Biocel- LP3

Pregătirea preparatelor pentru tehnicile de microscopie

Cerințe necesare pentru o examinare precisă:

- Celulele și celelalte elemente prezente în țesut să fie păstrate în condiții cât mai apropiate de
condițiile lor naturale (FIXARE)
- Preparatul să fie transparent, subțire, plat
- Diferitele componente să fie colorate diferit (COLORARE)
Posibilități de preparare
- secțiuni - „in toto” (structuri/organisme mici, suficient de subțiri pt. a fi întinse pe o lamă)
- zdrobire (pt. studiul conținutului celulei)
- frotiuri (celule suspendate în fluid)
- culturi celulare
Preparatul microscopic permanent
• Modalitatea de examinare a unor celule, fragmente de ţesut sau organ, cărora li s-au suprimat
procesele vitale prin fixare
• Permite examinarea la microscopul optic a principalelor caracteristici ale celulelor şi a modului lor
de organizare
Un preparat microscopic este alcătuit din:
1. obiect de examinat (subţire şi transparent)
2. mediu de montare (transparent)
3. suport de montare (lamă şi lamelă/grilă)
Scopul realizării: – de a conserva
- structurile celulare şi
- raporturile dintre ele pe un timp nelimitat.
Este folosit în:
- clinică
- laboratorul de anatomie patologică
- medicină legală
- cercetare
- scop didactic
Etapele obţinerii preparatului microscopic permanent:
1. Recoltare
2. Fixare
3. Deshidratare
4. Includere
5. Secţionare
6. Rehidratare
7. Colorare sau impregnare/contrastare
8. Montare (între lamă şi lamelă/pe grilă)
9. Etichetare
 Fromaldehida nu este un fixator bun al lipidelor
 Tetraoxiful de osmiu pastreaza structura lipidelor
 Dupa ce se obtine o sectiune proba trebuie deparafinata prin trecerea in xilol, in concentratii
scazande de alcool
1. Recoltarea
-Operaţia prin care fragmentul de ţesut/organ este prelevat de la om, animal viu sau de la cadavru.
*dimensiunea pieselor să nu depăşească 5 mm
* instrumentele bine ascuţite pentru a evita zdrenţuirea şi pierderea paralelismului dintre planuri
*adecvată în funcţie de tipul organului; se vor evita modificările de volum, formă şi relief

RECOLTAREA BIOPSICĂ
• Se recoltează de la om sau animal viu şi se practică în scop diagnostic.
• Se realizează prin :
 1. raclare
2. puncţie-biopsie
3. aspiraţie cu ac fin
4. intervenţie chirurgicală
-biopsie incizională
- biopsie excizională
RECOLTAREA NECROPSICĂ
(cât mai aproape de momentul decesului) pentru a evita procesele de autoliză
• recoltarea de la cadavrele umane se practică în laboratoarele de anatomie patologică şi medicină
legală cu scopul de a confrunta datele de anatomie clinică şi tanatogenetice
• după sacrificarea animalului, în scop de cercetare sau didactic
2. Fixarea
 etapă critică pentru un bun preparat
 proces fizic sau chimic prin care: - sunt oprite rapid procesele vitale (celulare),
- păstrându-se cu alterări minime:
- volumul,
- forma,
- relieful şi
- raporturile moleculare (în structuri/ultrastructuri) şi spaţiale (între structuri/ ultrastructuri)
Prin fixare urmărim:
1.Conservarea ţesuturilor
2.Prevenirea pierderii de constituenţi celulari
3.Creşterea diferenţierii optice a structurilor celulare
4.Mărirea consistenţei ţesuturilor în scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape şi mai ales
pentru secţionare
Fixare MO:
Fizică: criofixare, uscare
Chimică: alcool metilic, acetonă, formol
Fixare ME:
• Fixare dublă
• Fixare cu glutaraldehidă
• Stabilizează proteinele
• Postfixare cu tetroxid de osmiu
• Stabilizează lipidele şi proteinele
*In fixarea chimica contrastul este mai mare
*In crioelectrononmicroscopie rezolutia este mai mare
*In crioelectronomicroscopie nu se formeaza cristale de gheata, ci gheata amorfa
*Tip de fixare chimica:
-negative staining
-fixarea in rasini
3. Includerea
- etapa care asigură condiţii pentru secţionarea pieselor
- precedată de deshidratare în soluţii de alcool de concentraţii crescânde
MO- cea mai folosită masă de incluziune: parafina
ME -răşini epoxidice (epon)
4. Sectionarea
MO- cu microtomul (aprox. 5μm)
ME-cu ultramicrotomul (40-100nm)
5. Colorarea
- creşterea contrastului între elementele tisulare sau celulare cu ajutorul coloranţilor
MO:
• Prin metode compatibile cu metoda de fixare
• Pot fi metode universale (HE) sau specifice ţesutului studiat (Nissl)
ME:
• Contrastare în soluții de metale grele (acetat de uranil și citrat de plumb)
6. Montarea
- permite conservarea specimenelor pentru cât mai mult timp
MO:
• între lamă şi lamelă, în diferite medii de montare, iniţial fluide
• Protejarea secţiunilor fragile de eventualele deteriorări
• Conservarea coloraţiei şi asigurarea unui mediu optic omogen şi transparent necesar examinării
microscopice
ME:
• pe grile de cupru
7. Etichetarea
Pe fiecare lamă se notează:
–tipul celular/tisular
–sursa de recoltare
–fixatorul
–metoda de colorare
–data realizării preparatului
Pregătirea preparatului pentru microscopie electronică de baleiaj/scanning (SEM)
-Pentru o imagine convențională de SEM, suprafața probelor de analizat trebuie să fie conductivă
electric și să fie asigurată împământarea pentru a împiedica acumularea încărcării electrostatice a
acestei suprafețe
- Probele biologice sunt acoperite cu un strat foarte subțire de materiale conductive (Au, Au/Pd,
Pt, Os, Ir, Tu, Cr). Există tehnici de SEM care permit examinarea probelor fără acoperire – ESEM
(Environmental SEM).
-Fixare (fizică – prin căldură sau înghețare / chimică)
- Deshidratare (soluții de alcool de % diferite)
- Montare
- Acoperire (învelire) cu metale înalt conductive
- Examinare
CONCLUZIE
Microscopia optică prezintă structura celulei și a țesuturilor. Pentru completarea informațiilor
obținute, se utilizează microscopia electronică, pentru descifrarea ultrastructurii acestora.