Tehnica Western Blot Consideratii teoretice Aceasta tehnica (imunoblott sau Western Blott) este utilizata pentru detectarea

unei proteine care a fost imobilizata in prealabil pe o membrana. Proteinele din gelurile de poliacril amida interactioneaza greu cu anticorpii din solutie, de aceea este indicat sa se faca transferul pe o suprafata (membrana) care sa permita mai bine interactiunea proteina-anticorp. Membranele pentru blotting sunt din nitroceluloza, florura de poliviniliden (PVDF) sau Nylon incarcat pozitiv. Membranele leaga proteinele prin interactii hidrofobe (nitroceluloza) sau interactii hidrofobe si ionice (Nylon incarcat pozitiv). In multe experimente biochimice este necesara determinarea unei proteine dintrun amestec de proteine (de exemplu extractul din celule). O asemenea identificare este usurata daca experimentatorul are anticorpul (monoclonal sau policlonal al) proteinei de interes. In acesta tehnica se disting doua etape. In prima etapa proteinele sunt separate prin SDS-gel electroforeza, gel electroforeza in conditii native sau prin intermediul focusarii izoelectrice. In cea de-a doua etapa proteina imobilizata (antigenul sau mai precis portiunea de interactiune a acestuia cu anticorpul-epitopul) poate interactiona cu anticorpul, molecula care la randul sau poate fi decorata cu un sistem de detectie biochimic (enzimatic) sau radiochimic. Exista si posibilitatea de legare a peptidelor care au mai mult de 20 aminoacizi in compozitie. Membrane utilizate in Western Blotting Nitroceluloza este membrana cea mai des utilizata in tehnica Western Blott. Marimea porilor membranei este intre 0,05 m si 0,45 m. Cu cat porii sunt mai mici cu atat capacitatea de legare este mai mare. Proteinele absorbite pe nitroceluloza pot fi colorate reversibil astfel incat proteinele totale pot fi estimate inaintea detectiei. Exista insa si situatii cand Nylonul poate fi utilizat pentru transferul proteinelor daca se impune o capacitate mare de legare sau in situatia in care proteina (cu masa moleculara mare sau cu un continut mare de acizi) se leaga slab de membrana. Difluorura de poliviniliden (PVDF), asemeni Nylonului se distinge printr-o capacitate de legare si o stabilitate ridicata. Aceste membrane pot fi utilizate in secventarea directa a proteinelor. Parte experimentala A. Echipamente necesare -Aparat de electroblotting semiuscat -Sursa de tensiune -Hartie Whatmann -Membrana (Nitroceluloza sau Nylon) -Agitator orizontal B. Reactivi -Solutia tampon de transfer -Solutia de blocare (5% lapte praf sau 2% BSA in solutie tampon de transfer) -Anticorp primar -Anticorp secundar -5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat (BCIP) -clorura de p-nitro albastru de tetrazoliu (NBT)

-dimetil formamida (DMF) C. Protocol Gelul rezultat dupa SDS-electroforeza se aseaza pe o membrana. Intre cei doi electrozi si perechea gel-membrana se utilizeaza 2-3 straturi de hartie de filtru Wattman, cu dimensiune similara cu cea a gelului/membranei, care au fost in prealabil imersate in tamponul de transfer. Transferul proteinelor se face in prezenta unui camp electric. Proteinele incarcate negativ (datorita SDSului) se deplaseaza din gel spre membrana (de nitroceluloza sau fluorura de poliviniliden, PVDF), in directia anodului (polul pozitiv). Transferul in Western Blotting se face prin doua variante: 1. prin utilizarea unor camere de transfer verticale prevazute cu electrozi din platina fixate de o parte si de alta a sandwichului de transfer. Pentru aceasta metoda gelul si membrana sunt pozitionate intre 2 bucati de hartie si 2 bureti subtiri si suspendate in solutia tampon din camera de transfer. De obicei transferul se face peste noapte (cel putin 3-4 ore sunt necesare pentru transfer). O solutie tampon de glicina-Tris (pH 8,3) este utilizata pentru blotting. Acesta valoare a pHului nu trebuie sa cauzeze denaturarea proteinelor. Mai mult proteinele sunt partial incarcate si de aceea transferul este de lunga durata. Uneori este avantajos sa se utilizeze o solutie tampon de CAPS (pH 9,9 cu NaOH) care determina un trasfer mai rapid. In mod curent solutia tampon contine 20% metanol cu scopul cresterii capacitatii de transfer si a evitarii expandarii membranei. Gelurile acide (folosite pentru proteine bazice) sau cele rezultate dupa focusarea izoelectrica sunt transferate intr-un tampon care contine acid acetic 0,7 %. Pentru glicoproteine, polizaharide si lipozaharide o solutie de borat de sodiu (pH 9,2) este recomandata deoarece acidul boric se leaga de resturile de zahar si ca urmare in mediu bazic moleculele devin incarcate negativ. 2. Blottingul semi-uscat In cazul sistemelorcontinue transferul se efectueaza intre doua placi orizontale de grafit. Numai o cantitate limitata de solutie tampon (Tris-glicina SDS continand 20% metanol) este utilizata (cateva bucati de hartie sunt umectate in solutia de tampon). Sistemele discontinue sunt preferabile (folosesc 3 tipuri de solutie tampon) deoarece transferul este mai eficient si da nastere la benzi mai subtiri (rezolutie mai mare). Aceasta tehnica este simpla, mai ieftina si mai rapida (transferul se face in 1-2 h). Pentru detectia enzimelor solutia tampon nu trebuie sa contina metanol, deoarece acesta ar putea afecta activitatea enzimatica. Pentru transferul gelurilor denaturante (care contin un continut ridicat de uree) care succed focusarea izoelectrica acestea trebuie incubate intr-o solutie tampon (acid 6-amino hexanoic cu 20 % metanol si 0,01% SDS) cu scopul reincarcarii proteinelor. Transferul proteinelor din prima etapa poate fi verificat prin incubarea membranei cu un colorant revesibil (Ponceau S interactioneaza cu proteinele fixate pe nitroceluloza, metoda cu o sensibilitate pana la 50 ng/banda; SYPRO Ruby si Deep Purple, doi coloranti fluorescenti cu specificitate ridicata pentru proteine, sunt folositi pentru detectia proteinelor imobilizate pe nitroceluloza sau PVDF si au o sensibilitate in jur de 1-5 ng/banda, ultimul avand o sensibilitate mai ridicata). Transferul largeste posibilitatea de detectie in cazul fractiunilor separate prin electroforeza deoarece moleculele absorbite pe

suprafata membranei pot interactiona cu diferiti liganzi (antigeni, anticorpi, lectine sau acizi nucleici). Etapa de blocare consta in acoperirea situsurilor libere de pe membrana cu ajutorul unor macromolecule, substante care nu participa la reactia de recunoastere a antigenului de interes. In acest scop sunt folosite diverse solutii (2-10% albumina serica, 5% lapte praf degresat, sau 0,05 % Tween 20). Membrana de nitroceluloza este blocata cu tampon TBST (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,2% Tween 20, 1% lapte praf degresat pH = 7,5) timp de 1 h la temperatura camerei (cu usoara agitare). Imunodetectia Dupa blocarea membranei proteinele aflate pe suprafata membranei de nitroceluloza sunt disponibile pentru legarea primului anticorp. Se incubeaza membrana timp de 2h cu agitare usoara la temperatura camerei cu o solutie diluata a primului anticorp (in tampon TBST). Se spala membrana de 3 ori timp de 10 min cu acelasi tampon (care nu contine anticorp).
Proteine, ADN, ARN

Gel
transferul

membrana blocarea

Agent de blocare

Anticorpi, lectine

legarea liganzilor
Etapele Blottingului pornind de la gelurile rezolvate prin electroforeza

Determinarea propriu-zisa se face cu ajutorul celui de-al doilea anticorp, care are afinitate pentru primul anticorp. Primul anticorp provine din imunizarea iepurilor (soarece). Cel de-al doilea anticorp provine din capra si este compatibil cu primul produs de iepure. Se incubeaza timp de 1h, la temperatura camerei, membrana cu anticorpul al doilea (al carui antigen este anticorpul 1) preparat in TBST. Se spala de 3 ori membrana timp de 10 min cu TBST (fara lapte) la temperatura camerei. Cel de-al doilea anticorp este cuplat cu o enzima care catalizeaza o reactie de identificare. In mod curent aceasta enzima este o peroxidaza sau fosfataza alcalina. Dupa adaugarea ambelor substrate (apa oxigenata si diamino-benzidina in cazul peroxidazei, respectiv BCPI si NBT in cazul fosfatazei alcaline) enzima oxideaza substratul la un produs insolubil colorat, in asa fel incat precipita pe suprafata complexului proteinaanticorp permitand identificarea proteinei.

Pentru detectie se incubeaza membrana la temperatura camerei timp de 5 min, cu usoara agitare, in 25 ml de tampon de developare (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9,5). Se adauga substratele: 100 l BCIP (25 mg/ml dizolvata in 100% DMF); 100 l NBT (25 mg/ml dizolvata in DMF / H2O = 70 / 30). Se incubeaza membrana timp de 10-15 min in functie de cantitatea de antigen imobilizata pe membrana. Se spala membrana cu apa pentru a opri reactia de developare. Se usuca membrana si se pastreaza intre doua hartii de filtru la intuneric. In cazul in care pentru peroxidaza se folosesc drept substrate luminolul si acidul cumaric produsul rezultat se remarca printr-o luminiscenta deosebita avand o sensibilitate cu trei ordine de magnitudine mai ridicate decat metodele standard de detectie. O alternativa a reactiilor enzimatice o constituie marcarea cu izotopi radioactivi (tehnica RIA) a celui de-al doilea anticorp (125I-anti-iepure-anticorp IgG; IgG-imunoglubulina G), procedeu cu o sensibilitate mult mai mare comparativ cu metodele de detectie bazate pe reactii enzimatice.

Peroxidaza
Anticorp 2

Anticorp 1

Proteine

Nitroceluloza
Principiul tehnicii Western Blot: Proteinele fixate pe membrana de nitroceluloza sunt detectate cu anticorpul 1, acesta se leaga specific de anticorpul 2 (cuplat cu enzima peroxidaza). Complexul este identificat in urma unei reactii enzimatice

Metoda Western blot este larg raspandita in analizele biochimice si clinice. Aceasta metoda permite identificarea unor proteine dintr-un amestec de proteine, respectiv permite determinarea proteinelor ce complexeaza cu o anumita proteina. Bibliografie: 1. Swerdlow, P. et al. (1986): Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hzdrated filters, Anal. Biochem., 156, 147-153. 2. Ogata et al.(1983): Detection of toxoplasma membrane antigens transferred from SDS-PAGE to nitrocellulose with monoclonal antibody and avidin-biotin,

3.

4. 5. 6. 7.

peroxidase anti- peroxidase and immunoperoxidase methods, J. Immunol. Methods 65, 75-82. Blake, M. et al. (1984): A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on western blots, Anal. Biochem., 136, 175179. Boyer, R. (2000): Identification of serum glycoproteins by SDS-PAGE and Western blotting, Modern Experimental Biochemistry, 3th edition, pp.321-331. Farrell, S. and Farrell, L.(1995): A Fast and Inexpensive Western Blot Experiment for the Undergraduate Laboratory, J. Chem. Educ., 73, 740-742. Westermeier, R. (1997), Electrophoresis in Practice, 2nd edition, Wiley. Bollag, D. M. and Edelstein, S. J., Protein Methods, Willey-Liss, 181-210.