Endotoxine bacteriene conform FE 6

1. Generaliti
Exist dou mari categorii de toxine bacteriene:
- Exotoxinele sunt secretate n exterior de ctre germeni Gram pozitivi i difuzeaz n organism;
servesc la prepararea vaccinurilor sub form de anatoxine (toxine care i-au pierdut toxicitatea,
dar care i-au pstrat proprietile imunogene). Exemple: neurotoxinele botulinic (produs de
Clostridium botulinum), tetanic (tetanospasmina- produs de Clostridium tetani), toxinele
produse de Corynebacterium diphtheriae;
- Endotoxinele sunt produse n interiorul unor bacterii Gram negative i sunt eliberate n cursul
distrugerii acestora. Sunt practic componente structurale ale peretelui celular al bacteriilor din
care provin (ex.: Escherichia coli, Klebsiella, Shigella, Salmonella) i sunt din punct de vedere
chimic lipopolizaharide i lipooligozaharide.
Odat eliberate n organism, aceste endotoxine vin n contact cu celulele sistemului imunitar,
provocnd eliberarea IL-1 i TNF-, care vor genera rspunsul inflamator. Ca urmare a activrii
limfocitelor B i a diferenierii lor la plasmocite, se vor forma anticorpi anti-toxin. ns, n cazul
n care cantitatea de endotoxine eliberat depaete capacitatea de aprare a organismului, se
produce ocul endotoxic, caracterizat prin hipotensiune, tahicardie, acidoz metabolic,
coagulare intravascular diseminat, cu evoluie grav.
Este foarte important, aadar, testarea prezenei toxinelor n preparatele farmaceutice cu
administrare parenteral (ex.: injectabile, perfuzabile) sau n preparate cu administrare local, dar
care pot fi absorbite n circulaia sistemic (ex.: colire, unguente oftalmice), dar nu numai,
deoarece endotoxinele bacteriene nu sunt distruse de enzimele digestive.

2. Specificaiile FE6
FE6 dedic un subcapitol entoxinelor bacteriene, i anume: 2.6.14 Bacterial endotoxins (pg.
182-189).
Testul pentru endotoxine bacteriene este utilizat n vederea detectrii sau cuantificrii
endotoxinelor provenite de la bacterii gram-negative, utiliznd lizat amoebocitic din Limulus
polyphemus sau Tachypleus tridentatus (specii de crabi-potcoav sau crevei).
FE6 specific 6 metode de lucru:
Capitolul descrie urmtoarele ase metode:
Metoda A. Metoda gel-cheag (Gel clot method): test limit
Metoda B. Metoda gel-cheag: test semi-cantitativ
Metoda C. Metoda turbidimetric cinetic (Turbidimetric kinetic method)
Metoda D. Metoda cromogen cinetic (Chromogenic kinetic method)
Metoda E. Metoda punctului final Cromogen (Chromogenic end-point method)
Metoda F. Metoda punctului final Turbidimetric (Turbidimetric end-point method)
Pentru a efectua testul se poate folosi oricare din cele ase metode. n cazul n care exist ndoieli
sau dezacorduri, decizia final se va lua n baza metodei A, cu excepia situaiilor n care n
monografii se indic o alt metod.
Reactivi i aparatur
Toat sticlria i vasele termorezistente utilizate pentru acest test trebuie depirogenizate ntr-un
sterilizator cu aer cald uscat, folosind un proces validat, minim, 30 minute la 250C. n cazul n
care se utilizeaz vase din plastic, cum ar fi plcile pentru microtitrare, vrfurile de pipete,
acestea nu trebuie s conin endotoxine detectabile i alte materiale ce pot interfera cu testul
efectuat.

Prepararea soluiei stoc standard de endotoxin

Soluia stoc standard de endotoxin este preparat dintr-un standard de referin care a fost
verificat n conformitate cu Standardul Internaional, de exemplu standardul BRP (biological
reference preparations) pentru endotoxine.
Cantitatea de endotoxine prezent n prob este exprimat n Uniti internaionale (UI).
Echivalena n Uniti Internaionale a Standardului Internaional este stabilit de Organizaia
Mondial a Sntii.

NOT: O Unitate Internaional (UI) de endotoxin este egal cu o Unitate de Endotoxin

(U.E.).

Prepararea soluiilor standard de endotoxin

Dup agitarea energic a soluiei stoc standard de endotoxin, se prepar diluiile seriale
corespunztoare acestei soluii, folosind ap de calitate corespunzatoare testului pentru
endotoxine bacteriene (ap pentru TEB).
Soluiile trebuie folosite n cel mai scurt timp posibil, pentru a evita pierderea activitii lor prin
adsorbie.

Prepararea soluiilor-test
FE6 recomand prepararea soluiilor-test prin dizolvarea sau diluarea substanelor active sau a
produselor medicinale, folosind ap pentru TEB. Unele substane sau compoziii pot fi mai bine
dizolvate sau diluate n alte soluii apoase. Dac este necesar, se va ajusta pH-ul soluiei-test (sau
diluiei acesteia) astfel nct pH-ul amestecului de lizat i de soluie-test s fie situat n intervalul
de pH specificat de productorul lizatului.
Valorile pH-ului sunt de obicei cuprinse ntre 6.0 i 8.0. pH-ul poate fi ajustat prin folosirea unui
acid, a unei baze sau a a unui tampon potrivit, dup cum este recomandat de productorul
lizatului. Acizii i bazele pot fi preparate din substane concentrate sau solide i ap pentru TEB
n recipiente fr endotoxine detectabile. Amestecurile tampon trebuie s fie lipsite de
endotoxine detectabile i alte substane care pot da interferene.
Determinarea Diluiei maxime valide
Diluia maxim admis (DMA) este diluia maxim admis a unei probe, la care poate fi
determinat limita de endotoxin. Determinai DMA folosind urmtoarea expresie:
DMA =

limita de endotoxin x concentraia soluieitest

, unde:

Limita de endotoxin= limita de endotoxin pentru substanele active administrate parenteral,

definit n baza dozei; este egal cu

K
M

, unde:

K = valoarea maxim admis de endotoxin per kilogram corp pentru o perioad de o or,
M = doza maxim recomandat a produsului testat per kilogram corp pentru o perioad de o or.

n monografii limita de endotoxin pentru substanele active administrate parenteral este

exprimat n UI/ml, UI/mg, UI/Unitate de activitate biologic, etc.

Concentraia soluiei-test- se exprima:

- n mg/ml dac limita de endotoxin este exprimat n uniti de mas (UI/mg).
- n Uniti/ml dac limita de endotoxin este exprimat n uniti de activitate biologic
(UI/Unitate),
- n ml/ml dac limita de endotoxin este exprimat n uniti de volum (UI/ml).
= sensibilitatea lizatului n tehnica gel-cheag (UI/ml) sau cel mai jos punct, folosit n curbele
standard ale tehnicilor turbidimetric sau cromogen.

TEHNICA GEL- CHEAG (METODELE A I B)

Tehnica gel-cheag permite detectarea sau cuantificarea endotoxinelor i este bazat pe coagularea
lizatului n prezena endotoxinelor. Concentraia de endotoxine, necesar pentru a produce
coagularea lizatului n condiii standard, se numete sensibilitatea lizatului i se noteaz cu
lambda (). Pentru a asigura att precizia, ct i validarea testului, FE6 recomand testarea
sensibilitii lizatului, nscrise pe specificaiile produsului, i testarea prezenei factorilor de
interferen dup cum este descris mai jos.
Teste preliminare
Confirmarea sensibilitii lizatului
nainte de a folosi soluia de lizat pentru testare, trebuie verificat sensibilitatea , exprimat n
UI/ml, n 4 replicate. Confirmarea sensibilitii lizatului se efectuaz dup deschiderea unui lot
nou de lizat sau la oricare modificare a condiiilor experimentale, ce pot influenta rezultatele
testului.
Se prepar soluiile standard de cel puin patru concentraii, corespunzatoare 2 , , 0.5 i 0.25
, prin diluarea soluiei stoc standard de endotoxin cu ap pentru TEB.
Se amestec n proporie de 1:1 (v/v) soluie de lizat cu fiecare soluie standard (spre exemplu, se
pot amesteca alicoturi de cte 0,1 mL). Se va incuba apoi amestecul de reacie o perioad
constant conform recomandrilor productorului lizatului (de obicei la 37 1C timp de 60 2
min).

Se testeaz integritatea gelului format astfel: se ia pe rnd fiecare vas de reacie (pot fi chiar
tuburi Eppendorf) direct din incubator i se ntoarce cu o micare lent la aproximativ 180. Dac
s-a format un gel ferm, care rmne n loc la ntoarcerea tubului, se consider rezultatul pozitiv.
Dac nu se formeaz un gel intact, rezultatul este negativ.
Testul nu este considerat valabil dect dac cea mai joas concentraie a soluiilor standard d un
rezultat negativ n toate testele replicate.
Punctul final al testului este reprezentat de ultimul rezultat pozitiv n seriile cu concentraii
descresctoare de endotoxin.
Se calculeaz apoi valoarea medie a logaritmilor punctului final de concentraii, apoi
antilogaritmul valorii medii, folosind urmtoarea expresie:
Media geometric a concentraiei punctului final =

antilog e
f

, unde:

e = suma logaritmilor concentraiilor corespunztoare punctului final din diluiile folosite,

f = numrul de replicate.
Media geometric a concentraiei punctului final reprezint sensibilitatea msurat a soluiei de
lizat (UI/ml). Dac aceasta nu este mai mic de 0.5 i nu mai mare de 2, sensibilitatea nscris
n specificaiile produsului se consider confirmat i soluia este folosit n testele efectuate cu
acest lizat.

Testul la factori de interferen

Se prepar soluiile A, B, C i D conform tabelului de mai jos i se folosesc soluii-test la o
diluie mai mic dect DMA, care nu conin endotoxine detectabile.
Media geometric a concentraiilor punctului final al soluiilor B i C este determinat folosind
expresia descris mai sus, n cadrul subpunctulului Confirmarea sensibilitii lizatului.
Testul la factori de interferen este repetat la oricare modificare a condiiilor experimentale, care
poate influena rezultatul testului.
Testul nu este valabil dect dac toate replicatele soluiilor A i D dau rezultat negativ, iar soluia
C trebuie s confirme valoarea nscris pe eticheta produsului n privina sensibilitii lizatului.
Se va considera c soluia-test nu conine factori de interferen n condiiile experimentale
folosite dac rezultatele obinute pentru soluia B sunt cuprinse intre 0.5 i 2 . n caz contrar,
soluia interfereaz cu testul.
Media geometric a concentraiilor punctului final al soluiilor B i C este determinat folosind
expresia descris mai sus, n cadrul subpunctulului Confirmarea sensibilitii lizatului.

Testul la factori de interferen este repetat la oricare modificare a condiiilor experimentale, care
poate influena rezultatul testului.
Testul nu este valabil dect dac toate replicatele soluiilor A i D dau rezultat negativ, iar soluia
C trebuie s confirme valoarea nscris pe eticheta produsului n privina sensibilitii lizatului.
Se va considera c soluia-test nu conine factori de interferen n condiiile experimentale
folosite dac rezultatele obinute pentru soluia B sunt cuprinse ntre 0.5 i 2 . n caz contrar,
soluia interfereaz cu testul.
Soluie

Concentra
ia de
endotoxin
/
Soluia la
care se
adaug
endotoxina
0 / Soluietest
diluat
2

/
Soluietest
diluat

Solvent

Factorul de Concentra
diluie
ia iniial
de
endotoxin

2
1
0.5
0.25
2
1
0.5
0.25

4
4
4
4
2
2
2
2

2 / Ap
pentru TEB

Ap
pentru
TEB

1
2
4
8
1
2
4
8

0 / Ap
pentru TEB

Soluietest

Numrul
de
replicate

Soluia A= soluie a preparatului examinat, fr endotoxine detectabile.

Soluia B= soluie-test pentru interferene.
Soluia C= control pentru sensibilitatea lizatului.
Soluia D= control negativ (Ap pentru TEB).
n cazul n care proba analizat interfereaz cu testul la o diluie mai mic de DMA, trebuie
repetat testul la factori de interferen, folosind o diluie mai mare, care nu depete DMA.

Folosirea unui lizat cu o sensibilitate superioar permite o diluie mai mare a probei analizate i
aceasta poate contribui la eliminarea interferenei.
Interferena poate fi eliminat prin tratarea adecvat a soluiei, cum ar fi filtrarea, neutralizarea,
dializarea sau tratament la cald. Pentru a stabili dac tratamentul selectat elimin efectiv
interferena fr eliminarea eventualelor endotoxine, repetai testul la factori de interferen
folosind proba analizat, la care s-a adugat endotoxin standard i care apoi a fost supus
tratamentului selectat.

TESTUL LIMIT (METODA A)

Tehnica de lucru
Se prepara soluiile A, B, C i D dup cum este artat n tabelul de mai jos, i efectuai testul cu
aceste soluii, urmnd procedura descris n cadrul subpunctulului Confirmarea sensibilitii
lizatului.

Soluie

Concentraia de
endotoxin/ Soluia
la care se adaug
endotoxina

Numrul de
replicate

A
B
C
D

0/ soluie-test diluat
2/ soluie-test diluat
2/Ap pentru TEB
0/Ap pentru TEB

2
2
2
2

Se prepara soluiile A i B (controale pozitive ale produsului) folosind o diluie de concentratie

mai mica sau cel mult egala cu DMA i se analizeaza conform procedurii descrise n cadrul
subpunctului Testul la factori de interferen. Soluiile B i C (controale pozitive) conin
standardul de endotoxin la o concentraie corespunzatoare dublului valorii sensibilitii
lizatului. Soluia D (control negativ) contine ap pentru TEB.
Interpretarea rezultatelor
Testul este concludent doar n cazul n care ambele replicate ale celor dou soluii de control
pozitiv B i C dau rezultat pozitiv, iar soluia D da rezultat negativ.
Proba analizata ndeplinete condiiile testului atunci cnd pentru ambele replicate ale soluiei A
rezultatul este negativ.
Atunci cand rezultatul pentru ambele replicate ale soluiei A este pozitiv:

- daca proba analizata este diluat la DMA, atunci aceasta nu satisface condiiile testului,
- daca proba analizata este diluat la o diluie mai mic dect DMA, testul se va repeta la o alta
diluie care sa nu depaseasca DMA.
Dac pentru un replicat al soluiei A rezultatul este pozitiv, iar pentru altele rezultatul este
negativ, se va repeta testul. Compoziia examinat ndeplinete condiiile testului atunci cnd la
repetarea testului pentru ambele replicate ale soluiei A rezultatul este negativ

TESTUL SEMI-CANTITATIV (METODA B)

Tehnica de lucru
Testul cuantific endotoxinele bacteriene n soluia-test prin titrare pn la un punct final. Se
prepara soluiile A. B, C i D dup cum este artat n tabelul de mai jos i se analizeaza aceste
soluii conform procedurii descrise n cadrul subpunctului Confirmarea sensibilitii lizatului.
Calculul i interpretarea rezultatelor
Testul este valabil doar atunci cnd sunt ndeplinite urmtoarele trei condiii:
(a) ambele replicate ale soluiei D (control negativ) sunt negative,
(b) ambele replicate ale soluiei B (control pozitiv) sunt pozitive,
(c) media geometric a concentraiei punctului final al soluiei C se ncadreaz n intervalul 0.5
- 2.

Solutie

B
C

Concentrai
a de
endotoxin/
Soluia la
care se
adaug
endotoxina
0 /
test

Solutie-

2 / Soluietest
2 / Ap

Solven
t

Factorul
de
diluie

Concentr
aia
iniial
de
endotoxi
n

Numrul
de
replicate

Ap
pentru
TEB

1
2
4
8

2
2
2
2

Ap

1
2

2
1

2
2

pentru TEB
0
/
Ap
pentru TEB

pentru
TEB
-

4
8

0.5
0.25

2
2

Soluia A = soluie-test la o diluie care nu depete DMA, cu care a fost efectuat testul la factori
de interferen. Diluia consecutiv a soluiei-test nu trebuie s depeasc DMA. Folosii ap
pentru TEB pentru a obine diluii de 1,1/2,1/4 i 1/8, corespunztoare diluiei cu care a fost
efectuat testul la factori de interferen. La nevoie pot fi folosite alte diluii.
Soluia B = soluie A, coninnd endotoxin standard la o concentraie de 2 (control pozitiv),
Soluia C = dou solutii coninnd endotoxin standard la concentraii de 2, , 0.5 i 0.25 n
apa pentru TEB.
Soluia D = ap pentru TEB (control negativ).
Pentru a determina concentraia de endotoxin n soluia A, se calculeaz concentraia
corespunzatoare punctului final pentru fiecare replicat, respectiv fiecare diluie prin nmulirea
factorului de diluie aferent punctului final cu .
Concentraia de endotoxin n soluia-test este media geometric a concentraiei punctului final a
replicatelor (vezi subpunctul Confirmarea sensibilitii lizatului). Dac testul este efectuat cu o
soluie-test diluat, se calculeaz concentraia de endotoxin n soluia original prin nmulirea
rezultatului cu factorul de diluie.
Dac niciuna din diluiile soluiei-test nu este pozitiv ntr-un test valid, se consider concentraia
de endotoxin mai mic de (sau, dac a fost testat o prob diluat, ca fiind mai mic de x cel
mai mic factor de diluie al probei). Dac toate diluiile sunt pozitive, concentraia de endotoxin
este considerat a fi egal sau mai mare dect cel mai mare factor de diluie nmulit cu (ex. n
tabelul de mai sus, factorul de diluie iniial x 8 x ).
Prepararea corespunde cerinelor testului dac concentraia de endotoxin este mai mic de cea
specificat n monografia individual.
TEHNICILE FOTOMETRICE (METODELE C, D, E I F)
TEHNICA TURBIDIMETRIC (METODELE C i F)

Aceast tehnic reprezint un test fotometric de msurare a creterii intensit ii opalescenei. n

funcie de principiile metodelor ce stau la baza testelor efectuate, tehnica turbidimetric poate
presupune un test al punctului final turbidimetric sau un test turbidimetric cinetic. Testul
punctului final turbidimetric (Metoda F) este bazat pe relaia de dependen cantitativ dintre
concentraia de endotoxin i opalescena (masurat ca absorban sau transmitan) amestecului
de reacie la fritul perioadei de incubare.
Testul turbidimetric cinetic (Metoda C) este o metod de msurare fie a timpului necesar pentru
ca amestecul de reacie s ating o absorban predeterminat, fie a vitezei de apariie a
opalescenei. Testul este efectuat la temperatura de incubare recomandat de productorul
lizatului (de obicei 37 1C).
TEHNICA CROMOGEN (METODELE D I E)
Aceast tehnic este folosit pentru a msura cantitatea de cromofor eliberat dintr-un peptid
cromogenic n timpul reaciei endotoxinelor cu lizatul. n funcie de principiile aplicate n test,
aceast tehnic este clasificat ca fiind un test al punctului final cromogen sau test cromogen
cinetic. Testul punctului final cromogen (Metoda E) este bazat pe dependena cantitativ dintre
concentraia de endotoxin i cantitatea de cromofor, eliberat la fritul perioadei de incubare.
Testul cromogen cinetic (Metoda D) msoar fie timpul necesar pentru ca amestecul de reacie s
ating o absorban predeterminat, fie viteza de apariie a culorii. Testul este efectuat la
temperatura de incubare recomandat de productorul lizatului (de obicei 37 1C).
Teste preliminare
n cazul testelor turbidimetric i cromogen, se efectueaz teste preliminare pentru asigurarea
realizrii criteriilor pentru curba standard i a lipsei interferen elor dintre soluia-test i proba
analizat.
Validarea metodei de testare este necesar la oricare modificare a condiiilor experimentale ce
poate influena rezultatul testului.
Asigurarea criteriilor curbei standard
FE6 recomand prepararea a cel puin trei concentraii de endotoxine, folosind soluia standard
de endotoxin, pentru realizarea curbei standard. Se efectueaz testul, folosindu-se cel puin trei
replicate din fiecare soluie standard de endotoxin, dup cum este recomandat de productorul
lizatului (proporii volumetrice, timp de incubare, condiii de temperatur, pH etc.).
Dac n metodele cinetice intervalul dorit este mai mare de 2 log, este necesar includerea unor
concentraii standard suplimentare pentru ca fiecare unitate logaritmic din intervalul de valori
corespunztor s aib corespondent n valorile ncadrate n curba standard.
Valoarea absolut a coeficientului de corelaie | r | trebuie s fie mai mare sau egal cu 0.980,
pentru intervalul de concentraii de endotoxine, indicat de productorul lizatului.

Testul la factori de interferen

Se va selecta o concentraie de endotoxin din mijlocul curbei standard (sau din apropierea
valorii corespunztoare). Se prepar soluiile A, B, C i D dup cum este artat n tabelul de mai
jos. Testul trebuie s conin cel puin dou replicate ale acestor soluii dup procedeul
recomandat de productorul lizatului (volumul soluiei-test i soluiei de lizat, raportul volumelor
de soluie-test i soluie de lizat, timpul de incubare, etc.).

Soluia

Concentraia de
endotoxin

Soluia la care
se adaug
endotoxina

Soluia-test

Concentraia corespunztoare
mijlocului curbei standard
Cel puin 3 concentraii
(dintre care cea mai mic
este de dorit s fie egal
cu )
0

Soluia-test

Numrul de
replicate
Nu mai puin de
2
Nu mai puin de
2

Ap pentru
TEB

Nu mai puin de
2 (pentru fiecare
concentraie)

Ap pentru
TEB

Nu mai puin de
2

Soluia A = soluie-test din proba analizat, ce poate fi diluat (fr a depi DMA).
Soluia B = soluie ce conine proba analizat, la aceeai diluie ca soluia A, creia i se adaug o
concentraie de endotoxin echivalent valorii corespunztoare mijlocului curbei standard.
Soluia C = soluie standard de endotoxin n concentraii folosite la validarea metodei, dup
cum este descris n cadrul subpunctului Asigurarea criteriilor curbei standard (control pozitiv).
Soluia D = ap pentru TEB (control negativ).
Se calculeaz apoi rata medie de recuperare a endotoxinei adugate, prin scderea concentraiei
medii de endotoxin din soluia-test (dac exist) din cea a soluiei ce conine endotoxin
adugat.
Soluia-test este considerat a nu conine factori de interferen dac, n condiiile testului,
concentraia msurat a endotoxinei adugate (valoarea rezultat n urma calculului de mai sus)
este de 50-200% din concentraia cunoscut de endotoxin adugat, dup extragerea
concentraiei de endotoxine detectate n soluia-test. Dac rata de recuperare a endotoxinei este n
afara intervalului specificat mai sus, factorii de interferen trebuie nlturai dup cum este
descris n cadrul subpunctului Testul la factori de interferen detaliat pentru TEHNICA GELCHEAG . Eficiena tratamentului este verificat prin repetarea testului la factori de interferen.

TESTAREA
Procedura
Se va urma procedura descris n cadrul subpunctului Testul la factori de interferen detaliat
pentru TEHNICA GEL-CHEAG.
Calculul
Se calculeaz concentraia de endotoxin a fiecrui replicat al soluiei A, folosind curba standard
generat de rezultatele obinute pentru soluia C (control pozitiv).
Testul este valid doar dac sunt ndeplinite urmtoarele trei condiii:
(a) rezultatul obinut cu soluia D (control negativ) nu depete limita valorii de referin,
specificat n descrierea lizatului folosit.
(b) rezultatele obinute pentru soluia C corespund cerinelor de validare, definite n cadrul
subpunctului Asigurarea criteriilor curbei standard.
(c) rata de recuperare a endotoxinei, calculat ca diferena dintre concentraia de endotoxin n
soluia B i concentraia de endotoxin n soluia A, se ncadreaz n intervalul precizat mai sus.
Interpretarea rezultatelor
Proba analizat satisface condiiile testului n cazul n care concentraia medie de endotoxin a
replicatelor soluiei A, dup corectarea diluiei i concentraiei, este mai mic dect limita
specificat n monografie pentru acest produs.

REACTIVI
Soluia de lizat

Se dizolv prin amestecare uoar lizatul de amibocite n ap pentru TEB sau ntr-un buffer, dup
cum este recomandat de productorul lizatului. Se pstreaza lizatul reconstituit, la rece sau la
congelator, dup cum este indicat de productor.
Lizat de amibocite
Lizatul de amibocite este un produs liofilizat, obinut din lizat de amibocite din crevete (Limulus
polyphemus sau Tachypleus trideniatus). n afar de endotoxine, lizatul de amibocite
reacioneaz cu unii -glucani. Sunt disponibile i preparate de lizat de amibocite, care nu intr
n reacie cu glucanii; ele se prepar prin nlturarea din lizatul de amibocit a factorului G, care
d reacie cu glucanii, sau prin inhibarea sistemului de reacie a factorului G al lizatului de
amibocit. Aceste compoziii pot fi folosite la testarea endotoxinelor n prezena glucanilor.

Ap pentru TEB (ap pentru testele pentru endotoxine bacteriene).

Apa pentru TEB este ap pentru preparate injectabile R sau ap obinut prin alte metode, care
nu reacioneaz cu lizatul folosit ca limit de detecie a reactivilor.
TESTAREA ENDOTOXINELOR BACTERIENE
Endotoxinele bacteriilor gram-negative reprezint cauza cea mai frecvent a reaciilor toxice ce
rezult din contaminarea produselor farmaceutice cu pirogeni; activitatea lor pirogenic este mult
mai nalt dect cea a majoritii altor substane pirogene. Aceste endotoxine sunt din punct de
vedere structural, lipopolizaharide. Dei exist un numr mic de pirogeni de alt structur, n
general este justificat concluzia c absena endotoxinelor bacteriene ntr-un produs implic
absena componentelor pirogene, i c prezena substanelor pirogene provenite din alte surse
poate fi neglijat. Prezena endotoxinelor ntr-un produs poate fi mascat de factorii care
interfereaz cu reacia dintre endotoxine i lizatul de amibocite.
De aceea, dac analistul dorete s nlocuiasc testul pe iepuri pentru substan e pirogene,
recomandat de farmacopee, printr-un test pentru endotoxine bacteriene, el trebuie s demonstreze
c este posibil efectuarea unor teste valide pentru produsul respectiv; acest lucru poate
presupune o procedur de nlturare a factorilor de interferen.
Dup cum este indicat n testul pentru endotoxinele bacteriene, nainte de validarea testelor,
analistul trebuie s dispun de informaii cu privire la urmtoarele dou aspecte:
1) Trebuie s se fac teste preliminare care s confirme o calitate adecvat a reactivilor care
urmeaz s fie folosii; trebuie, aadar, confirmat absena endotoxinelor n apa pentru TEB i n
ali reactivi, iar sensibilitatea lizatului de amibocite trebuie s corespund sensibilitii indicate
de productor.

2) Deoarece produsul care urmeaz a fi examinat poate interfera cu testul, sensibilitatea lizatului
de amibocit este determinat n prezena i n absena produsului supus examinrii. Nu trebuie s
fie o diferen semnificativ ntre cele dou valori de sensibilitate.
Testul la endotoxinele bacteriene indic metodele de nlturare a factorilor de interferen; n caz
de interferen, dup aplicarea unei asemenea metode se va repeta testul pentru a verifica dac
interferena a fost intr-adevar neutralizat sau nlturat.
Substituia testului la pirogeni pe iepuri, indicat de farmacopee, printr-un test cu lizat de
amibocite presupune folosirea unei metode alternative de analiz i prin urmare necesit
validare.
Metoda standard pentru endotoxine bacteriene este indicat n monografia fiecrui produs n
parte; dac nu exist nicio referire la acest aspect, se va folosi metoda A. Dac urmeaz a fi
folosite alte metode dect cea de referin, analistul trebuie s demonstreze c metoda este
adecvat produsului analizat i c rezultatul este comparabil cu cel obinut prin metoda de
referin.

Metoda
Adugarea endotoxinelor la lizatul de amibocite poate produce opalescen, precipitare sau
gelaie (nchegare); doar metoda de gelaie a fost folosit n Farmacopee drept criteriu de
evaluare n primul tip de test pentru endotoxine bacteriene. Avantajul era datorat simplit ii
metodei, cu privire la uurina argumentrii rezultatelor (pozitive sau negative) prin examinarea
(cu ochiul liber) a absenei sau prezenei cheagului. Metodele cantitative, descrise ca metodele C,
D, E i F au fost elaborate mai trziu: ele necesit aparatur mai complex, dar sunt mai uor de
adaptat pentru testarea pe scar larg a unui numr mare de probe ale aceluiai produs.
Endotoxinele pot fi adsorbite pe suprafaa vaselor sau pipetelor, confecionate din anumite tipuri
de plastic sau sticl. Pot aprea, aadar, interferene cauzate de eliberarea unor substane, n
special materiale plastice, din care sunt confecionate recipientele folosite n timpul analizei. Prin
urmare, materialele folosite trebuie verificate; loturi diferite de tuburi sau pipete pot avea o
compoziie uor diferit, i de aceea analistul trebuie s repete aceste teste nainte de a folosi un
lot nou.
Decizia de a folosi testul pentru endotoxine bacteriene drept test limit implic, n primul rnd,
cunoaterea concentraiei maxime admise de endotoxin pentru produsul analizat i n al doilea
rnd, c scopul testului este de a afla dac valoarea concentraiei de endotoxin n produsul
analizat este mai mic sau mai mare dect concentraia limit. Metodele cantitative C, D, E i F
ofer posibilitatea de a determina concentraia de endotoxin n proba examinat, ns n cele din
urm rezultatele vor fi raportate fa de concentraia limit de endotoxine.

La stabilirea concentraiei maxime admise de endotoxin pentru produsul analizat, o atenie

deosebit trebuie s se acorde dozelor de produs folosite n terapie: concentraia limit trebuie s
fie stabilit astfel nct s se asigure faptul c produsul nu va conine suficient endotoxin
pentru a cauza o reacie toxic, chiar la administrarea n doz maxim per or.
Atunci cnd concentraia de endotoxin n produs este egal exact cu valoarea concentraiei
limit, va avea loc formarea cheagului, la fel ca i n cazul n care concentraia de endotoxin
este mult mai mare, iar produsul nu va ndeplini condiiile de trecere a testului, deoarece acest
test este de tipul totul sau nimic, fr a putea diferenia ntre o concentraie exact egal cu
limita admis i una mai mare dect aceasta. Doar n cazul n care nu se produce formarea
cheagului, analistul poate conchide c valoarea concentraiei de endotoxin este mai mic dect
concentraia limit.
Deoarece testul poate fi efectuat doar pe soluii, pentru produsele n stare solid, concentraia
limit de endotoxin per unitate de mas sau per Unitate Internaional (UI) a produsului,
urmeaz a fi transformat n concentraie de endotoxin per mililitru de soluie. Cazul
substanelor care se prezint n stare lichid (cum ar fi soluiile infuzabile) este discutat mai jos.

Concentraia limit de endotoxin: limita de endotoxin pentru substane active administrate

parenteral, apreciat n baza dozei este egal cu:
K
M

, unde:

K = doza maxim de endotoxin per kilogram corp ntr-o perioad de o or,

M = doza maxim recomandat a produsului per kilogram corp ntr-o perioad de o or.
Limita de endotoxin depinde de produs i calea lui de administrare i este indicat n
monografii.
Valorile pentru K sunt indicate n tabelul de mai jos.
Calea de administrare
Intravenoas
Intravenoas, pentru produse
radiofarmaceutice
Intratecal

K (UI endotoxin per kg corp per

or)
5.0
2.5
0.2

n continuare, se va pune ntrebarea ce diluie din produsul analizat trebuie testat pentru a oferi
sigurana c rezultatul negativ al testului se traduce printr-o concentraie de endotoxin n produs
mai mic dect limita de endotoxin i c rezultatul pozitiv semnific detectarea unei
concentraii de endotoxin egale sau mai mari.
Aceast diluie depinde de limita de endotoxin i de sensibilitatea lizatului: ea se numete
Diluia maxim admis (DMA), iar valoarea ei poate fi calculat aa cum a fost artat mai sus.
Dac valoarea diluiei maxime admise nu este un numr ntreg, n scopuri practice poate fi folosit
un numr potrivit ntreg, mai mic dect DMA (ceea ce nseamn c se va prepara o soluie de
produs mai puin diluat dect DMA). n acest caz, un rezultat negativ indic faptul c valoarea
concentraiei de endotoxin din produs este mai mic dect valoarea limit. Totui, atunci cnd
concentraia de endotoxin din produs este mai mic dect limita admis, dar suficient de nalt
pentru a intra n reacie cu lizatul, formnd un cheag, testul poate fi considerat pozitiv. Prin
urmare, atunci cnd un test cu acest factor de diluie "rotunjit" este pozitiv, produsul trebuie s
fie diluat la DMA i testul trebuie s fie repetat. n cazul oricror ndoieli, se va folosi DMA.
Exemplu
Este necesar testarea unei soluii de 50 mg/ml de fenitoin de sodiu (destinat uzului
parenteral).
Trebuie determinat DMA, cunoscnd urmtoarele variabile:
M = doza maxim folosit la om = 15 mg per kilogram corp per or,
c = 50 mg/ml,
K = 5 UI de endotoxin per kilogram corp per or,
= 0.4 UI de endotoxin per mililitru.
DMA=

5 x 50
15

1
0.4

= 41.67

Pentru efectuarea unor teste de rutin, s-ar putea s fie mai practic diluarea unui ml de soluie
analizat pn la 20 ml (DMA/ 2 rotunjit pn la numrul ntreg mai mic). Totui, dac
rezultatul acestui test este pozitiv, analistul va trebui s dilueze 1 ml pn la 41.67 ml i s repete
testul.
Substana de referin
Standardul de Endotoxin BRP (biological reference preparation) este destinat pentru a fi folosit
drept substan- standard. El a fost comparat cu Standardul Internaional de Endotoxin al OMS
i potena lui este exprimat n Uniti Internaionale de endotoxin per flacon. Unitatea

Internaional de endotoxin este definit ca activitatea specific a unei anumite cantiti

(exprimat n uniti de mas) din Standardul Internaional.
Pentru teste de rutin, poate fi folosit i un alt standard de endotoxin, cu condiia ca acesta s fi
fost comparat cu Standardul Internaional de Endotoxin sau BRP, iar potena s fie exprimat n
Uniti Internaionale de endotoxin.
NOT: o Unitate Internaional (UI) de endotoxin este egal cu o Unitate de Endotoxin
(U.E.).
Ap pentru TEB
Testarea absenei endotoxinelor n acest reactiv printr-o tehnic asemntoare testului pentru
substane pirogene pe iepuri a fost respins din urmtoarele motive:
4.1. Testul pe iepuri nu este suficient de sensibil pentru detectarea endotoxinei n apa pentru
TEB, destinat testrii produselor cu o limit foarte joas de endotoxin;
4.2. Precizia relativ joas a rspunsului febril la iepuri va necesita multe replicate;
4.3. Termenii "pirogeni" i "endotoxine" denot grupuri de entiti care nu coincid n totalitate.
pH-ul amestecului
n cadrul testului pentru endotoxine bacteriene, procesul optim de formare a cheagului are loc
ntr-un amestec cu un pH cuprins intre 6.0 - 8.0.
Totui, adugarea lizatului peste prob poate determina scderea pH-ului.

Validarea lizatului
Pentru prepararea soluiilor de lizat este important respectarea instruciunilor productorului.
Factorii de diluie pozitivi ai punctului final n metodele gel-cheag A i B sunt transformai n
logaritmi. Motivul este c dac se reprezint grafic distristribuia frecven elor acestor valori
logaritmice, aceasta se apropie mult mai mult de curba normal de distribuie dect curba
distribuiei frecvenelor corespunztoare factorilor de diluie; de fapt, ea este att de similar,
nct este acceptat utilizarea distribuiei normale a frecvenelor ca model matematic i calculul
intervalului de confiden cu ajutorul testului T-student.
Testul preliminar la factori de interferen

Unele produse nu pot fi testate pentru prezena endotoxinelor n mod direct deoarece nu sunt
miscibile cu reactivii utilizai, nu sunt compatibile cu intervalul de pH 6.0 - 8.0 sau inhib ori
activeaz formarea gelului. De aceea, pentru a verifica prezena factorilor de interferen, este
necesar efectuarea unui test preliminar; dac n urma acestor teste sunt identifica i factori de
interferen, analistul trebuie s demonstreze c procedura de nlturare a lor a fost eficient.
Scopul testului preliminar este de a testa ipoteza nul (H 0: sensibilitatea lizatului n prezena
produsului analizat nu difer semnificativ de sensibilitatea lizatului n absena acestuia). n
metodele A i B se folosete un criteriu simplu: ipoteza nul este acceptat dac sensibilitatea
lizatului n prezena produsului se afl n intervalul 50-200% din valoarea sensibilitii lizatului
n sine.
Abordarea clasic este de a calcula mediile factorului de diluie logaritmat pentru sensibilitatea
lizatului cu i fr produs i de a testa diferena dintre cele dou medii prin testul T-student.
Testul la factori de interferen n metodele gel-cheag A i B necesit folosirea unei probe de
produs n care endotoxinele nu sunt detectabile. Aceasta reprezint o problem teoretic n cazul
n care urmeaz a fi testat un produs totalmente nou. Prin urmare, pentru metodele cantitative C,
D, E i F a fost elaborat o abordare diferit.
nlturarea factorilor de interferen
Procedurile de nlturare a factorilor de interferen nu trebuie s mreasc sau s micoreze (de
exemplu, prin adsorbie) cantitatea de endotoxin n produsul examinat. Modul corect de a
verifica acest lucru este de a aplica procedurile date unei probe contaminate (cu o concentraie
cunoscut de endotoxin) de produs, cu msurarea ulterioar a ratei de recuperare a endotoxinei.
Metodele C i D. Dac produsul care urmeaz a fi analizat, conine factori de interferen, ce nu
pot fi nlturai prin metodele clasice, se poate crea o curb standard folosind un produs similar,
care s nu conina endotoxine. Apoi se efectueaz testul la endotoxine prin comparaie cu aceast
curb standard.
S-a dovedit c n majoritatea cazurilor, ultrafiltrarea prin filtre cu membran asimetric din
triacetat de celuloz reprezint o metod adecvat pentru ndeprtarea interferen elor. Filtrele
utilizate trebuie s fie validate n mod corespunztor, deoarece n unele circumstane derivaii
celulozei (-D-glucanii) pot da rezultate fals pozitive. Filtrele din polisulfon nu sunt adecvate
pentru acest test, deoarece unii utilizatori au obinut rezultate fals pozitive.
Scopul verificrilor
Scopul verificrilor, efectuate cu ap pentru TEB i cu standardul de endotoxin la o concentraie
dubl a sensibilitii lizatului fa de cea nscris n ambalajul produsului, este de a verifica
activitatea lizatului n timpul i n condiiile testului respectiv. Scopul reaciei cu controlul
negativ este de a verifica absena unei concentraii detectabile de endotoxin n apa pentru TEB.

Controlul pozitiv, care conine produsul analizat, la concentraia folosit n test, se folose te cu
scopul de a demonstra absena oricror factori inhibitori n timpul i n condiiile testului
respectiv.
Aprecierea i interpretarea rezultatelor
Cantitile mici de endotoxin n apa pentru TEB, sau n oricare alt reactiv sau material, cu care
ia contact lizatul n timpul testului, pot s nu fie detectate dac nu ating limita de sensibilitate a
lizatului. Totui, ele pot crete concentraia de endotoxin n proba analizat fa de concentra ia
real, depind limita de sensibilitate a lizatului, determinnd o reacie pozitiv.
Acest risc poate fi redus prin testarea apei pentru TEB i a altor reactivi i materiale cu cel mai
sensibil lizat disponibil, sau cel puin cu un lizat mai sensibil dect cel folosit la testarea
produsului. Chiar i n aceste condiii, riscul de a obine un "rezultat fals pozitiv" nu poate fi
complet eliminat. Trebuie, totui, subliniat faptul c testul nu permite nregistrarea unui rezultat
fals negativ, fapt care ar putea duce la admiterea unui produs nesatisfctor, punnd n primejdie
sntatea pacientului.

nlocuirea testului pentru pirogeni pe iepuri printr-un test la endotoxine bacteriene

Monografiile produselor farmaceutice pentru uz parenteral, care pot conine cantit i mici de
endotoxine bacteriene, prevd necesitatea testrii acestora pentru endotoxine bacteriene sau
printr-un test pe iepuri pentru determinarea eventualelor impuriti pirogene.
Aspecte generale:

n orice monografie individual, este specificat un singur test, fie cel pentru pirogeni, fie
cel pentru endotoxine bacteriene;
n absena unor indicaii contrare, testul la endotoxinele bacteriene se va prefera testului
la pirogeni, deoarece de obicei se consider c el asigur pacientului o protecie egal sau
mai mare;
nainte de a include un test la endotoxine bacteriene ntr-o monografie, trebuie dovedit
faptul c una din metodele descrise mai sus poate fi aplicat, cu rezultate satisfctoare
asupra produsului specificat n monografie;
Informaia necesar este obinut de la productori. Companiile sunt rugate s ofere toate
datele disponibile, privitoare la aplicabilitatea testului la endotoxine bacteriene asupra
substanelor i preparatelor care urmeaz a fi analizate. Aceste date includ detalii despre
prepararea probei i a oricror proceduri necesare pentru a elimina factorii de
interferen. n plus, se vor oferi toate datele disponibile despre testul pe iepuri pentru
decelarea prirogenilor, fapt care va contribui la asigurarea faptului c nlocuirea testulului
pe iepuri prin testul la endotoxine bacteriene este adecvat.

Folosirea unui test pentru endotoxine bacteriene diferit de cel prevzut n monografie

n caz c monografia recomand efectuarea unui test la endotoxine bacteriene, dar nu specific
nici una din cele ase metode (A - F) descrise n capitolul 2.6.14, atunci nseamn c pentru acest
produs a fost validat metoda A, metoda gel-cheag: test limit. Dac este specificat una din
celelalte metode (B - F), atunci nseamn c metoda indicat care a fost validat pentru
respectivul produs i aceea va fi folosit pentru testarea produsului.
Validarea metodelor alternative
nlocuirea unui test pentru pirogeni pe iepuri prin testul la endotoxine bacteriene sau nlocuirea
unei metode stabilite sau implementate la endotoxinele bacteriene prin alt metod, trebuie
calificat drept folosire a unei metode alternative n nlocuirea unui test farmacopeic, dup cum
este descris mai jos:
"Testul i analizele descrise sunt metode oficiale, pe care se bazeaz standardele Farmacopeei. n
scopuri de verificare, cu acordul autoritilor competente, pot fi folosite metode alternative de
analiz, asigurnd faptul c metodele folosite permit luarea unei decizii univoce, asemntoare
celei care ar fi fost luat n complian cu standardele monografiilor la folosirea metodelor
oficiale. n caz de ndoieli sau dispute, unicile metode de referin pentru analiz sunt cele din
Farmacopee."
Pentru validarea unei alte metode la endotoxine bacteriene dect cea prescris sau indicat n
monografie sunt sugerate urmtoarele proceduri:

Procedura, materialele i reactivii, folosite n metod trebuie s fie validate dup cum este
descris n testul respectiv;
Prezena factorilor de interferen (i, dac este necesar, procedura de nlturare a lor)
trebuie s fie testat pe probe din cel puin trei loturi. Se va ine cont c metodele D i E,
care folosesc o peptid cromogenic, necesit reactivi, ce nu sunt folosii n metodele A,
B, C i F, i prin urmare compliana metodelor A, B, C sau F cu cerinele pentru factorii
de interferen nu pot fi extrapolate asupra metodei D sau metodei E fr testare
suplimentar.

Validarea testului la produse noi

Procedurile descrise mai sus trebuie s fie aplicate tuturor produselor noi, destinate pentru uz
parenteral, care urmeaz a fi testat pentru prezena de endotoxine bacteriene conform cerinelor
Farmacopeei.

Five simple models for interfering factors test of bacterial endotoxins test
Pei Yusheng, Cai Tong, Gao Hua, Tan Dejiang, Zhang Yuchen, Zhang Guolai

Chinese Medical Journal 2014;127(18):3344-3346:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.20140611

Conform articolului mentionat mai sus, endotoxinele reprezint cauza a peste 50% din cazurile
de sepsis, cu o rat crescut de mortalitate. Majoritatea testelor pentru detecia factorilor de
interferen i pentru detecia endotoxinelor bacteriene ntr-un preparat folosesc lizatul de
amibocite. Resursele de Limulus n China sunt reduse, motiv pentru care articolul se axeaz pe
prezentarea a 5 noi metode de detecie a factorilor de interferen, care folosesc un numr de
replicate mai mic dect cel considerat necesar in USP36 (la fel ca i n FE6).

USP36 Model 1 Model 2

Concentraie de
Factor Concentrai Numr Numr Numr
Solui endotoxine/soluia Solven
de
e de
de
de
de
a
la care se adaug t
diluie endotoxin replicat replicat replicat
endotoxina
e
e
e
A
0/soluia test
4
2
2
1
2
4
3
2
1
4
3
2
Solui 2
B
2 /soluia test
a-test 4
0.5
4
3
2
8
0.25
4
3
2
1
2
2
2
2
Ap
2
1
2
2
2
C
2 /ap pentru TEB pentr
4
0.5
2
2
2
u TEB
8
0.25
2
2
2
D
0/ap pentru TEB 2
2
2
Tabel 1.Prepararea soluiilor pentru testul pentru factori de interferen din USP36, pentru
modelul 1 i 2 (modele propuse n articol)
A: soluie-test a probei analizate, ce nu conine endotoxine detectabile; B: test pentru factori de
intereferen; C: control pentru sensibilitatea lizatului; D: control negativ.

Solui Concentraie de
a
endotoxin
A
B
C
D

2
0.25
2
0.25
-

Model 3
Numr de
replicate
2
4
4
2
2
2

Model 4
Numr de
replicate
2
3
3
2
2
2

Model 5
Numr de
replicate
2
2
2
2
2
2

Tabel 2. Prepararea soluiilor pentru testul pentru factori de interferen pentru modelele 3,4 i
5. Soluiile A, B, C i D au aceeai compoziie ca i cele din tabelul 1.