Universitatea Ovidius

Facultatea de Stiinte Aplice si Stiinte Ingineresti

Master: Chimie alimentara si managmentul produselor alimentare

in

relatie cu mediul-an I

Tehnici de analiz privind determinarea

proteinelor din lapte

Masteranzi: Munteanu Alina

Negrila Elena
Profesor indrumator:Conf. Univ. Dobrinas Simona

Introducere
n lucrarea de fa ne-am propus realizarea unui studiul unor tehnici de
determinare al proteinelor din lapte, reprezentate de analiza cromatografic
(cromatografie n faz lichid de nalt performan HPLC i gaz-cromatografie
GC) i analiza prin electroforez. De asemena dorim s demonstrm utilitatea
tehnicilor de chimie analitic n caracterizarea unui amestec biochimic complex
cum este laptele
Separarea i identificarea proteinelor prezente n lapte se poate realiza prin
dou tehnici de laborator performante - cromatografie n faz invers RP-HPLC
i electroforez monodimensional pe gel de poliacrilamid SDS-PAGE. In
studiu de fa s-a urmrit de asemenea si tehnica de determinarea

aminoacizilor prezeni n proteinele din lapte, metoda utilizat fiind una gazcromatografic.

METODA I
1.1.Analiza proteinelor din lapte prin cromatografie
n analiza proteinelor cea mai

utilizat tehnic cromatografic este

cromatografia n faz lichid de nalt performan (HPLC). n funcie de

mecanismul separrii cromatografie prin excluziune steric, schimb de ioni sau
cromatografie n faz invers (RP-HPLC).
Pentru o mai bun separare i caracterizare a proteinelor din lapte, la ora
actual pe plan mondial este utilizat tehnica HPLC bidimensional (2D-HPLC),
ce permite separarea proteinelor pe baza a dou principii diferite:
hidrofobicitatea i pH-ul izoelectric. n figura 1 este redat cromatograma
obinut la separarea proteinelor din lapte de vac utiliznd tehnica 2D-HPLC.

Figura 1: Cromatograma 2D-HPLC obinut la separarea proteinelor din lapte

de vac
3

1.2.Separarea proteinelor din lapte prin

cromatografie HPLC
Pentru realizarea unor separri eficiente, n timp scuri de analiz se
impune n ultimul timp tehnica numit cromatografie n faz lichid de nalt
performan (HPLC High performance pressure liquid chromatography).
Printre avantajele acestei metode amintim: cantitate redus de prob
necesar pentru analiz; substanele de analizat nu trebuie s fie volatile; timpi
scuri de analiz; condiii de lucru simple pentru pregtirea probelor; efectuarea
analizei i prelucrarea datelor; polaritatea fazei mobile i fazei staionare poate fi
variat, ceea ce conduce la posibilitatea unei separri eficiente a amestecurilor
de analizat; separrile se pot efectua de regul la temperatura obinuit.
Exist 2 tipuri de baz n separarea cromatografic HPLC: separarea
izocratic i cea n gradient. Pentru analizarea proteinelor din lapte se utilizeaz
o separare n gradient, separare care i modific faza mobil pe parcursul
analizei. Aceasta modificare presupune utilizarea a cel puin 2 solveni, aflai n
rezervoare diferite, a cror debit este reglat cu ajutorul a dou pompe. nainte de
intrarea pe coloan, exist o camer de mixare unde sunt amestecai solvenii,
n proporii bine definite.
Introducerea probelor pe coloane se realizeaz n volume de 20l cu
ajutorul unor microseringi, prin dispozitive speciale prevzute n capul coloanei.
Detectorii pot indica modificarea unei mrimi fizice sub forma unui semnal, a
crui nlime este proporional cu concentraia compusului rspunztor de
aceast modificare. Detectorii au abilitatea de a sesiza i semnala prezena
compuilor separai la ieirea din coloan. Exist diferite tipuri de detectori n
funcie de proprietatea caracteristic a compuilor separai: detectori UV-Vis, de
fluorescen, etc. Detectorii sunt cei care transmit apoi informai unui
4

nregistrator care nregistreaz cromatograma. n cazul analizei proteinelor se

utilizeaz detecia n UV.
Analiza proteinelor laptelui se realizeaz utiliznd cromatografia n faz
invers (RP-HPLC - reverse phase HPLC). Se utilizeaz o coloan de tip Vydac
C8. Este o faz staionar nepolar, derivai ai silicailor la care se ataeaz
grupri C8 (de exemplu C8H17). Faza mobil are un caracter polar, fiind un
amestec de ap cu acetonitril i n prezen de acid trifluoacetic (TFA).
Compuii polari sunt eluai mai nti iar compuii omologi sunt reinui cu att
mai puternic cu ct este mai mare lungimea catenei lor.
Pentru separare se utilizeaz un sistem n gradient n care solventul A
(solventul de fixare) este o soluie apoas de TFA 0,01% iar solventul B
(solventul de eluie) este acetonitril 90% (v/v) i TFA 0,01% n ap.
Separarea proteinelor din probele de lapte se efectuatueaz n gradient, in
urmatoarele conditii:
- 31% solvent B timp de 5 minute;
- crestere liniara de la 31% la 46% solvent B timp de 40 minute
- 100% solvent B timp de 5 minute
- 100% solvent A timp de 10 minute
- un debit de 1ml/minut.
Detecia se realizeaz la dou lungimi de und diferite: 220 nm (lungimea
de und specific absorbiei legturilor peptidice) i la 280 nm (lungimea de
und specific absorbiei nucleelor din aminoacizii aromatici).
nainte de injectare, probele (lapte degresat i lactoser) se dilueaz
ntr-o soluie de clarifiere preparat n tampon Bis-Tris 0,1 M la pH 8 i ce
conine uree (8 M), n citrat trisodic (1,3%) i ditiotrietol (DTT) 0,3%. Aceast
soluie are rolul de a destabiliza structura micelelor de cazein din lapte
(clarefiere) i de a disocia proteinele ce sunt astfel meninute ntr-o stare redus.
5

Pentru separare s-au injectat 20ml lapte degresat pentru a optimiza

separarea coloana a fost meninut la o temperatur de 40C.

Identificarea principalelor tipuri de proteine , se realizeaz pe probe de

lapte de capr. Astfel, separarea cromatografic pe probe de lapte integral, se
redizolva si sunt supuse apoi analizei cromatografice.
Profilul proteic n cazul laptelui de capr a fost asemntor cu cel obinut
pentru celelalte trei specii analizate. Se poate observa, comparnd cromatograma
1 cu cromatogramele 2 i 3, ordinea n care sunt separate proteinele din lapte.
Astfel, n prima parte a seprrii, ntre minutele 0 - 25 sunt separate cazeinele n
timp ce proteinele din lactoser sunt separate mult mai trziu, dup minutul 50.

1. lapte oaie

2. lapte vac

3. lapte bivoli

Figura 7: Cromatogramele obinute n separarea proteinelor din lapte intregral

la trei specii diferite (oaie, vac, bivoli)

1. lapte capr
integral

2. lactoser capr:

Figura 8: Cromatograma obinuta n separarea proteinelor din lapte intregral si

lactoser provenite de la o specie (capr)

METODA II
2.1. Analiza proteinelor din lapte prin electroforez

Electroforeza este o metod de separare a unor particule sau ansambluri

de particule ncrcate electric, sub aciunea unui cmp electric uniform. La baza
acestei metode st proprietatea particulelor ncrcate electric de a se deplasa sau
migra n cmp electric spre anod (+) sau spre catod (-). Electroforeza poate fi
utilizat att n scop analitic ct i preparativ .
8

n funcie de mediul n care are loc separarea electroforeza poate fi de

dou tipuri: n mediu liber i n mediu stabilizant n cazul electroforezei n
mediu liber separarea are loc prin migrarea liber a speciilor ionice ntr-o soluie
tampon de pH corespunztor. Electroforez n mediu stabilizant utilizeaz medii
suport care la rndul lor pot fi inerte (hrtia de filtru, acetatul de celuloz, etc)
sau active, care interacioneaz cu particulele ncrcate (gelul de agar, de amidon
sau de poliacrilamid). Gelurile, fiind medii poroase, acioneaz n acelai timp
i ca site moleculare ducnd la separarea particulelor ncrcate sub form de
benzi bine delimitate.
Tehnica utilizat pentru separarea proteinelor prezente n lapte este
electroforeza n mediu stabilizant, pe gel de poliacrilamid.
Electroforeza

medii

stabilizante

poate

fi

la

rndul

su

monodimensional (n sistem orizontal sau vertical) i bidimensional. n

general sistemul orizontal se aplic pentru separrile pe agaroz, hrtie i acetat
de celuloz, n timp ce sistemul vertical se aplic separrilor pe poliacrilamid i
gel de amidon.

a. Separarea electroforetic a proteinelor pe gel de poliacrilamid

Printre metodele electroforetice, electroforeza pe gel de poliacrilamid
(PAGE) ocup un loc deosebit de important. Aceast metod poate fi utilizat
pentru separarea proteinelor din diferite tipuri de membrane, a proteinelor
ribozomale, a histonelor, proteinelor virale i bacteriene, etc.
Gelul de poliacrilamid rezult prin copolimerizarea acrilamidei cu N,Nmetilen bisacrilamid (agent de reticulare), n prezena radicalilor liberi. Ca
ageni de iniiere i catalizatori ai polimerizrii se utilizeaz mai des persulfatul
de amoniu i tetrametilenetilendiamina ( TEMED). Gelul rezultat este o reea
9

tridimensional care constituie un mediu poros cu proprieti de sit

molecular. Concentraia gelului de poliacrilamid, i implicit mrimea porilor,
se stabilesc n funcie de natura probei (masa molecular a proteinelor) ce
urmeaz a fi analizat.
Pentru realizarea unei separri electroforetice n sistem vertical, pe gel
plat de poliacrilamid avem nevoie de un aparat de electroforez i o surs de
curent continuu sau redresor. Aparatul de electroforez conine cuva de
electroforez, confecionat din plexiglas i avnd dou rezervoare pentru soluii
tampon: superior i inferior i plcile de sticl ntre care are loc polimerizarea
acrilamidei i depunerea probelor.
n funcie de condiiile de lucru, electroforeza pe gel de poliacrilamid
poate fi: nedenaturant (PAGE) i electroforez denaturant (SDS-PAGE).
Metoda nedenaturant (PAGE) separ proteinele native n funcie de
raportul ntre sarcina electric i masa lor molecular. Proteinele i pstreaz
astfel integritatea .
n cazul metodei denaturante (SDS-PAGE) n gel se adaug un detergent
ionic (ncrcat negativ) SDS sodiu dodecil sulfat. Probele de analizat sunt la
rndul lor tratate, la cald, cu SDS i 2-mercaptoetanol. Detergentul determin
ruperea legturilor ntre diferite proteine i interaciunile lipide-proteine i se
leag

stoichiometric

la

moleculele

de

proteine.

Sub

aciunea

2-

mercaptoetanolului are loc ruperea legturilor disulfidice inter i intramoleculare

din structura proteinelor, separndu-se astfel subunitile oligoproteinelor.
Probele de proteine sunt depuse pe gel i se aplic un cmp electric.
Proteinele ncep s migreze prin gel n funcie de raportul sarcin electric/mas.
Peptidele cu mas molecular mare migreaz cu vitez mai mic iar cele cu
mas molecular mic migreaz cu vitez mai mare. Dup migrare, gelul este
scos din aparatul de electroforez i colorat. Astfel, se contureaz benzi a cror
10

mas molecular poate fi determinat prin comparaie cu martori autentici de

proteine cu mas molecular cunoscut. n cazul electroforezei nedenaturante,
benzile de proteine pot fi recuperate de pe gel i supuse unor investigaii
ulterioare (de exemplu secvenializare, spectrometrie de mas, teste funcionale
i imunologice).
Utiliznd tehnica de electroforez denaturant SDS-PAGE s-a alizeaz
coninutul n proteine a laptelui provenit de la dou specii - capr respectiv vac,
gelul obinut n urma migrrii fiind prezentat n figura de mai jos.
Pentru a identifica proteinele separate electroforetic se utilizeaz un
marker de proteine (coloana 1) ce conine un amestec format din lactoferina
(~80 kDa), serum albumin (~66 kDa), IgG (~55 kDa), -caseina (ntre 40 i 25
kDa), lactoglobulin (~18 kDa) i lactalbumin (~14 kDa).

Figura 10: Separarea electroforetic a proteinelor din laptele de vac (2) i

lapte de capr (3)
Benzile de proteine separate n proba de lapte de vac (coloana 2) pot
corespunde cazeinelor

i k (32 i 25 kDa), lactoglobulinei (~18 kDa) i

lactalbumina (~14 kDa). Un profil asementor s-a obinut i n cazul laptelui de

capr (coloana 3) cu observaia c n cazul cazeinelor se observ o band mai
intens, la aproximativ 25kDa (band ce ar putea s corespund cazeinei).
11

b. Separarea proteinelor prin electroforez bidimensional (2D-PAGE)

Electroforeza bidimensional este o metod intens utilizat n analiza
amestecurilor de proteine din probe biologice i a fost introdus pentru prima
dat de P.H. OFarrell n 1975.
Este o tehnic asemntoare cromatografiei HPLC bidimensionale,
separarea realizndu-se n dou etape distincte, avnd la baz dou proprieti
diferite (figura 3). Prima dimensiune permite separarea proteinelor n funcie de
Ph-ul izoelectric caracteristic fiecreia i se numete focusare izoelectric (IEF).
Cea de a doua dimensiune este de fapt o electroforez clasic (SDS-PAGE) ce
permite separarea proteinelor n funcie de masa lor molecular.

P
r
i
m
a

d
i

I
E
F

m
e

A
d
o
u
a
di
m
e
n
si
u
n
e

n
s
i

Figura 3: Separarea proteinelor

prin electroforez bidimensional
u
n
e

12

Iniial, probele trebuiesc prelucrate prin diverse tehnici ce au drept scop

solubilizarea diferitelor tipuri de proteine. Prelucrarea probelor se realizeaz n
prezen de uree, diveri detergeni i ageni reductori ce asigur att
solubilizarea ct i denaturarea proteinelor, faze strict necesare pentru a putea
realiza separarea IEF. Ureea are rolul de a solubiliza i denatura proteinele. Este
utilizat n concentraii de aproximativ 8M. Pentru a mbuntii solubilizarea
pot fi utilizate concentraii mai mare sau ureea poate fi nlocuit cu tioure.
Detergenii neionici, cum este Triton X100 sau CHAPS, n concentraii
cuprinse ntre 0,5% i 4% sunt utilizai pentru o complet solubilizare i pentru a
prevenii agregarea proteinelor prin interaciuni hidrofobe. Ca ageni reductori
se folosesc ditiotrietolul (DTT) i ditioeritrietolul (DTE), n concentraii de 20
pn la 100 Mm i au rolul de a scinda legturile disulfidice prezente la nivelul
proteinelor .
Indiferent de tipul de electroforez utilizat (mono sau bidimensional) o
etap foarte important este cea a vizualizrii proteinelor separate. Exist mai
multe moduri de realizare a acestei vizualizri, alegerea metodei optime innd
cont de cantitatea de proteine prezente n prob (sensibilitate) i de scopul
separrii (eventuala analiz ulterioar a proteinelor separate).
Dou metode sunt utilizate n mod frecvent n aceast vizualizare: metoda
cu azotat de argint i metoda de colorare cu albastru de Coomassie.
Metoda de colorare a proteinelor cu azotat de argint este o metod foarte
sensibil, ce permite evidenierea unui numr mare de proteine separate, 1000
pn la 2000 de spoturi diferite Metoda cu albastru de Coomassie este de
aproximativ 50 de ori mai puin sensibil dect metoda cu azotat de argint
(detecteaz o concentraie de 100 ng/spot separat) dar este de preferat a fi
utilizat cnd proteinele separate trebuiesc analizate prin densitometrie sau
spectrometrie de mas .
13

3.Analiza aminoacizilor componeni ai proteinelor

din lapte
Proteinele din lapte sunt considerate de o valoare biologic superioar
datorit coninutului n aminoacizi eseniali nu numai n cantiti suficiente, dar
i ntr-un raport optim pentru activitatea vital a organismului. Laptele i
produsele lactate reprezint sursele de bogate proteine i importante din punct de
vedere calitativ n dieta uman. Din punct de vedere tehnologic este foarte
important descrierea cantitii de proteine din aceste surse i de asemenea
caracterizarea acestor proteine din punct de vedere al coninutului n aminoacizi,
n special a aminoacizilor eseniali.
Coninutul i tipul de aminoacizi utilizai de ctre esutul mamar n
biosinteza proteinelor specifice laptelui pot fi influenate de diveri factori
printre care se numr: concentraia aminoacizilor n snge; mecanismele de
preluare a aminoacizilor de ctre celulele mamare precum i metabolismul
intracelular al acestor aminoacizi. Fiecare dintre aceste nivele de control sunt la
rndul lor influenate de diveri factori . De exemplu, nivelul aminoacizilor din
snge este dependent de nutriie i starea fiziologic a animalului. Preluarea i
metabolismul intracelular al aminoacizilor, la nivelul glandei mamare, este un
mecanism extrem de complex. Anumii aminoacizi eseniali (lizina, metionina,
fenilalanina, tirozina, triptofanul) sunt preluai ntr-un raport stoichiometric n
timp ce ali aminoacizi (de exemplu arginina) sunt preluai ntr-o cantitate mai
mare dect cea necesar biosintezei proteinelor laptelui. De asemenea, anumii
aminoacizi pot fi utilizai de glanda mamar att n scop de biosintez a
proteinelor ct i ca surs potenial de energie respectiv ca surse de atomi de
carbon i azot necesari sintezei aminoacizilor neeseniali.
14

Numeroase metode analitice de laborator pot fi utilizate pentru identificarea i

cuantificarea aminoacizilor componeni ai proteinelor cum ar fi: cromatografie
pe strat subire, cromatografia n faz lichid de nalt performan, ioncromatografie respectiv cromatografia n faz gazoas. n general, aceste
determinri se efectueaz pe soluii obinute prin hidroliza chimic a proteinelor,
n mediu puternic.
Metodele de analiz HPLC s-au dovedit utile n analiza coninutului de
aminoacizi a laptelui praf pentru copii. Aminoacizii au fost derivatizai prin
tratare cu 6-aminochinolin-N-hidroxisuccinimidil carbamate, produii obinui
fiind apoi separai prin cromatografie HPLC n faz invers i detecie cu
fluorescen. n aceste condiii nu s-a putut ns determina triptofanul, analiza
acestuia necesitnd o nou separare HPLC utiliznd detecia n domeniul UV .
Numeroase

metode

gaz-cromatografice

au

fost

utilizate

pentru

identificarea aminoacizilor din proteine. naintea analizei gaz-cromatografice,

aminoacizi din hidrolizatul de proteine trebuiesc transformai n derivai volatili,
aceast transformare necesitnd efectuarea unor reacii chimice la nivelul
gruprilor funcionale specifice - gruparea carboxil respectiv gruparea amino.
Dup derivatizare i separare cromatografic, aminoacizii separai trebuiesc
identificai. Acest lucru este posibil prin utilizarea standardelor de aminoacizi
[Schilling i colab., 1996].
Metodele gaz-cromatografice simple sau cuplate cu spectrometria de mas
sunt frecvent utilizate n laboratoare pentru a identifica prezena nedorit a unor
derivai de aminoacizi, n alimente respectiv lapte. Un astfel de derivat este
lisinoalanina (LAL), un produs nedorit ce se formeaz n timpul procesrii
laptelui i ce poate fi ntlnit n diverse produse lactate [Montilla i colab.,
2007].

15

De asemenea, analiza GC poate fi util n identificarea D-aminoacizilor,

izomeri optici prezeni n laptele de vac proaspt (D-alanina, D-aspartat, Dglutamat) dar abseni n laptele uman. S-a observat c n cazul D-alaninei
coninutul crete n timpul pstrrii laptelui la 4C, acest izomer optic fiind de
altfel utilizat ca un indice (marker) a contaminrii bacteriene a laptelui [Gandolfi
i colab., 1992].

3.1.Coninutul n aminoacizi al proteinelor laptelui

Analiza aminoacizilor componeni ai proteinelor laptelui s-a realizat pe
doua tipuri de lapte lapte de vaca i lapte de bivoli. Precizm faptul c aceste
analize au fost realizate n colaborare cu doamna fizician Monica CULEA, n
cadrul Facultii de Chimie Cluj-Napoca.
Pentru o analiz calitativ a cromatogramelor trebuie precizat faptul c
pentru un sistem cromatografic dat, fiecare substan se caracterizeaz printr-un
timp de retenie (tR). Injectarea prealabil, n aceleai condiii de analiz, a unui
amestec de standarde de aminoacizi (Sigma) a permis identificarea
componentelor separate prin compararea tR. In tabelul 10 sunt redati timpii de
retentie pentru fiecare standard de aminoacid.
Aminoacizi

Timp de retentie
(minute)

Alanina

12.44

Glicocol

13.06

Treonina

14.5

Serina

14.95

Valina

15.42
16

Leucina

17.47

15N-Izoleucina

17.57

Izoleucina

17.76

Prolina

21.11

Acid aspartic

27.03

Fenil-alanina

27.32

Acid glutamic

30.53

Lizina

30.62

Tirozina

34.93

Tabelul 10 : Timpii de retentie pentru fiecare aminoacid standard separat prin

GC

In figura 11 sunt prezentate cromatogramele obinute n cazul separrii

aminoacizilor din laptele de vac (dou extracii diferite), pe cromatograma fiind
prezentat, pentru fiecare aminoacid separat, timpul de retentie. Rezultatele
analizei cantitative sunt prezentate n tabelul 10, ele reprezentnd media a trei
determinri paralele.
n cazul laptelui de bivoli s-a observat un profil al aminoacizilor
apropiat cu cel al laptelui de vac, rezultatele analizei cantitative fiind prezentate
n tabelul 10. De asemenea, n figura 12 este redat una din cromatogramele
obinute n separarea gaz-cromatografic a aminoacizilor din lapte de bivoli.

17

RT: 6.97 - 27.63

NL:
6.23E7
TIC F: MS
lb1

15.61

100
90

12.51

Relative Abundance

80
70

24.68

8.39

60
50

21.39

40

21.27

8.90
9.83 10.70

30
20
10

12.68
7.57

13.64
14.16

11.60

0
100

24.92

18.05

17.58

19.66
18.73
20.84

25.12 27.58

23.10

NL:
3.17E7
TIC F: MS
s1a

15.54

90

12.46

80

24.63

70
60
50
8.36

40

21.38

10.08

20
10
0

21.26

10.48
10.70

30

7.05
8

12.66
11.40

10

24.87

12

24.29

14.13 14.82
14

15.69
16

18.04 18.75

18
Time (min)

20

25.80 27.58

21.71 23.67
22

24

26

Figura 11: Cromatogramele comparative de separare a aminoacizilor

din dou probe de lapte de vac

AMINOACIZI

Coninutul exprimat n g/100g

lapte de vac

lapte de bivoli

Alanina

7,58

14, 84

Glicocol

2,05

7, 34

Serina

3,84

3, 00

Valina

5,11

5, 99

Leucina

20,29

23, 68

Izoleucina

2,20

1, 83

Cisteina

6,81

18

Prolina

25,55

47, 86

Metionina

1,13

0,56

Acid aspartic

3,39

Fenilalanina

5,65

12, 52

Tirozina

5,32

0,56

Acid glutamic

19,88

51, 64

Lizina

9,59

23, 79

Arginina

7,62

Histidina

4,45

Orn

25, 99

Tabel 10: Coninutul n aminoacizi al laptelui de vac i bivoli

RT: 11.70 - 35.51

NL:
4.60E5
TIC F: MS
MirelaAdel
aLBiv

170
160
150
140
130
120

Relative Abundance

110
21.25

100
90
80

30.66

70
60

17.60

27.40

50
40

34.97

12.47

30.81

27.15

30

33.88
13.09

20
10

15.40

18.77

14.48
15.93

0
12

14

16

32.86

19.08
18

20

22.82 24.46 25.71

22

24
Time (min)

26

30.17
28

30

32

34

Figura 12: Cromatograma de separare a aminoacizilor din lapte de bivolita

19

Pentru o mai bun interpretare a rezultatelor obinute, n figura 13 este

reprezentat grafic modul n care variaz coninutul aminoacizilor la speciile
luate n lucru n aceast analiz - vac i bivoli. Se observ variaii mari n
profilul aminoacizilor la cele dou specii. Anumii aminoacizi, cum sunt
cisteina, acidul aspartic, arginina i histidina au fost evideniai doar n laptele de
vac, ei nefiind prezeni n laptele de bivoli analizat n timp ce ornitina a fost
prezent la bivoli dar nu a fost evideniat la vac.
Diferene sunt observate i n ceea ce privete cantitatea n care sunt
prezeni aminoacizii. Astfel n cazul alaninei, acidului glutamic, glicocolului i
prolinei, cantitile de aminoacizi prezeni n laptele de bivoli sunt de 2-3 ori
mai mari comparativ cu cele prezente n laptele de vac.

20

Figura 13: Analiza comparativ a profilului aminoacizilor n lapte de vac i

bivoli

CONCLUZII
In urma studiului lecturii de specialitate privind
proteinele din lapte, cele mai utilizate tehnici de analiza sunt
cele cromatografice respectiv cele spectrometrice.
Una din tehnicile de analiza a proteinelor din lapte este cea care
presupune separarea i identificarea proteinelor prezente n lapte realizate prin
cromatografie n faz invers RP-HPLC. Cromatogramele ce se pot obtine la
toate probele de lapte provenite de la specii diferite pot avea acelasi profil
proteic, ce pot diferii la nivelul proporiei relative dintre diversele cazeine, fapt
ce poate fi explicat de polimorfismul genetic.
O alta tehnica de identificare a proteinelor este cea utiliznd tehnica de
electroforez SDS-PAGE in care se poate analiza proteinele din laptele provenit
de la dou specii - capr respectiv vac. Aplicand aceast tehnic, n laptele de
vac

se pot evidentia doar cazeinele i K respectiv proteinele solubile

lactoglobulina i -lactalbumina. Un profil asementor se poate obtine i n cazul

21

laptelui de capr, daor c n cazul cazeinelor poate exista o band mai intens ce
corespunde -cazeinei.
Pentru determinarea aminoacizilor prezeni n proteinele din lapte se poate
utiliza o alt tehnic respectiv, tehnica cromatografic - gaz cromatografia
(GC). Analiza aminoacizilor componeni ai proteinelor laptelui se poate realiza
pe doua tipuri de lapte lapte de vaca i lapte de bivoli,asa putand fi observate
diferene de ordin calitativ i cantitativ. Anumii aminoacizi, cum sunt cisteina,
acidul aspartic, arginina i histidina se pot identifica doar n laptele de vac, ei
nefiind prezeni n laptele de bivoli, n timp ce ornitina poate fi prezent la
bivoli dar nu si in laptele de vac.

n cazul alaninei, acidului glutamic,

glicocolului i prolinei, cantitile de aminoacizi prezeni n laptele de bivoli

pot fi de 2-3 ori mai mari comparativ cu cele prezente n laptele de vac.

22