nitro blue tetrazolium
chloride NBT) și 5-bromo-4-
cloro-3-indolil-fosfat (BCIP)
Ce structuri celulare pot fi marcate ?
• Structuri membranare
• Organite celulare
• Componente nucleare
Fluorescenta
 O variantă de luminiscență
 O moleculă capabilă de fluorescenţă (fluorofor, sau fluorocrom) excitată cu lumină de o anumită
lungime de undă, va emite o radiație electomagnetică cu o lungime de undă superioară, în spectrul
vizibil
 Parametrii:
– Spectru de absorbție/excitație
– Spectru de emisie
– Intensitate
– Durată
Imuno-electrono microscopia
Date generale:
• Metoda a fost introdusă pentru prima oară în 1971 de către Faulk & Taylor
• Folosește anticorpi adsorbiţi pe particule de aur (5-30 nm)
• După caracteristicile anticorpului primar şi structura celulară căreia se adresează marcarea se poate
realiza:
– pre-includere
– post-includere
• Metoda mai scumpă și mai laborioasă
Scop:
• Cea mai bună metodă pentru detectarea și localizarea proteinelor în diferite compartimente celulare
datorită puterilor de mărire și de rezoluție superioare.