Acizii nucleici

Structura ADN
Introducere
• Acizii nucleici sunt produși de policondensare a nucleotidelor
• Au rolul de a păstra și mijloci transferul de informație genetică în lumea vie
• Dogma centrală a biologiei moleculare:

• Se cunosc 2 clase de acizi nucleici:

• Acid dezoxiribonucleic (ADN)
• Acid ribonucleic (ARN)
• ADN conține informația genetică cu privire la biosinteza proteinelor (la om 50 000-100 000
proteine); are rolul de a stoca și transmite această informație la generația următoare
• ARN îndeplinește diverse funcții în procesul de biosinteză a proteinelor:
• ARNm –ARN mesager, transportă informația genetică din nucleu la ribozomi
• ARNt – ARN de transport, transportă aminoacizii necesari biosintezei proteice
ARNr – ARN ribozomal, este component esențial al ribozomilor
Structura acizilor nucleici
• Pentoză – D-b-riboză (în ARN) sau D-b-dezoxiriboză (în ADN)
• Baze azotate – molecule plane, relativ insolubile în apă, având un maxim de absorbție în UV
între 252-271 nm.
– Purinice (derivați ai purinei): adenina (6-amino-purina), guanina (2-amino-6-hidroxi-
purina)
– Pirimidinice (derivați ai pirimidinei): citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina), timina
(2,4-dihidroxi-5-metil pirimidina sau 5-metil uracil; se găsește numai în ADN) și
uracilul ( 2,4-dihidroxi-pirimidina; se găsește numai în ARN)
• Acid fosforic
Baze azotate
• Prezintă tautomerie:
– Lactam-lactim; structurile lactam sunt mai stabile
– Amino-imino (cele care nu conțin grupări hidroxil); structurile amino sunt mai stabile
Nucleozide
• Rezultă prin stabilirea unei legături N-glicozidice între hidroxilul glicozidic de la C 1’ al
pentozei și atomul de N din poziția 9 a unei baze purinice, sau atomul de N din poziția 1 a
unei baze pirimidinice

Ribonucleozide

Dezoxiribonucleozide
Nucleotide
• Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor; în structura acizilor nucleici intră nucleozide fosforilate
la C 5’ al pentozei
• Se pot adăuga 1,2 sau 3 resturi fosfat formând nucleozid mono, di și trifosfați

Nucleotide naturale libere

• Pe lângă nucleotidele care constituie elemente de construcție a acizilor nucleici, există o serie
de nucleotide care îndeplinesc roluri importante în țesuturi:
– Compuși macroergici – ATP, GTP
– Componenți structurali ai unor coenzime – NAD+, NADP+, FAD
– Mesageri secunzi ai unor hormoni – AMPc, GMPc
– Donori de grupări metil – S-adenozil metionina (SAM)
– Acceptori de fosfat în fosforilarea oxidativă – ADP
– Efectori alosterici ai activității enzimelor
Metilxantinele = derivați metilați ai xantinei, identificați la plante; prezintă proprietăți farmacologice

Structura primară covalentă a acizilor nucleici

• Acizii nucleici sunt formați din nucleozide legate fosfat diesteric
• Gruparea –OH de la C 3’ a unui nucleozid este legată de gruparea –OH de la C 5’ a
nucleozidului următor prin legătură fosfat diesterică
• Fiecare catenă are două capete:
– Capătul 5’ – la care gruparea –OH de la C 5’ are atașat un rest fosfat
– Capătul 3’ – la care gruparea –OH de la C 3’ nu este angajată într-o legătură
internucleotidică
• Prin convenție o catenă este scrisă întotdeauna în direcția 5’ – 3’
• În fiecare catenă polinucleotidică (cu mai mult de 50 nucleotide), legăturile dintre nucleotide
au aceeași orientare de-a lungul lanțului, catenele având o polaritate specifică
• Două lanțuri polinucleotidice sunt antiparalele când unul evoluează în direcția 5’  3’ iar
celălalt în direcția 3’  5’
• Diversitatea polinucleotidelor este dată de bazele azotate legate de scheletul format de
moleculele de monozaharid legate între ele fosfat diesteric
Structura secundară a ADN
• Propusă de Watson și Crick (1953) pe baza rezultatelor altor cercetători:
– Prin analiză cromatografică s-a stabilit că în toate tipurile de ADN numărul de baze
purinice este egal cu numărul bazelor pirimidinice (A+G = T+C)
– Prin difracție cu raze X s-a stabilit că ADN are 2 perioade de identitate, una de 34 Å
iar alta de 3,4 Å
• Două catene antiparalele formează o dublă elice cu orientare dreaptă, prin răsucire de la
stânga la dreapta în jurul unui ax
• Scheletul extern este format din ciclurile pentozelor legate între ele fosfat diesteric
• Resturile fosfat sunt ionizate și încărcate negativ la pH fiziologic
• Bazele azotate sunt orientate spre interior și perpendicular pe axul helixului
• Între o bază purinică de pe o catenă și o bază pirimidinică de pe cealaltă catenă, numite baze
complementare, se formează legături de hidrogen; adenina se leagă de timină prin 2
legături de hidrogen iar guanina se leagă de citozină prin 3 legături de hidrogen

Structura secundară a ADN (forma B)

• Diametrul moleculei este de 20 Å
• Distanța dintre 2 baze adiacente este
de 3,4 Å
• Pasul elicei are 10 perechi de baze și o
lungime de 34 Å
• Helixul prezintă în exterior două
șanțuri: unul mic, cu lățimea de 12 Å și
unul mare, cu lățimea de 22 Å, prin
intermediul cărora unele proteine și
medicamente vin în contact cu bazele
azotate fără să fie necesară desfacerea
dublu helixului
• Între bazele azotate se stabilesc
legături dipol-dipol, interacții van Der
Waals și interacții hidrofobe; acestea
produc stivuirea bazelor și determină
conformația helicoidală a catenei

Formele structurale A și Z ale ADN

• Structura ADN este dinamică în mediul
apos al celulei
• Pe lângă forma B, predominantă în
celule, pot exista formele A-E și Z.
 • Conformația A – este o elice dreaptă mai compactă, cu un pas de 28 Å si având 11 perechi de
baze
• Conformația Z – corespunde unei elice stângă, cu 12 perechi de baze pe spiră și cu un pas al
elicei de 57 Å. Aspectul catenei este de zig-zag, datorită conformației adoptate de bazele
azotate din componență

Denaturarea și renaturarea ADN

• DENATURARE = ruperea legăturilor de hidrogen și a diferitelor tipuri de interacțiuni dintre
catenele moleculei de ADN se poate realiza prin creșterea temperaturii, la valori extreme de
pH (ADN este stabil între pH 4-10) sau la modificarea tăriei ionice a soluției;
• Aceasta duce la separarea celor 2 catene.
• Dacă denaturarea este determinată de modificări de temperatură procesul se numește
TOPIRE
• Prin denaturare se modifică unele proprietăți fizice ale ADN:
– Scade vîscozitatea
– Crește absorbanța la 260 nm (absorbanța bazelor azotate în catenele libere este cu
40% mai mare decât în ADN = efect hipercrom)
– Crește densitatea
– Se modifică capacitatea de rotire a luminii polarizate

• Denaturarea se poate urmări prin creșterea absorbanței la 260 nm

• Temperatura de topire, Tm, este temperatura la care jumătate din ADN este denaturat
 • Compoziție ADN în baze azotate influențează Tm; un procent mai mare de GC față de AT din
ADN determină o creștere a Tm. Conținutul de perechi de baze GC la om este de 40% iar
punctul de topire in jur de 87 C
• În celule pentru denaturare se folosesc enzime numite helicaze, care utilizează ATP
• pH >11,3 determină deprotonarea bazelor azotate, ceea ce le împiedică să mai formeze
legături de hidrogen
• Se preferă denaturarea cu soluții de baze pentru a preveni ruperea legăturilor fosfat
diesterice (situație posibilă în cazul temperaturilor mari sau a pH acide)
• La adăugarea unor agenți denaturanți (formamida) se produce destabilizarea legăturilor de
hidrogen dintre baze, putându-se face denaturarea la temperaturi mai mici
• Renaturarea este procesul prin care se reface dublul helix prin restabilirea valorilor de pH,
temperaturii sau tăriei ionice la valorile fiziologice
• Renaturarea este folosită în tehnica hibridizării moleculare care permite combinarea unor
catene de ADN sau a unei catene de ADN cu o catenă de ARN dacă există un grad mare de
complementaritate între cele două catene.

Hidroliza acizilor nucleici

• ADN este relativ stabil – poate fi păstrat în soluții apoase la pH ~ neutru
• ADN este rezistent la hidroliza bazică; ARN este hidrolizat la un amestec de 2’ și 3’ nucleotide
• ADN mono și bicatenar precum și ARN poate fi hidrolizat de enzime numite nucleaze:
– Exonucleaze- hidrolizează nucleotidele terminale de la capetele 3’ sau 5’ ale unui lanț
polinucleotidic (ex. ADN polimerazele I și III) producând 3’ mononucleozid fosfați sau
5’ mononucleozid fosfați; se poate produce degradarea totală a acidului nucleic
– Endonucleaze- hidrolizează legături fosfat diesterice din interiorul catenei
polinucleotidice; pot hidroliza și polinucleotide ciclice pentru că nu necesită un capăt
terminal liber
• Deoxiribonucleazele pot fi specifice pentru ADN monocatenar sau dublu catenar
• Un grup special de endonucleaze produse de microorganisme se numesc endonucleaze de
restricție sau restrictaze
• Au fost izolate peste 100 restrictaze și au fost denumite în funcție de specia bacteriană de la
care au fost izolate (deoarece fiecare bacterie conține mai multe restrictaze, se utilizează o
cifră romană pentru a identifica fiecare enzimă)
• Enzimele recunosc secvențe specifice, numite secvențe de recunoaștere având 4-6
nucleotide și taie ambele catene
• Secvențele de recunoaștere sunt palindroame = secvențe cu dublă simetrie rotațională, în
care secvența nucleotidică, citită pe ambele catene în direcția 5 ’  3 ’ este identică
• Unele endonucleaze de restricție taie ADN bicatenar formând capete boante, drepte,
neadezive (“blunt ends”), altele formează capete monocatenare, coezive (“sticky ends”)
 • O enzimă de restricție are aceeași secvență de recunoaștere indiferent de sursa ADN
(bacterian, din plante sau din animale)
• O moleculă de ADN poate să nu aibă nici un situs de recunoaștere, unul sau mii de situsuri
• Capetele ADN pot fi legate de ADN ligază rezultând ADN recombinat, utilizat în ingineria
genetică, diagnosticul prenatal al unor boli genetice sau la alcătuirea hărților de restricție
• La bacterii enzimele de restricție au rol de protecție împotriva infecțiilor virale; bacteria își
metilează A și C din secvența de recunoaștere și astfel și-o protejează
Organizarea ADN la procariote și eucariote
• Moleculele de ADN au de la câteva perechi de baze (virusuri mici) până la miliarde de perechi
de baze (plante, animale)
• Cu excepția unor bacteriofagi care au ADN moncatenar, majoritatea moleculelor de ADN
sunt dublu catenare, liniare sau circulare
• Moleculele de ADN dintr-o celulă alcătuiesc cromozomii celulei
• Fragmentele cromozomiale care conțin informația genetică cu privire la sinteza unui singur
lanț polipeptidic au fost denumite gene.
• Fiecare cromozom conține un set unic de gene
• Totalitatea genelor cuprinse în cromozomii unei celule constituie genomul acesteia
• La procariote avem un singur cromozom, circular, care conține setul complet de gene
pentru specificarea caracterelor celulei (4,6 x 10 6 perechi de baze, lungime aprox. 1,6 mm)
• În celulele procariote, ADN este distribuit într-o masă cromozomială
• În citoplasma celulei se află cantități mici de ADN extracromozomial. Aceste molecule se
numesc plasmide și conțin o cantitate redusă de informație genetică.
• Plasmidele:
– Trec ușor prin membrana celulei gazdă
– Molecule mici, ce codifică gene accesorii - conțin gene ce le conferă bacteriei
rezistență la antibiotice
– Se autoreplică extrem de rapid, independent de ADN cromozomial
– Pot migra de la o celulă cu rezistență la antibiotic la altă celulă, cu sensibilitate la
antibioticul respectiv, făcând-o și pe aceasta rezistentă (pericol pentru terapia cu
antibiotice)
– Sunt utilizate în manipularea genică, fiind vectori pentru fragmente străine de ADN
• La eucariote ADN se află în nucleu
• În perioadele de repaus, materialul se găsește sub formă de cromatină = material amorf,
dispersat în nucleu, care conține ADN, proteine bazice (histone), proteine nehistonice
(hertine) și mici cantități de ARN
• În timpul mitozei cromatina se condensează și se subdivide în cromozomi = complexe ADN-
proteine (o singură moleculă de ADN)
• Genomul uman constă în 46 cromozomi grupați în 23 perechi și conține aproximativ 6 x 10 9
perechi de baze
• Cea mai mare parte a genomului este necodificatoare având rol în reglarea exprimării
genelor în timpul dezvoltării, diferențierii și adaptării la condițiile de mediu
• În mitocondrii se află molecule de ADN circular, cu masă mică, care diferă de ADN nuclear
prin structură și proprietăți (reprezintă 1% din ADN total) ; specifică proteine mitocondriale,
cum ar fi proteine ale lanțului respirator; majoritatea proteinelor mitocondriale sunt însă
specificate de ADN nuclear.
Cromozomii eucariotelor
• Fiecare cromozom conține o singură moleculă de ADN cu o lungime de aprox. 2 m !!!
• Împachetarea presupune scurtarea de 10 000 ori a lungimii sale
• Primul stadiu în condensarea ADN, realizând un grad de compactare egal cu 7, este
nucleozomul
• Nucleozomul este unitatea de bază a cromatinei; fibra de cromatină arată ca un “șirag de
mărgele”, mărgelele fiind nucleozomii iar “ața”= porțiuni de ADN liber (ADN de legătură cu
8-120 perechi de baze)
• Histonele sunt proteine bazice, cu masă moleculară mică, care interacționează ionic cu
anionii fosfat din catenele de ADN
• Există 5 clase de histone:
– Histone bogate în lizină – H2A, H2B
– Histone bogate în arginină – H3, H4
– Histone de legătură – H1, cu rol de protejare a ADN de acțiunea nucleazelor
 Nucleozomul are forma unui cilindru turtit și cuprinde un octamer histonic constituit din
2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4 în jurul căruia se înfășoară de aprox. 2 ori, cu răsucire spre stânga, o
secvență de ADN având aprox. 140 perechi de baze
 Histona H1 se leagă de ADN de legătură; ea are rol esențial în etapa următoare de
compactare cu formarea unei structuri care arată ca un solenoid și care asigură o scurtare de
40 ori a moleculei de ADN
 Solenoizii se asociază între ei determinând o condensare suplimentară
 Proteinele nehistonice din structura cromatinei au rol în destinderea stării condensate a
cromatinei, pentru a permite replicarea și transcrierea și în viabilitatea celulei

Nucleozom

Solenoid