Cod procedur: P-BioChem 4 Versiune 1.

0 : Status document: final

ntocmit: Gabriela Bordeianu Data 18 Martie 2009 Verificat/aprobat: Bogdan GRIGORIU 2009 Numr total de pagini: 4

SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

A. Consideratii generale Spre deosebire de electroforeza clasica in care migrarea proteinelor depinde de incarcarea electrica a proteinelor la un anumit pH a mediului, masa moleculara, marimea proteinelor dar si intensitatea campului electric, SDS-PAGE foloseste dodecil sulfat de sodiu (SDS), un detergent anionic ce denatureaza proteinele si care confera o incarcatura electrica negativa complexului SDS-proteina. Astfel migrarea proteinelor se va realiza in functie de masa moleculara a acestora si mai putin dupa incarcarea lor electrica, astfel estimandu-se greutatea moleculara a proteinelor migrate sau a fragmentelor proteice Efect aditional in denaturarea proteinelor il are 2-mercaptoetanol ce desface legaturile S-S- din structurile tertiare ale proteinelor. Adaugarea de 2 mercaptoetanol realizaeaza o migrare in conditii reducatoare si nu este necesar a fi realizat sistematic. Agentul reducator se adauga atat in tamponul de migrare cat si in proba de proteina. B. Materiale necesare - Cuva de migrare (Biorad Mini protean II) - Placi de sticla pentru confectionarea casetelor - Cilindri gradati - Pahare Berzelius (diferite marimi) - Pipete automate calibrate - Generator de tensiune C. Solutiile de lucru - Solutie de acrilamida (atentie ! monomerul de acrilamida este neurotoxic, cu efecte cumulative) - Tamponul pentru prepararea gelului de separare: 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8. - Tamponul pentru prepararea gelului de concentrare: 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8. - 10% persulfat de amoniu: se prepara de preferinta proaspat (0.1 g persulfat de amoniu intr-un ml apa distilata). - N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED) - Tamponul in care se dilueaza probele:
2x Tris-HCl (pH 6.8) SDS 50 mM 4% 3x 75 mM 6% 4x 5x

100 mM 125 mM 8% 10% 0.01% 50% 25%

Albastru de bromfenol 0.004% 0.006% 0.008% Glicerol 2-Mercaptoetanol 20% 10% 30% 15% 40% 20%

2 Mercaptoetanol se adauga DOAR DACA se doreste migrarea in conditii reductoare; daca se doreste compararea migrarii in conditii reductoare si nereductoare atunci se recomanda ca intre cele doua linii de migrare sa se lase un loc liber pentru ca 2 Mercaptoetanolul sa nu treaca din unul in altul. Tamponul pentru electroforeza 10 X: (144g glicina, 30g baza Tris, 10g SDS dizolvat in 100ml apa distilata, iar pana la 1 litru se completeaza cu apa distilata). Colorant pentru proteine (vezi protocol colorare) Solutie de decolorare(vezi protocol colorare) Microseringa hamilton (sau o pipeta clasica de 10 microl cu conuri speciale f subtiri) pentru incarcarea probelor

D. Mod de lucru 1. Probele sunt diluate cu tampon 4X, astfel incat dilutia finala sa fie 1X. Apoi sunt denaturate minim 2 minute la 98 grade Celsius (in vederea inactivarii proteazelor). 2. Se curata suprafata placilor de sticla cu detergent , apoi se clatesc cu apa distilata din abundenta. Ulterior se spala in alcool etilic si se usuca. Placile astfel curatate se monteaza utilizand departatoarele furnizate astfel incat sa formeze o caseta, care va fi fixata in pozitie verticala in dispozitivul de turnat gelul. (penrtu instructiuni detaliate se paote acesa documentu BIORAD disponibil la adresa : http://www.biorad.com/cmc_upload/Literature/37363/4006158B.pdf) 3. Se prepara gelul de migrare cu o concentratie de acrilamida ce va tine cont de greutatea moleculara (kDa) a proteinelor ce vor suferi procesul de migrare, astfel:
% Acrilamida 5 10 15 Dimensiunea proteinelor ce trebuie separate (kDa) 25-200 15-70 12-45

Compozitia gelului
Gel de migrare 7.5% volum de gel ce trebuie preparat H2O (mL) 0.5 M Tris-HCl(pH 6.8) -0.4% SDS (mL) 10% 12% 10ml 3.5 2.5 4 50 5 5ml 1.25 1.25 2.5 30 3 15% 10ml 2.5 2.5 5 50 5

5 ml 10 ml 5ml 10ml 5ml 2.5 5 2.5 2.5 50 5 2 1.25 1.65 30 3 4 2.5 3.3 50 5 1.75 1.25 2 30 3

1.5 M Baza Tris(pH 8.8) -0.4% SDS (mL) 1.25 30% Acrilamida -0.8% Bis (mL) 10% persulfat de amoniu (L) TEMED (L) 1.25 30 3

Persulfatul de amoniu se adauga intotdeauna la sfarsit, Daca persulfatul de amoniu nu este proaspat se adauga o cantitate dubla N.B. 1 gel de 0,5 mm necesita in general 3 ml de solutie, unul de 0,75 mm = 5 ml de solutie, unul de 1 mm 6 ml de solutie iar unul de 1,5 mm 8,5 ml solutie; Gelurile de 0,5 (dar si cele de 0,75 mm uneori) sunt dificil de manipulat si se rup usor. 2

4. Utilizand o pipeta Pasteur sau o pipeta automata se toarna gelul de migrare in caseta printr-o margine a acesteia pana cand ajunge la cca 2 cm de marginea superioara a casetei. Pentru a ne asigura ca gelul va avea o suprafata neteda vom pipeta deasupra cu grija 0.5 ml isobutanol (sau eventual isopropanol). Verificarea gelului se face prin observarea polimerizarii solutiei ramase in recipientul in care aceasta s-a preparat. 5. Dupa ce gelul de migrare este polimerizat se prepara gelul de concentrare (2 ml, 4% acrilamida pentru un gel) astfel:
Gel de concentrare 4% volum H2O (mL) 0.5 M Tris-HCl(pH 6.8) -0.4% SDS (mL) 1.5 M Baza Tris(pH 8.8) -0.4% SDS (mL) 30% Acrilamida -0.8% Bis (mL) 10% persulfat de amoniu (L) TEMED (L) 5ml 3.1 1.25 0.65 30 5

6. Odata gelul de migrare intarit se varsa alcoolul de la suprafata, se spala de 3 ori cu apa distilata (3X0.5ml) si se pipeteaza gelul de concentrare pana cand nivelul ajunge la 0,5 cm de marginea superioara a casetei.(A se evita formarea bulelor de aer in interiorul gelurilor!!) 7. Se introduce pana la jumatatea gelului de concentrare un pieptene special pentru formarea godeurilor si se lasa cca 20 minute (mai curand se verifica polimerizarea solutiei care a ramas in flaconul in care s-a preparat). Pieptenele e scoate apoi cu grija iar godeurile ramase se spala cu tampon de electroforeza pentru indepartarea eventualei solutii de acrilamida nepolimerizata. 8. Se asambleaza caseta in cuva de electroforeza si se umple rezervorul cu tampon de electroforeza in asa fel sa faca posibila trecerea curentului electric intre catod si anod. (forma si capacitatea dispozitivelor de electroforeza variaza de la o firma la alta) Ne asiguram ca electrozii sunt aranjati astfel incat proteinele sa migreze spre anod. 9. Godeurile care sunt deja pline cu tampon pot fi incarcate cu probe cu ajutorul unei seringi Hamilton sau a unor varfuri speciale (de ex ref A569.1 Carl Roth) Datorita densitatii mari a solutiei de incarcare probele cad la fundul godeului. Volumele ce pot fi depuse per godeu sunt:
Numar godeuri 5 9 10 15 Latime godeu 12.7 mm 5.08 mm 5.08 mm 3.35 mm 0.5 mm 22 l 13 l 0.75 mm 70 l 33 l 33 l 20 l 1.0 mm 105 l 44 l 44 l 26 l 1.5 mm 160 l 66 l 66 l 40 l

10. Migrarea va avea loc la 120V (15-20mA), cca 4 ore pana cand colorantul albastru atinge marginea inferioara a gelului. 11. Se demonteaza caseta cu gel si se desprind cele doua placi. Gelul obtinut este fragil iar transbordarea lui dintr-un vas in altul se face adaugand apa deasupra ajuntand-ul astfel sa alunece. Gelul de concentrare se indeparteaza cu un cutit. Gelul astfel obtinut este pregatit fie pentru transferul pe membrana , fie pentru colorare.