ELECTROFOREZA

!!! Se foloseste pentru

 proteine (proteine plasmatice, proteine urinare, hemoglobina, enzime),
 lipide
 acizi nucleici

Principiu:
 metoda de identificare
 separare
 si cuantificare
a substantelor in functie de viteza de migrare a acestora intr-un camp electric. 

Viteza de migrare a unei molecule intr-un camp electric depinde de:

a. Intensitatea curentului electric (E)

 Intensitatea este invers proportionala cu sensibilitatea metodei.

b. Sarcina electrica a moleculei (q)

c. Coeficientul de frecare care depinde de masa moleculara si forma moleculei (f)

 v=qE/f

d. pH solutiei
 se folosesc solutii tampon sau buffer pentru a obtine un pH convenabil
pentru electroforeza

e.Vascozitatea suportului de migrare sau matrix

 solid/semisolid/lichid
 avand rol de sita moleculara
PRINCIPIILE SEPARARII:

1. In functie de sarcina electrica (q)

ANIONI (-) migreaza spre ANOD (+)
CATIONII (+) migreaza spre CATOD (-)

2.In functie de dimensiunile moleculei

 particulele mici migreaza mai rapid decat cele mari

COMPONENTE SISTEM DE ELECTROFOREZA

1. SUPORT DE MIGRARE/MATRIX

a. Solid
- hartia de filtru
- acetat de celuloza (gamapatii, hemoglobina)

b.Semisolid/gel
Avantaje:
 actioneaza ca o sita moleculara
 impiedica difuzia probei
 permite o inregistrare permanenta a rezultatelor

gel agaroza (polimer a galactozei)

 se foloseste pentru separare
 proteine folosind punctul izoelectric (Izoelectric
focusing electrophoresis)
 si a acizilor nucleici folosind dimensiunea lor

-gel de poliacrilamida
 se foloseste pentru separare proteine folosind masa lor moleculara
 are un marker de greutate care contine proteine cu masa moleculara cunoscuta.
c.Lichid
 solutie tampon care se foloseste pentru separare fragmente de AND mai mari de
107 perechi de baze (PEGE - pulsed field gel electrophoresis).

2.PROBA
contine:
- substanta de analizat
- colorant 
- glicina
- agenti denaturanti 

a. Detergenti (rup legaturile hidrofobe)

- SDS (dodecil sulfat de sodiu)

b.Beta mercaptoetanol (rupe legaturile disulfurice)

c.Uree, guanidina (rup legaturile de hidrogen si hidrofobe)

3.SURSA DE CURENT
= generator de curent continuu care nu trebuie sa depaseasca voltajul de 10V/cm.

4. SISTEMUL TAMPON/ BUFFER

care trebuie ales in functie de:
a) Natura moleculelor 
b) Taria ionica a sistemului tampon (nu trebuie sa modifice continutul probei).
Tipuri de electroforeza:
1. Electroforeza in gel
2. Electroforeza capilara.

SDS-PAGE (proteine)

1. SDS (dodecil sulfat de sodiu)

 este un detergent anionic care incarca negativ proteinele
 Se introduce in gel, buffer, proba!!!!
 Proteinele vor deveni anioni (-) si vor migra spre anod (+), astfel migrarea va avea
loc intr un singur sens de la catod la anod.
 Aceasta metoda foloseste masa moleculara a proteinelor ca principiu de separare.

2. PAGE (electroforeza pe gel de poliacrilamida)

 Gelul prezinta 2 zone:

 Gel de concentrare (rol de ordonare a proteinelor, avand ochiuri
mari de retea)
 Gel de separare (rol in separarea proteinelor, avand ochiuri mici
de retea)

Compozitia gelurilor:
 sistem de tampon fosfat
 SDS 10%
 persulfat de amoniu (initiaza polimerizarea acrilamidei)
 TEMED (NNN`N`) (catalizeaza polimerizarea acrilamidei)
 acrilamida si bisacrilamida.

monomerii de acrilamida polimerizeaza si formeaza pori/ ochiuri de retea!

Dimensiunile porilor/ochiurilor sunt date de concentratia de biscrilamida!!! (o

cantitate mare de bisacrilamida formeaza ochiuri mici si invers)
Observatii:
1. In gelul de concentrare se introduce un coomb, care va forma godeuri in care se vor
introduce probele.
2. Dupa migrare, gelul de concentrare se arunca, iar gelul de separare se coloreaza cu
Brilliant Blue.
3. Se foloseste ser, nu plasma!!!
4. Rezultatele apar ca niste benzi colorate in albastru.
5. Pentru a determina concentratia proteinelor, se introduce gelul in densitometru.

In functie de migrarea electroforetica a proteinelor, acestea se clasifica in:

1. Albumina
2. Alfa 1 globuline
3. Alfa 2 globuline
4. Beta 1 globuline
5. Beta 2 globuline
6. Gamma globuline (imunoglobuline)
Traseul electroforetic (rezultate)

Interpretare rezultate (se compara benzile cu markerul de greutate):

1. Daca dispozitie este normala, dar scade intensitatea benzii => valori scazute ale
proteinelor

2. Daca dispozitie este normala, dar creste intensitatea benzii => valori crescute ale
proteinelor

3. Daca apar fuziuni intre banda beta si gamma =>gamapatii oligoclonale

4. Daca lipseste banda gamma => agamapatii

5. Daca exista benzi multiple, absente sau cu dispozitie anormala=> gamapatii

monoclonale, variante genetice aberante ale proteinei

6. Banda nou aparuta=> alfafetoproteina crescuta apare ca o banda intre albumina si

alfa1; CRP crescuta apare ca o banda in zona gamma.