2.

Elemente legate de conduita n laboratorul de bacteriologie /

microbiologie. Norme de protecie a muncii n laboratorul de
microbiologie.

inta activitii n laboratorul de bacteriologie / micologie ar putea fi

definit foarte pe scurt drept stabilirea tratamentului care trebuie
urmat n cazul unui pacient care prezint o boal infecioas de
etiologie bacterian / fungic. De fapt lucrurile sunt mult mai
complicate, datele de laborator nu pot fi interpretate n lipsa unei
pregtiri serioase att din punct de vedere teoretic ct i practic, n
lipsa unei activiti susinute n perioada de pregtire care dureaz
mai muli ani i de fapt continu toat viaa.

Ceea ce trebuie s fie ns foarte clar nc de la nceput este c, fr

respectarea unor principii, n condiiile efecturii sau interpretrii
mecanice a unor teste etc., diagnosticul de laborator microbiologic
corect devine imposibil.

n vederea atingerii scopului, n laboratorul de bacteriologie se vor

efectua tehnicile necesare:

stabilirii prezenei sau dovedirii absenei unor anumite

bacterii la nivelul unui anumit substrat

studierii bacteriilor izolate pentru identificarea genului,

grupului, speciei, tipului (de la caz la caz) avnd la baz o serie de
caractere ale bacteriilor, precum

caracterele morfotinctoriale

caracterele de cultur

caracterele biochimice (pigmentogeneza, sinteza altor factori

care pot fi evideniai macroscopic, sinteza unor enzime, sinteza de
bacteriocine, capacitatea de a fermenta un anumit substrat,
capacitatea de a folosi un anumit substrat drept unic surs de
carbon etc)

caracterele antigenice (utiliznd tehnici din domeniul

imunologiei)

caracterele de patogenitate

sensibilitatea fa de bacteriofagi
 caractere legate de sinteza anumitor metabolii sau structuri
moleculare identificabile spre ex. prin tehnici de cromatografie

caracterele genetice etc

stabilirii faptului c bacteria izolat este implicat n procesul

infecios respectiv

stabilirii sensibilitii la antibiotice i chimioterapice

monitorizrii evoluiei sub tratament (dovedirea eficienei

tratamentului antibacterian ales)

identificrii contaminrii de laborator

depistrii purttorilor de germeni etc.

Chiar dac cele menionate mai sus par complicate, ele reprezint o
simplificare n raport cu complexitatea activitii din laboratorul de
bacteriologie.

Pentru ndeplinirea obiectivelor, laboratorul de bacteriologie trebuie

astfel conceput nct condiiile de lucru s fie optime. n plus,
trebuie s avem n vedere c n momentul efecturii oricrei tehnici
de laborator, este necesar s fie asigurat protecia personalului de
laborator precum i prevenirea contaminrii probelor de lucru. Toate
elementele necesare trebuie s apar scrise manualul tehnic
menionat n cadrul capitolului precedent.

Cldirea laboratorului de bacteriologie medical trebuie s asigure,

pe ct posibil, prevenirea expunerii la praf, cureni de aer, s fie
luminoas i n msura posibilitilor spaiile de lucru s fie
orientate astfel nct s previn incidena direct a razelor solare
(avnd n vedere efectul bactericid al radiaiilor UV; acest element
este de maxim importan n laboratorul de mycobacteriologie).

Fiecare ncpere a laboratorului de bacteriologie trebuie s aib o

destinaie precis iar planul laboratorului n ansamblu trebuie s
prevad un anumit flux, pe ct posibil ntr-un sens unic n vederea
prevenirii contaminrii preparatelor de laborator i respectiv
prevenirea ntlnirii dintre materialele contaminate i materialele
sterile.
Laboratorul de bacteriologie medical include ncperi (spaii) n
vederea desfurrii corespunztoare a urmtoarelor activiti:

recepionarea probelor recoltate n afara laboratorului

recoltarea probelor n laborator

prelucrarea probelor n vederea cultivrii, identificrii

bacteriilor implicate etiologic, prin diferitele tehnici bacteriologice

realizarea diferitelor tehnici imunologice utile n diagnosticul

bacteriologic sau imunologic

pregtirea materialelor necesare n laborator

sticlrie

alte instrumente de laborator

reactivi

medii de cultur etc

depozitarea materialelor necesare n laborator

splarea materialelor nainte de sterilizare etc.

n afar de cele menionate mai sus, n laboratorul de bacteriologie

mai exist spaii destinate activitilor administrative (birouri),
vestiare, grupuri sanitare etc.

n cazul unor laboratoare specializate (de ex. studiul acizilor grai

prin tehnici de cromatografie, studiul caracteristicilor bacteriene
prin tehnici de biologie molecular etc.), exist anumite
particulariti n planificarea i distribuirea spaiilor funcionale din
laborator; elementele tehnice legate de aceste structuri sunt
prezentate n diferite manuale tehnice care pot fi consultate de ctre
cei interesai.

ncperile, spaiile, mobilierul din laboratorul de bacteriologie vor fi

construite n aa fel nct s permit realizarea unei curenii i
dezinfecii la cel mai nalt nivel; n cazul acestui tip de laboratoare
se poate vorbi de necesitatea atingerii perfeciunii. Va fi acordat
toat atenia pentru ca laboratorul s fie organizat n vederea
 realizrii scopului menionat mai sus prin tehnicile enumerate

prevenirii contaminrii probelor de laborator

prevenirii rspndirii germenilor n mediul ambiant

prevenirii infeciilor de laborator.

nainte de a ncheia prezentarea principalelor ncperi (spaii) din

laboratorul de bacteriologie, dorim s menionm c:

structura prezentat pentru laboratorul de bacteriologie nu

difer n mod esenial de structura unui laborator de microbiologie
n general

n structura laboratorului este de dorit s fie incluse (n

msura posibilitilor i n funcie de nivelul laboratorului, de
exemplu n cazul unui laborator de spital universitar) spaii n care
s se poat desfura activiti de nvmnt i pregtire teoretic
i practic, spaii n care ar putea avea loc i diferite ntlniri tehnice
ntre membrii personalului de laborator

laboratorul trebuie s fie legat funcional de clinic.

Datele privind funcionarea laboratoarelor care efectueaz analize

medicale sunt incluse n Ordinul ministrului sntii nr. 119 / 2004,
normativ aduce la zi Ordinul ministrului sntii i familiei nr. 609 /
2002, precedat de Ordinul ministrului sntii nr. 915 / 2000. Aceste
acte normative trebuie revizuite i adaptate periodic.

Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie

n laboratorul de microbiologie se lucreaz cu microorganisme

potenial patogene sau dovedite a fi patogene, care se pot identifica
n diferite produse patologice (ex. snge, materii fecale, urin etc)
sau au fost izolate n culturi la nivelul laboratorului. Exist i
posibilitate ca un anumit laborator s primeasc spre identificare
culturi i izolate de la un laborator cu un nivel de competen
inferior.

Chiar dac activitatea se desfoar ntr-un laborator dedicat

lucrrilor practice i demonstraiilor fcute sub supravegherea unui
cadru didactic pentru studeni sau tineri medici rezideni, exist o
serie de reguli care trebuie aplicate cu strictee n vederea eliminrii
riscurilor de contaminare:
1. Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator.
Tinerii medici sau viitori medici vor accede n laborator i vor
participa la desfurarea lucrrilor practice numai dup audierea i
nsuirea (dovedit prin semntura pe un proces verbal pregtit n
acest sens) regulilor de protecie a muncii.

2. Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenial

infectante.

3. Este obligatorie purtatea echipamentului de protecie; halatul

de protecie reprezint nivelul minim acceptat. Halatul trebuie s fie
curat i corect ncheiat. n anumite situaii se va recomanda
utilizarea mnuilor, ochelarilor, mtii, bonetei, orului,
nclmintei de protecie. Se recomand ca echipamentul de
protecie s fie pstrat separat de hainele utilizate n exterior.

4. Nu se vor purta mnui de latex n momentul manipulrii

becului Bunsen.

5. Mncatul i butul sunt interzise n sala de lucrri practice de

microbiologie. Fumatul este interzis, conform legii, n orice instituie
medical din Romnia i cu att mai mult nu este acceptat ntr-un
laborator de microbiologie.

6. Se interzice aplicarea de cosmetice, lcuirea unghiilor,

purtarea de unghii false, manipularea lentilelor de contact etc.

7. Este interzis introducerea n gur a oricrui obiect.

8. Pipetarea cu gura este strict interzis. n vederea pipetrii se

vor utiliza dispozitive de pipetare adecvate.

9. Nu este permis depozitarea obiectelor de uz personal pe masa

de lucru (haine, geni, serviete, caiete etc). Se recomand ca hainele
s fie lsate la garderob sau ntr-un spaiu special amenajat.

10. Manipularea materialului contaminat se va realiza cu maxim

precauie pentru evitarea rspndirii microorganismelor. Activitile
se vor desfura n vecintatea becului Bunsen aprins.

11. nsmnrile se efectueaz la flacr. Se vor flamba gurile

tuturor recipientelor (tub, eprubet, flacon de sticl etc) utilizate,
att la deschidere ct i la nchidere.

12. Ansa bacteriologic se va steriliza la rou, att bucla ct i

firul ansei (iar portansa se va flamba) nainte i dup folosire. Atunci
cnd s-a terminat lucrul cu ansa ncrcat cu produs patologic, n
vederea sterilizrii bucla ansei va fi introdus iniial la baza
flcrii unde temperatura este mai sczut, pentru a preveni
mprocarea cu particule infecioase. Atunci cnd se lucreaz ntr-un
laborator de analize se vor lua preacauii suplimentare.

13. Se vor utiliza anse bacteriologice corect i complet nchise i cu o

bucl cu diametrul mai mic de 3 milimetri pentru a se evita
descrcarea spontan. Nu se vor face micri brute atunci cnd
ansa este ncrcat cu produs patologic. Se vor evita gesturile ample
i se va menine un permanent control asupra micrilor efectuate n
laboratorul de microbiologie.

14. Recomandm ca toate activitile care pot fi efectuate n

laborator s fie nscrise i detaliate n manualul tehnic al
laboratorului. nainte de nceperea oricrui test sau a oricrei
manevre, trebuie s avem n minte toi paii pe care urmeaz s i
facem (conform protocolului de lucru) astfel nct s avem un control
mental permanent al fiecrei manevre pe care urmeaz s o
executm.

15. Nu este permis fuga i nici mersul rapid prin laborator.

16. Pipetele contaminate (pipete Pasteur, pipete gradate etc) nu se

vor decontamina la flacr, ci vor fi introduse (evitnd producerea
de stropi potenial infectani) n flaconul cu dezinfectant (lichidul
dezinfectant trebuie s depeasc nivelul pn la care a ajuns
produsul contaminant), unde vor fi meninute pentru circa 24 ore (n
funcie de substana dezinfectant utilizat). Flaconul cu amestec
dezinfectant este obligatoriu. Tot n amestecul dezinfectant vor fi
introduse cu aceleai precauii lamele de sticl folosite.

17. Toate celelalte obiecte contaminate (exceptnd ansele

bacteriologice, pipetele i lamele) se vor introduce la finalul
activitii practice, cu precauie, ntr-un recipient (ex. o gleat din
metal, cu capac) care va fi autoclavat.

18. Se va restrnge pe ct posibil utilizarea obiectelor ascuite,

tietoare i neptoare.

19. Pentru ndeprtarea obiectelor ascuite de unic ntrebuinare

recomandm utilizarea de cutii sigure n care acestea s fie
colectate. Aceste cutii vor fi ulterior incinerate.

20. n cazul n care are loc accidental contaminarea unei suprafee

cu produse patologice sau culturi, n cazul n care acest eveniment
se datoreaz unui tnr medic sau viitor medic aflat n pregtire, n
primul rnd trebuie anunat fr ntrziere asistentul responsabil cu
pregtirea respectivei grupe de lucru. Se recomand acoperirea cu o
pnz a suprafeei contaminate dup care se toarn o soluie
dezinfectant care se va menine pe loc n funcie de recomandrile
productorului, dar nu mai puin de 30 minute. Ulterior se poate
trece (dup caz) la curirea locului.

21. La sfritului lucrului n laborator se vor spla minile cu ap i

spun.

22. n afar de aceste msuri, se vor avea n vedere toate cele

necesare evitrii oricrui risc care ar putea rezulta n urma utilizrii
unor substane caustice, manipulrii diferitelor aparate electrice etc.

n ceea ce privete utilizarea cabinetelor de siguran biologic

(hote, boxe, nie), vor fi prezentate unele noiuni n capitolul al 3-
lea.

Respectarea acestor norme de protecie este strict necesar.

Trebuie s avem n vedere i faptul c recomandrile i directivele

Uniunii Europene n domeniul biosecuritii au fost adoptate de
ctre ara noastr.

3. Date privind echipamentul i aparatura utilizate n laboratorul de

microbiologie

n diferitele ncperi (spaii) ale laboratorului de microbiologie

putem ntlni o serie de echipamente, elemente de birotic, diferite
aparate.
Spre exemplu, n ncperea unde are loc recepionarea produselor
patologice trebuie s existe registre sau un sistem computerizat de
nregistrare a datelor (nregistrarea corect a datelor n sistemul
sanitar trebuie s reprezinte o prioritate pentru oricare dintre
unitile medicale indiferent de sistemul public sau privat), stative
pentru tuburi, eprubete, flacoane etc, un incubator la 37C, un
frigider etc. n locul unde se desfoar diagnosticul microbiologic
trebuie s existe la ndemn anse bacteriologice, diferite pipete,
pense, baghete de lemn, tampoane de diferite dimensiuni, becul
Bunsen, microscopul, lupa, lame i lamele, truse de colorare,
centrifuga, balana, baia de ap, un incubator, un frigider, plci
Petri, eprubete, containere pentru materialul contaminat, cabinetul
de siguran biologic etc.

n cele ce urmeaz vor fi enumerate o parte dintre ustensilele i

aparatele care se pot gsi n laboratorul de microbiologie.

1. Microscoape, lupe i truse de colorani:

- microscop optic (cmp luminos)

- alte tipuri de microscop, care pot fi utilizate n camer

obscur (microscop cu fond ntunecat, microscop cu contrast de
faz, microscop cu fluorescen) n situaii particulare de diagnostic

- truse pentru coloraii uzuale (albastru de metilen, Gram,

Ziehl-Neelsen etc) i speciale

- lup de mn i lup stereoscopic (pentru studierea

morfologiei coloniilor)

2. Cabinete de siguran biologic (incinte, boxe, nie):

- cabinetul de clas I, n care aerul curat antreneaz aerosolii

produi dinspre persoana care lucreaz i care se afl n laborator
ctre mediul exterior, printr-un filtru care reine majoritatea
particulelor periculoase

- cabinetul de clas II, n care aerul curat ptrunde filtrat, este

recirculat prin filtre astfel nct suprafaa de lucru vine n contact cu
aer steril; n box nu se vor introduce surse de cldur

- cabinetul de clas III este complet nchis; medicul i

introduce minile n zona de lucru prin mnui fixate etan la aparat;
aerul este att admis ct i evacuat prin filtre
3. Termostate i bi de ap sau de nisip:

- termostate reglate la diferite temperaturi, n funcie de

profilul laboratorului i a germenilor studiai (ex. 35-37C pentru
bacterii, 28C pentru fungi etc)

- camere termostat

- bi de ap de diferite mrimi (ex. pentru decomplementarea

serurilor la 56C)

- bi de nisip (ex. pentru coagularea unor medii de cultur /

Loeffler etc)

4. Frigidere:

- frigidere de diferite dimensiuni, cu temperatura interioar de

+ 4C / este de preferat utilizarea unui frigider separat de
congelator, deoarece frigiderul se deschide mai frecvent i aceasta
va influena temperatura din compartimentul congelator

- camere frigorifice

- congelatoare de - 20C i de - 70C (pentru anumite

laboratoare specializate)

5. Centrifugi i balane:

- n mod curent sunt utilizate centrifugi cu viteza de 3000 g,

preferabil cu rotor orizontal (pentru diminuarea cantitii de
aerosoli); n apropierea centrifugii se va plasa o balan, pentru
echilibrarea tuburilor

- centrifugi cu viteze superioare, n laboratoare specializate

(mycobacteriologie)

- centrifugi cu viteze superioare i sistem de rcire (biologie

molecular)

- balane tehnice (pentru medii de cultur, reactivi, soluii n

volume mari)

- balane farmaceutice (pentru soluii de colorani, alte soluii

n volume mici)

- balan analitic (pentru reactivi n cantiti foarte mici)

- balan electronic (pentru biologie molecular)

6. Mojare, agitatoare, dispozitive de triturare a esuturilor

7. Aparate pentru distilarea i demineralizarea apei

8. Aparate pentru stabilirea pH-ului

9. Fotometre sau colorimetre

10. Distribuitoare pentru medii de cultur

11. Aparate i dispozitive pentru sterilizare i dezinfecie:

- incinerator (de regul, n vederea incinerrii se ncheie un

contract de prestri servicii cu o firm de profil)

- etuv (pupinel, cuptor Pasteur)

- autoclav

- filtre de diferite tipuri

- lmpi cu UV etc

12. Containere pentru materialul contaminat:

- glei de metal cu capac

- saci din material plastic

- saci rezisteni la temperaturile atinse n autoclav

- borcane cu soluii dezinfectante etc

13. Inventar de sticlrie:

- eprubete de diferite dimensiuni (ex. 12 / 120 mm, 16 / 160

mm)

- tuburi de centrifug

- eav de sticl pentru confecionarea de pipete Pasteur

- pipete gradate de diferite dimensiuni

- baghete de sticl

- baloane

- flacoane (ex. Erlenmeyer)

- pahare (ex. Berzelius)

- exsicatoare

- cilindrii gradai de diferite dimensiuni

- plci Petri

- lame i lamele pentru microscopie etc

14. Inventar de material plastic i cauciuc:

- dispozitive adaptate la pipete pentru a elimina pipetarea cu

gura

- tuburi de centrifug

- containere pentru produsele patologice

- plci Petri

- anse calibrate etc

15. Alte articole de laborator: trepiede, stelaje de lemn sau metal,

couri de srm, site de azbest, becuri Bunsen, casolete, foarfeci,
bisturie, pense, sonde, seringi, anse bacteriologice (cu bucl, anse-
fir, din platin sau nichelin), tampoane diferite, tije cu tampon i
alte instrumente pentru recoltarea produselor patologice,
termometre etc.

Fr a ncerca s menionm toate dispozitivele, echipamentele,

aparatele ntlnite ntr-un laborator de microbiologie am considerat
c aceast listare este util att pentru medicul sau biologul care
lucreaz n laborator ct i pentru viitorul medic, indiferent de
specialitate.

4. Metode de dezinfecie i sterilizare utilizate n laboratorul de

microbiologie

Definiii de baz

Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor

microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau
spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau solid).

Septic nseamn contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de

exemplu infecia unei plgi).

Aseptic nseamn lipsit de microbi, indiferent dac microbii sunt

patogeni sau nepatogeni.

Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm

contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care
putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur,
medicamentelor injectabile etc.

Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene

(uneori i a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe
suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul
substanelor dezinfectante.

Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor

vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plgi. Se
realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice.

Sterilizarea

Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s

fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare diversitate de materiale
care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt
destul de variate, dup cum urmeaz:

1. Metode de sterilizare prin cldur

cldura uscat

cldura umed

2. Metode de sterilizare prin filtrare

3. Metode de sterilizare utiliznd radiaiile

4. Metode chimice de sterilizare.

Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia

radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid
de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie.

Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului

care urmeaz s fie sterilizat:

splare, uscare, ambalare / n cazul materialelor curate,

necontaminate

autoclavare, splare, uscare, ambalare / n cazul materialelor

contaminate refolosibile

Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin

indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree)
sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus).

Sterilizarea prin cldur uscat

Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau

carbonizarea structurilor bacteriene.

1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint

introducerea i meninerea n flacra becului Bunsen pn la
nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat.
Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau
pentru spatul.

Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui

obiect, fr a se atinge temperatura de incandescen. Flambarea se
aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet,
flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur.

2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor

Pasteur). Etuva este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul
unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine
temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n
interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de
ventilaie.

Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate,

temperatura din etuv trebuie s ating 180C, pentru o durat de 1
or. n unele situaii timpul de sterilizare poate depi 60 de minute
(ex. pentru ambalaje de dimensiuni mari).

Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl,

obiecte de porelan, pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre,
instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de
menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la
declirea oelului) etc. Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase,
obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac, fibr
sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din
laborator.

3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu.

Exist anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni
diferitele tipuri de poluare.

n cazul spitalelor, de multe ori sunt prevzute incineratoare n

structura unitii sanitare respective. De regul, n vederea
incinerrii se ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de
profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar
putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic,
reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien
etc.

Sterilizarea prin cldur umed

Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de

sterilizare i are ca mecanism coagularea proteinelor i degradarea
enzimelor.

1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de

microbiologie ct i pentru unitile sanitare n general, indiferent
de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz la 0,5
atmosfere o temperatur de 115C, la 1 atmosfer o temperatur de
121C i respectiv 134C la 2 atmosfere.

Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care

se nchide etan cu un capac prevzut cu un sistem special de
nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la
presiunea necesar n vederea sterilizrii. Exist mai multe tipuri de
autoclave:

autoclave cu perete simplu

verticale

orizontale

autoclave cu manta de aburi

verticale

orizontale.

n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul

cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflat n
cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus.
Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un
manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare
exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care
permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior
(robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita
accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite
evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor
depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea
riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub
presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite
deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o
egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-
un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n
care se afl sursa de cldur.

n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care

se aeaz o plac de metal perforat. Pe suport se aeaz
materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat
permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n
vederea sterilizrii se procedeaz astfel:

verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care

trebuie s fie pn la o distan de 2-3 centimetri de suport; dac
nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap
distilat)

aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat,

ambalate corespunztor

nchidem etan capacul, folosind sistemul special de

etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l avem la
dispoziie

conectm sursa de cldur

deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor

(dac rmne aer n cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va
scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n
special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge
temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea
inferioar a cazanului)

nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet

continuu de vapori

presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu

ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea atinge valoarea dorit
(de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast
presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30
minute)
 dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i
lsm autoclavul s se rceasc pn cnd presiunea din interior
ajunge la nivelul presiunii atmosferice

deschidem lent robinetul de vapori

deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului

lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul

deschis

atunci cnd temperatura ajunge la circa 80C putem scoate

materialele sterilizate.

Prin autoclavare putem steriliza diferite substane n soluie,

sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), materiale contaminate
din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau
bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc.

2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare

prin cldur umed care evit depirea unei temperaturi de 100C.
Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60
minute, 3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit
germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt distruse
formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n
ziua urmtoare sunt distruse prin nclzire formele vegetative
rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea
sporilor care nu au germinat n prima zi etc.

Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va

menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va
depi n interior temperatura de 100 C), bi de ap sau bi de
nisip.

Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc.

Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar

sunt utilizate n anumite situaii. Pasteurizarea folosete cldura
umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor
alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la
56-65C), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75C) i o
pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt
distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii. Fierberea
poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente
de sterilizare. Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile n
form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni.
Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena
acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de
sodiu 1-2%.

Sterilizarea prin filtrare

Microorganismele pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui

filtru. Trecerea unui lichid printr-o substan prevzut cu pori care
va reine microorganismele din lichidul respectiv poart numele de
sterilizare prin filtrare.

De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice

(porelan, sticl poroas, azbest impregnat cu caolin, pmnt de
infuzori). Actualmente se folosesc din ce n ce mai frecvent
membrane filtrante din acetat de celuloz cu poroziti ntre 8 i
0,025 mm. n vederea filtrrii sunt necesare o serie de piese precum:
un recipient n care se introduce lichidul care urmeaz a fi filtrat, un
recipient n care se va colecta lichidul sterilizat, o plnie care se
monteaz etan ntre cele 2 recipiente, o pomp de vid care va
aspira lichidul din primul n al doilea recipient, prin membrana
filtrant. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare nainte
de nceperea filtrrii.

Exist i alte variante tehnice. Cu o importan practic particular

ar fi de menionat filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele
de siguran biologic (clasa II i clasa III), filtrele HEPA (High
Efficiency Particulate Air Filters).

Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea

aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot steriliza prin
autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile
atinse n cazul sterilizrii prin cldur etc.

Sterilizarea prin intermediul radiaiilor

Radiaiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte

bactericide prin ruperea legturilor de hidrogen, oxidarea legturilor
duble etc.

Radiaiile UV sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru (pentru

repartizarea mediilor de cultur, alte manevre aseptice etc) n cazul
n care nu exist cabinete de siguran biologic cu flux laminar.
Lmpile cu UV sunt numite lmpi germicide.

Radiaiile ionizante se pot utiliza n sterilizri industriale (pentru

alimente, medicamente, seringi de unic ntrebuinare etc).

Antisepsia i Dezinfecia
Antisepticele i dezinfectantele sunt substane cu aciune
antimicrobian neselectiv, alternd structuri i funcii comune
microorganismelor i organismelor superioare. Antisepticele pot fi
utilizate pe tegumente i mucoase, dezinfectantele pot fi utilizate
numai pe suprafee i structuri care nu sunt vii.

Clasificare n funcie de mecanismul de aciune

a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect

bactericid): acizii, bazele, alcoolii (de exemplu alcoolul etilic de 70,
folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).

b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor

(de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu 1 , util n
antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, soluie 3 % n ap,
utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii
lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc) n concentraii
corespunztoare etc.

c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor

(de exemplu, SH): metale grele [srurile de mercur, preparatele
organomercuriale (exemplu merthiolat de sodiu), srurile de argint,
compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte
bactericide], gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei,
oxidului de etilen etc.

d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic

are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale;
este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a
antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii,
hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc],
detergenii [anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri
cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de
exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu
propilenglicolul)].

e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet

de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de
acridin, de exemplu rivanolul.

n continuare vom prezenta pe scurt cteva dintre substanele

dezinfectante, innd cont de faptul c nu exist nici un dezinfectant
ideal. Exist numeroase substane i numeroi productori de
antiseptice i dezinfectante.

Hipocloriii:
 soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup
mai mult de 24 ore)

concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul

urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru dezinfectarea pipetelor
contaminate)

au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ,

sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm n o or), virusurilor (200 ppm
n 10 minute)

efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor

organice (n special proteine), maselor plastice, detergenilor

Derivaii fenolici:

datorita toxicitii, potenialului carcinogenetic i corozivitii,

fenolii nu se folosesc ca atare, ci sub forma derivailor fenolici

soluiile fenolice se prepar periodic (dup cel mult 24 ore)

concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de

obicei este de 2-5%)

au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ,

fungilor, unor virusuri (ex. HIV e inactivat de soluia 0.5%)

efectul este diminuat pe suprafeele de cauciuc, lemn sau

material plastic

Glutaraldehida:

cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2%, la un pH

alcalin

are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ

(n cazul mycobacteriilor este necesar un timp mai lung de
expunere), fungilor, virusurilor

datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se

ntmpl n cazul substanelor prezentate mai sus) se poate folosi i
la dezinfectarea suprafeelor metalice

nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani

i timpului mare de expunere; ideal pentru dezinfectarea
echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare
de timp n containere meninute nchise

Iodoforii:
 sunt substane care complexeaz iodul pe care l elibereaz n
soluii apoase

au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ,

unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu nveli
lipidic)

sunt inactivai de substane organice (n special proteice),

mase plastice, detergeni

pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia

pipetelor contaminate.

Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):

exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i

prin nlocuirea hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-
CH2CH2OH)

sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui

acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu

rezist atunci cnd sunt supuse aciunii temperaturii sau radiaiilor
(ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc)

etilenoxidul poate exploda; variantele pentru evitarea

exploziei includ: 1. utilizarea etilenoxidului n camere speciale care
permit meninerea unei presiuni negative 2. combinarea cu CO2 n
camere de oel speciale 3. combinarea cu hidrocarburi fluorinate

indiferent de varianta folosit trebuie respectate toate

recomandrile productorului.

exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de

sterilizare (efecte carcinogenetice, efecte la nivelul sistemului
nervos etc)

sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia

etilenoxidului, temperatur, umiditatea relativ i timpul de
expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la jumtate
timpul necesar pentru sterilizare).

5. Schema general a diagnosticului microbiologic

Diagnosticul de laborator n microbiologie poate fi un diagnostic
bacteriologic sau micologic (direct), un diagnostic imunologic
(indirect) sau o combinaie a celor dou variante menionate. Aa
cum am menionat, n continuare dorim s prezentm etapele
principale ale diagnosticului microbiologic (bacteriologic, micologic,
imunologic), structur pe care urmeaz s discutm, concret,
diferite situaii n cadrul capitolelor care urmeaz. n anexe, atunci
cnd vom discuta recoltarea i transportul produselor, vom sintetiza
pentru unele dintre aceste produse situaiile posibile n momentul n
care nu avem n fa un anumit gen sau o anumit specie ci
produsul din care vom izola agentul etiologic, iniial presupus.

5. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic

Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe

etape, i anume:

1. Recoltarea i transportul produsului patologic (ct mai aproape de

debutul bolii, nainte ca pacientului s i se fi administrat antibiotice
sau chimioterapice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al
tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i
antisepsie, prelevnd un anumit produs patologic n funcie de
manifestarea clinic n cazul respectiv, de exemplu urin n cazul
unei infecii urinare, materii fecale n cazul dizenteriei, sput n
cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame n cazul unei micoze
cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6).

2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului patologic

reprezint de multe ori o etap esenial, care poate orienta paii
urmtori.

Pentru examenul microscopic se vor realiza minim dou frotiuri din

produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor
colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram. Este
preferabil s avem ntotdeauna cel puin nc un frotiu (de rezerv),
n special n cazul n care produsul patologic este preios (LCR,
produs recoltat prin puncie-biopsie etc). n cazul suspicionrii unei
infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui al treilea
frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examineaz la
microscopul optic, iniial cu obiectivul 40 pentru o analiz mai
general, pentru stabilirea cmpului microscopic sau al zonei de
interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se noteaz prezena
diferitelor celule (eventual modificate fa de normal, burate de
microorganisme), prezena celulelor inflamatorii (dovada reactivitii
organismului, ex. leucocite, surprinznd eventual fenomenul de
fagocitoz), precum i eventuala prezen a microorganismelor
(bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretat cu
precauie, n contextul dat. Chiar dac examenul microscopic este de
cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare
dat, cu rigurozitate, n anumite situaii putnd fi foarte important i
foarte util.

Atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau

materii fecale, de regul nu se realizeaz frotiuri fixate i colorate.
Spre exemplu, n cazul materiilor fecale, se va face o
coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel,
cutndu-se n special prezena leucocitelor (dar i a unor structuri
care pot da anumite informaii cu privire la funcionalitatea tractului
digestiv). n cazul suspicionrii unei infecii urinare, se va realiza un
sediment urinar (dup centrifugarea urinei), care se va examina
ntre lam i lamel n vederea aprecierii numrului de leucocite pe
cmp microscopic, n cazul n care acestea exist, n vederea
aprecierii prezenei unor cilindrii leucocitari precum i a altor celule
normale sau patologice, a prezenei unor elemente fungice etc., date
care pot fi deosebit de utile n vederea unui diagnostic corect i util
pentru pacient.

n cazul suspicionrii unei infecii micotice sunt utile att

preparatele proaspete (ex. preparatul montat n soluie de KOH-
glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraii negative (tu de India,
nigrozin), precum i frotiurile colorate May-Grnwald-Giemsa sau
Gram.

3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se va face n

funcie de situaie (mediile i condiiile de incubare se vor alege n
funcie de presupusul microorganism pe care trebuie s-l izolm;
spre ex. n cazul n care infecia este produs de microorganisme
strict anaerobe, n lipsa condiiilor anaerobe de cultivare este
imposibil izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate
mediile potrivite i o temperatur mai mic dect cea utilizat n
cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza n aa fel nct s se poat
obine colonii izolate (tehnica nsmnrii n poligon) i respectiv
o cultur pur, care se va identifica.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza

pe baza mai multor caractere:

a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolat,

frotiu care se va fixa i colora Gram sau Ziehl-Neelsen, dup caz, i
se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor
evidenia numai microorganisme cu form i tinctorialitate similar
(n cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus spp., pe
frotiu vom observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte
cocobacilare pn la forme filamentoase). n cazul levurilor, aspectul
este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari.

b) Caractere de cultur: se vor examina coloniile izolate aprute pe

mediile de cultur solide i care pot fi de tip S pentru majoritatea
germenilor studiai inclusiv pentru levuri, de tip R n cazul
Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis i Bacillus
anthracis, de tip M n cazul bacteriilor capsulate, de exemplu
Klebsiella pneumoniae i respectiv un aspect pufos n cazul
mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt
prezentate n capitolele dedicate fiecrui gen n parte).

c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie

microbian la alta i pot fi foarte utile spre exemplu n cazul
diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a mediilor
multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex.
mediile TSI, MIU, sistemele API etc). n cazul fungilor sunt utilizate
auxanograma sau zimograma.

d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate

bazndu-ne pe structura i antigenicitatea microorganismelor i pe
specificitatea reaciilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi
cunoscui pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute.
Spre exemplu, prin reacii de aglutinare direct, pe lam, se pot
identifica antigenele i respectiv speciile i tulpinile din genul
Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacii de aglutinare indirect se
pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B
etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor
fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.)
etc.

e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui

microorganism de a elabora anumite substane cu rol n
patogenitate (ex. coagulaza produs de Staphylococcus aureus) sau
infecia experimental a unui animal de laborator (ex. izolarea
pneumococilor de la un pacient cu pneumonie dup inocularea
sputei la oarecele alb; n cazul n care n sput exist pneumococi,
animalul va muri n 24-48 de ore, iar din sngele lui se va izola o
cultur pur de Streptococcus pneumoniae).

f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);

g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei
moleculare sau alte metode moderne) (vezi anexa nr. 7).

5. Antibiograma i respectiv antifungigrama (testarea sensibilitii la

antibiotice i chimioterapice antibacteriene i antifungice, n
vederea stabilirii tratamentului) se realizeaz de obicei prin metode
difuzimetrice. n cazul unor infecii grave, antibiograma
difuzimetric trebuie s fie completat de determinarea
concentraiei minime inhibitorii (CMI) i respectiv bactericide (CMB).
n infecii grave, cu potenial fatal, poate fi necesar determinarea
nivelului de eficien pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea
nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien
bactericid (NEB) (vezi i capitolul 7).

5. 2. Diagnosticul de laborator imunologic

Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic i / sau

imunobiologic.

n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina

prezena (sau se va dovedi absena) anticorpilor, n serul pacientului
investigat, utiliznd antigene cunoscute. n diagnosticul serologic ne
bazm pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp i utiliznd
diferite tehnici trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri
eseniale, i anume:

- exist anticorpi n serul pacientului investigat?

- care este titrul anticorpilor?

- cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru; n acest sens se

vor realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10
zile; aceast analiz ne va permite s difereniem situaia unei
afeciuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua
determinare, n mod clasic de 4 ori), de situaia n care pacientul
este deja n convalescen (titrul anticorpilor la a doua determinare
va fi mai sczut) sau de situaia unui pacient cu o afeciune cronic
(titrul anticorpilor va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou
determinri succesive). n vederea identificrii unei infecii acute, o
variant posibil n majoritatea situaiilor este determinarea
anticorpilor specifici de tip IgM.

n cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de

exemplu, reactivitatea pacientului fa de un anumit antigen
inoculat. Intradermoreacia la tuberculin (PPD, preparat proteic
purificat) sau la candidin reprezint exemple clasice, n acest sens.
Tehnica intradermoreaciei este folosit n mai multe scopuri i
trebuie s avem n vedere c n funcie de scopul urmrit i respectiv
n funcie de antigenul inoculat (i de mecanismul implicat), modul
de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3).

Considerm c pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe

dintre principiile microbiologiei sunt foarte utile, merit s fie
nelese i aplicate corespunztor.

Pentru cei care se dedic microbiologiei sau bolilor infecioase,

aceste noiuni reprezint o baz obligatorie, care poate fi
completat utiliznd pe de o parte diferitele tratate medicale n
domeniu dar i experiena personal dezvoltat att din punct de
vedere teoretic ct i practic.

6. Norme privind prelevarea i transportul produselor patologice n

diagnosticul microbiologic direct

n schema general a diagnosticului microbiologic direct, fie c

diagnosticul se adreseaz unei infecii bacteriene, fie uneia fungice,
recoltarea (prelevarea) i transportul produsului patologic
reprezint o etap esenial. De altfel aceast afirmaie este perfect
valabil i n diagnosticul virusologic sau parazitologic. Utilizm
termenul de produs patologic n relativ exces, adic de regul
recoltm un anumit produs care este potenial patologic; faptul c
este patologic l vom dovedi (sau infirma) n cursul diagnosticului de
laborator. Pentru a simplifica modul de exprimare, vom accepta
utilizarea acestor termeni ca atare.

Prelevarea i transportul produsului patologic (p.p.) efectuate

corespunztor va permite realizarea etapelor urmtoare de
diagnostic, culminnd cu stabilirea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice a microorganismului implicat patogenic n infecia
dovedit la un pacient anume (nu exist boli, ci bolnavi).

Reguli privind recoltarea produselor patologice

Se cunosc o serie de reguli care trebuie respectate cu strictee n

cursul acestei etape:

este recomandabil ca recoltarea i stabilirea modalitii de

transport a p.p. s fie fcut de medic sau sub ndrumarea unui
medic de specialitate
 prelevarea p.p. trebuie s aib loc nainte ca pacientul s fi
primit antibiotice sau chimioterapice

acest deziderat este ndeplit din ce n ce mai rar ceea ce

creaz multe probleme n diagnosticul microbiologic contribuind i
la selectarea microorganismelor rezistente la medicamentele
antimicrobiene

eforturile privind ndeplinirea lui trebuie s aparin att

pacientului ct i medicilor implicai (medic de familie, medic de alt
specialitate)

chiar dac boala este grav iar tratamentul antibiotic pare

urgent, trebuie reinut c pentru recoltarea p.p. care poate duce la
un diagnostic care ar putea salva viaa pacientului sunt necesare
numai cteva minute; dup recoltarea p.p. se poate administra
prima doz de antibiotic sau chimioterapic, ales empiric, pe criterii
de probabilitate

n cazul n care evoluia sub tratament antibiotic este

nefavorabil, diagnosticul microbiologic va permite (ntre timp)
izolarea agentului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice astfel nct schimbarea tratamentului se va putea
face n mod riguros, tiinific

alternativele sunt reprezentate de schimbarea

tratamentului n mod mai puin raional sau chiar iraional, cu
posibile urmri nefaste pentru pacient sau apelarea la cocteil-ul
(asocieri) de antibiotice cu riscurile de rigoare

n cazul n care (dintr-un motiv sau altul) tratamentul cu

antibiotice a fost nceput nainte de prezentarea la spital / laborator,
n funcie de boala suspectat se pot recomanda urmtoarele
abordri

oprirea, dac este posibil, tratamentului pentru 24 - 48 ore, cu

recoltarea p.p. i nceperea diagnosticului microbiologic

recoltarea p.p. imediat nainte de urmtoarea doz de

antibiotic

ncercarea de antagonizare a efectului antibioticului, n

mediul de cultur (ex. cu sulfat de magneziu n cazul n care s-au
administrat tetracicline)

diluarea inoculului (mai ales dac pacientul a primit un

tratament bacteriostatic) n mediul de cultur fr antibiotic
 notificarea n formularul n care se solicit analiza de laborator
i care nsoete p.p. precum i n buletinul de analiz, a tuturor
datelor privitoare la tratamentul primit de ctre pacientul investigat

recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze ct mai

aproape de debutul bolii, dar trebuie ales momentul cel mai potrivit
(optim), respectiv momentul n care este cea mai mare probabilitate
ca agentul etiologic s se gseasc n produs

n funcie de evoluia bolii (de ex. coprocultura n febra tifoid

se va efectua dup prima sptmn de evoluie)

n funcie de specificul fiziopatologic al bolii respective (de ex.

se recomand efectuarea hemoculturii n accesul febril)

produsul patologic din care estimm c vom putea izola

agentul etiologic al bolii suspicionate va fi ales n funcie de maladie
i va putea fi reprezentat spre exemplu de

o secreie de la nivelul presupusei pori de intrare (ex.

secreie nazal sau faringian n difterie, secreie genital n cazul
unei boli veneriene etc)

un produs de la nivelul cilor de rspndire n organism (ex.

snge, esut recoltat prin biopsie de la nivelul ganglionilor limfatici)

un produs de la nivelul cilor de eliminare din organism (ex.

urin n infeciile tractului urinar, materii fecale ntr-o boal diareic
acut etc)

un produs de la nivelul focarului infecios (ex. lichid cefalo-

rahidian / LCR n meningit, sput n pneumonie etc)

n vederea alegerii produsului care urmeaz a fi recoltat este

necesar cunoaterea patogeniei, evoluiei i elementelor clinice
legate de bolile infecioase, ceea ce este esenial n cazul practicrii
cu adevrat a microbiologiei clinice

periodicitatea cu care se realizeaz recoltarea de p.p. poate

influena rezultatul n anumite cazuri, spre exemplu

n suspicionarea unui sepsis (denumirea acceptat actual

pentru septicemie) se recomand recoltarea a 2-3 probe de snge n
24 ore, pentru hemocultur

n suspicionarea unei boli diareice acute se recomand

recoltarea a cte unei probe de materii fecale, trei zile consecutiv,
pentru coprocultur
 n suspicionarea unei tuberculoze pulmonare se recomand
recoltarea a cte unei probe de sput, trei zile consecutiv etc

ceea ce a fost prelevat i transmis pentru examinare trebuie

s reprezinte cu adevrat p.p. (acel produs care conine cu mare
probabililtate microorganismul infectant), spre exemplu

n cazul n care este suspicionat diagnosticul de meningit i a

fost recoltat LCR, n cazul n care meningita este de etiologie
bacterian sau fungic, microorganismul implicat patogenic va putea
fi identificat n cursul diagnosticului microbiologic

n schimb, dac n cazul n care este suspicionat tuberculoza

pulmonar se vor trimite spre examinare saliv sau secreii de la
nivelul arborelului respirator superior n loc de sput, diagnosticul
microbiologic este imposibil etc

din p.p. se vor preleva i utiliza n cursul diagnosticului

microbiologic poriunile cele mai reprezentative, respectiv acele
poriuni n care sunt cele mai mari anse de identificare / vizualizare
prin microscopie / cultivare i izolare a microorganismului infectant,
spre exemplu n cazul recoltrii de materii fecale (suspiciune de
boal diareic acut) se vor selecta poriunile muco-purulente
(eventual muco-sanguinolente)

este necesar s se recolteze o cantitate de p.p. suficient

pentru efectuarea diagnosticului microbiologic (preparate
proaspete, frotiuri, cultivri pe medii de cultur, inoculri la animale
de experien, reluarea unor manevre n cazul c este necesar

recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze n condiii

stricte de asepsie, pentru prevenirea contaminrii celui care
recolteaz, pentru prevenirea supra-infectrii pacientului i pentru
prevenirea contaminrii p.p.

se vor respecta precauiunile universale privind prevenirea

contaminrii n unitile sanitare

se va evita, pe ct posibil, contaminarea p.p. cu

microorganisme care aparin florei microbiene normale (spre ex. prin
tehnica de recoltare / vezi recoltarea urinei sau prin manevre
invazive care unteaz cile naturale prin care sunt eliminate
microorganismele / vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar)

se vor utiliza instrumente sterile i recipiente (containere /

recoltoare) sterile.
Regulile prezentate mai sus reprezint elemente fundamentale n
vederea obinerii unui diagnostic corect i, dup opinia noastr,
trebuie cunoscute de orice persoan implicat n actul medical,
inclusiv de studenii la medicin, chiar dac nu vor alege pentru
viitor pregtirea n domeniul medicinei de laborator sau n domeniul
bolilor infecioase.

nainte de a ncheia aceast parte a capitolului privind normele

privind recoltarea i transportul p.p. n diagnosticul microbiologic
direct dorim s subliniem cteva aspecte care nu trebuie s fie
neglijate, dup cum urmeaz:

instrumentele pentru recoltare trebuie s fie nu numai sterile

dar i adecvate, de ex. foarte frecvent este utilizat tamponul de
vat, ns recoltarea cu tampon ar trebui s fie recomandat doar
recoltrii i transportului p.p. = secreie de la suprafaa mucoaselor
i tegumentelor cu leziuni

vata poate conine substane inhibitoare pentru

microorganisme

cantitatea de p.p. recoltabil este mic

microorganismele i leucocitele rmn n proporie mare pe

vat i nu pot fi uor transferate pe frotiu, mediu de cultur

pentru anumite microorganisme (ex. Bordetella pertussis)

utilizarea tamponului cu vat este contraindicat

recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie nti

curate (dar prin cltire s fie eliminate orice substane chimice cu
posibil efect antimicrobian) i apoi sterilizate, preferabil prin
autoclavare; nchiderea recipientelor trebuie s fie perfect, pentru
a preveni orice contaminare pe parcursul transportului

recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie

marcate corespunztor n aa fel nct s nu fie posibil apariia
unor confuzii; ceea ce se noteaz pe recipient trebuie s corespund
cu ceea ce a fost notat pe formularul de solicitare a respectivei
analize

datele de identificare i alte date semnificatice vor fi trecute

n urmtoarele documente

registrul unitii sanitare / seciei / clinicii care solicit analiza

respectiv (n cazul n care recoltarea produsului patologic se face n
afara laboratorului)
 formularul prin care se solicit analiza microbiologic

registrul de lucru al laboratorului

formularul prin care se anun rezultatul analizei (buletinul de

analiz)

pentru simplificare, un singur formular poate include att

partea corespunztoarea solicitrii analizei ct i buletinul de
analiz microbiologic

o alt modalitate de simplificare ar putea fi reprezentat de

nregistrarea electronic a datelor i utilizarea metodelor moderne
de transmitere a lor; exist doar cteva uniti sanitare n Romnia
unde sunt utilizate aceste metode

pentru reducerea cantitii de date i respectiv asigurarea

confidenialitii, se recurge la numrul unic de identificare, un
grup de cifre i litere care permit codificarea i asocierea a cte unui
astfel de numr fiecrui pacient n parte

cu toate c nregistrarea datelor pare pentru majoritatea celor

implicai n actul medical o simpl i inutil birocraie, aceast
modalitate de apreciere este complet eronat; nregistrarea datelor
i fluxul informaiilor n sistemul sanitar sunt extrem de importante
i este necesar s fie depuse toate eforturile n vederea efecturii
lor n mod corespunztor (din pcate orele de studiu dedicate
acestor aspecte sunt mult prea reduse att pe parcursul studeniei
ct i n cursul rezideniatului)

elemente importante care trebuie notificate atunci cnd se

solicit o analiz de laborator microbiologic

pentru identificarea produsului patologic care urmeaz a fi

prelucrat se vor nota numele, prenumele, vrsta pacientului (sau
numrul unic de identificare), data i locul recoltrii (unitate
sanitar, clinica, secia, salonul)

pentru facilitarea alegerii celei mai potrivite modaliti pentru

prelucrarea p.p. se vor nota diagnosticul prezumtiv, natura p.p.,
examenul solicitat, data debutului bolii, ce medicaie antimicrobian
a fost administrat respectivului pacient (antibiotic sau asociere de
antibiotice, data nceperii administrrii, doze, durat)

n acelai sens se vor nota data i ora recoltrii, data i ora

recepionrii n laborator, cine i cum a fcut recoltarea, cum a fost
asigurat transportul p.p.
 subliniem faptul c, cel mai adesea venim n contact cu
formulare incomplete / completate indescifrabil / completate cu erori
i chiar dac ar putea prea incredibil, formulri de genul nume X,
prenume Y, prob Z, rugm toat bateria de analize sunt nc mult
prea frecvente i ar trebui ca de fiecare dat s conduc la o discuie
ferm cu expeditorul pn cnd asemenea comportamente vor fi
eliminate, n beneficiul pacienilor.

Motive pentru care un p.p. ar putea fi respins de la analiza

microbiologic

Respingerea p.p. ar trebui s reprezinte o excepie n activitatea

unui laborator de analize medicale, dar exist anumite motive care
pot conduce la aceast decizie. nainte de a prezenta cteva
exemple n acest sens dorim s subliniem faptul c activitatea
medical se desfoar ntr-un sistem n care exist mai multe verigi
care trebuie s funcioneze perfect (fiecare n parte) iar ntre
verigile sistemului ar trebui s existe o perfect colaborare.

n vederea stabilirii diagnosticului i tratamentului corespunztor n

cazul unui pacient care prezint o anumit boal transmisibil
(infecioas) nu exist o subordonare ci o corelare a activitilor.
Att laboratorul ct i clinica au de ndeplinit funcii foarte
importante, uneori decisive pentru viaa pacientului.

Pentru ca n situaiile limit funcionarea s fie perfect este

necesar un continuu antrenament att din punct de vedere teoretic
i tehnic dar i n ceea ce privete colaborarea dintre parteneri.
Respingerea unui p.p. i solicitarea de ctre laborator a recoltrii
unui nou p.p. de calitate, care s permit stabilirea diagnosticului
microbiologic, trebuie nelese ca un gest normal atunci cnd
anumite reguli de recoltare i transport sunt neglijate.

n anumite situaii, chiar dac sunt sesizate diferite

disfuncionaliti n ceea ce privete modul n care p.p. a fost
recoltat i transportat ctre laborator, problemele pot fi rezolvate
prin telefon sau o discuie direct, spre exemplu n vederea
identificrii unui p.p. care a fost recepionat fr datele de
identificare. ns, n cazul n care aceast discuie nu poate conduce
la stabilirea identitii p.p., respectiva prob nu trebuie prelucrat n
laborator.

n cazul n care p.p. a fost identificat dar este necorespunztor din

punct de vedere calitativ, prelucrarea acestuia ar trebui temporizat
(p.p. meninut la +4C) pn n momentul n care se ia legtura cu
medicul care a solicitat analiza i se analizeaz dac recoltarea ar
putea fi repetat i urmat de trimiterea unui p.p.corespunztor. n
cazul n care o nou recoltare este posibil primul p.p. se
ndeprteaz i se va prelucra al doilea. n cazul n care nu este
posibil o nou recoltare i se estimeaz c prelucrarea p.p. chiar
necorespunztor poate aduce vreun beneficiu pacientului examinat,
se ncearc obinerea datelor care pot fi obinute (cu rezervele de
rigoare care vor fi menionate n buletinul de analiz).

Iat cteva motive de respingere a unui produs patologic:

sput recoltat pe parcursul a 24 de ore

sput care de fapt conine saliv i secreii din tractul

respirator superior

urin recoltat cu mai mult de 60 de minute n urm (care nu a

fost meninut la +4C)

exsudat faringian, exsudat nazal, sput, urin, materii fecale

etc pentru care se solicit izolarea i identificarea germenilor
anaerobi

produse patologice pentru care este evident contaminarea

(de ex. datorit unui recipient de colectare necorespuztor) etc.

Transportul produselor patologice

n ceea ce privete transportul produselor patologice este

semnificativ propoziia urmtoare: produsele patologice trebuie s
ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil. Fa de aceast
recomandare cu caracter general, ar fi de discutat o serie de aspecte
concrete.

Transportul ct mai rapid / sau prelucrarea imediat a unui p.p.

recoltat chiar la nivelul laboratorului sunt recomandate ferm
datorit urmtoarelor considerente:

este necesar meninerea condiiei iniiale a produsului

patologic (coninut microbian, citologie etc) pentru a putea
nregistra o imagine ct mai apropiat de ceea existent la nivelul
procesului infecios

diferitele microorganisme au diferite temperaturi optime

pentru supravieuire

celelalte condiii necesare supravieuirii microorganismelor

difer n funcie de fiecare grup de microorganisme n parte (pH,
deshidratare, radiaii UV sau radiaii solare n general, prezena
oxigenului, prezena substanelor antimicrobiene, fenomene de
autoliz etc)

microorganismele din flora asociat se pot multiplica n cursul

transportului (de regul mai lesne dect microorganismele
patogene)

utilizarea mediilor de transport modific aspectul citologic al

p.p.

este necesar prevenirea contaminrii p.p. precum i

prevenirea contaminrii mediului extern sau a personalului care
asigur recoltarea, transportul i ulterior prelucrarea p.p.

n anumite situaii (rezistena microorganismului n mediul

exterior este deosebit de redus) se va recomanda recoltarea i
prelucrarea p.p. la patul bolnavului sau, dac este posibil,
pacientul va fi invitat n laborator pentru recoltare

pentru foarte multe dintre p.p. se poate accepta un timp de

transport de 1-2 ore (repetm propoziia de mai sus: p.p. trebuie s
ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil)

n cazul n care timpul de transport al p.p. nu poate respecta

ceea ce este indicat se poate recurge la conservarea acestuia
dup cum urmeaz

meninerea la temperatur sczut (container izoterm cu

ghea la 0C sau frigider la +4C); de menionat c Neisseria
meningitidis, Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzae etc nu
rezist la aceste temperaturi

utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair, Stuart etc / vezi

capitolul 9)

adugarea de penicilin, streptomicin i cloramfenicol atunci

cnd se urmrete izolarea unui fung (agenii etiologici ai micozelor
cutanate superficiale pot rezista mpachetate n hrtie steril i
introduse ntr-o cutie Petri pn la 48 de ore fr s necesite
adugarea de antibiotice)

aspirarea p.p. lichid n sering, cu eliminarea rapid a bulelor

de aer i nchiderea seringii cu ajutorul unui dop de cauciuc steril
n care introducem imediat acul (atenie la manevrarea acului de
sering n condiiile recoltrii unui produs patologic uman / risc de
nepare i transmiterea altor infecii ex. HIV) atunci cnd urmrim
izolarea unei bacterii anaerobe care ar putea supravieui n acest caz
circa 30 de minute etc

transportul ctre laborator se va realiza

numai de ctre un curier instruit n acest scop

n recipiente etane pe care se va lipi pictograma pentru risc

microbiologic

iar n cazul n care p.p. trebuie expediat prin pot se vor

respecta normativele legale n vigoare precum i recomandrile
speciale recunoscute la nivel internaional dintre care cele mai
utilizate sunt elaborate de World Health Organization (WHO), Center
for Diseases Control and Prevention (CDC) sau National Committee
for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) cu meniunea c primele 2
pot fi obinute n mod gratuit.

Exemple de recoltare i transport pentru cteva produse patologice

1. Exsudate otice sau nazale

pacientul st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin

(preferabil lumina natural)

utilizm tampoane cu vat obinuite uor umezite cu soluie

salin fiziologic steril, ceva mai mici dect n cazul recoltrii
exsudatului faringian

un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct

un tampon va fi utilizat pentru nsmnare pe medii de

cultur

n cazul suspicionrii difteriei se vor utiliza 3 tampoane

tamponul trebuie ncrcat ct mai bine cu p.p. (l rotim relativ

ferm pe suprafeele unde este prezent p.p.)

este de preferat utilizarea imediat a p.p. iar n cazul n care

acest lucru nu este posibil, tamponul va fi trimis ctre laborator n
mediu de transport

2. Exsudatul faringian

se recolteaz preferabil dimineaa nainte ca pacientul s

mnnce i fr s se fi splat pe dini, fr s fi utilizat gargarisme
cu diferite soluii (iar dac aceste condiii nu au fost respectate,
recoltarea se va face dup minim 4 ore)
 pacientul st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin i gtul n
uoar extensie

ne aezm puin lateral fa de pacient pentru a evita

contaminarea cu picturi eliminate n cursul unui eventual acces de
tuse (de preferin vom purta masc i ochelari)

deprimm baza limbii cu ajutorul unui apstor de limb steril

i n condiii de iluminare adecvat examinm faringele posterior,
pilierii, amigdalele pentru a sesiza care sunt zonele inflamate (roii,
cu depozite, ulceraii etc) i eventualele depozite purulente

utilizm utilizm tampoane cu vat obinuite

un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct

un tampon va fi utilizat pentru nsmnare pe medii de

cultur

n cazul suspicionrii difteriei se vor utiliza 3 tampoane

solicitm pacientului s pronune vocala A i printr-o

micare de tergere, circular, ferm, recoltm secreia de la nivel
faringian, amigdalian insistnd n zonele unde exist ulceraii,
depozite (n cazul n care se remarc prezena unei false membrane
o detam cu grij nspre periferie i recoltm secreia care exist
sub aceast structur)

trebuie s evitm atingerea bazei limbii sau a palatului moale

este de preferat utilizarea imediat a p.p., sau n cel mult 1-3

ore; n cazul n care acest lucru nu este posibil, tamponul va fi trimis
ctre laborator n mediu de transport

3. Sputa

n diagnosticul microbiologic al infeciilor acute ale cilor

respiratorii inferioare (IACRI) se pot examina

prelevate care se pot contamina n cursul recoltrii cu flora

bacterian normal: sput, tampon nazal / faringian, aspirat nazal /
faringian, aspirat hipofaringian, produs recoltat prin bronhoscopie
simpl etc i / sau

prelevate care permit evitarea contaminrii orofaringiane:

aspirat transtraheal, aspirat transtoracic, aspirat bronhoscopic prin
cateter protejat cu canule telescopate / lavaj bronhoalveolar, biopsie
transbronic, biopsie pulmonar pe torace deschis, aspirat pleural,
hemoculturi

cu toate c este contaminat cu flora normal orofaringian,

sputa reprezint produsul patologic recoltat cel mai frecvent, n
majoritatea IACRI. Se pot obine probe calitativ corespunztoare n
momentul n care pacientul se prezint n unitatea sanitar (este
recomandabil s se recolteze prima sput eliminat matinal i n nici
un caz sputa din 24 de ore). Pacientul trebuie s neleag diferena
dintre "a expectora" i "a tui i scuipa".

naintea prelevrii se recomand periajul simplu al dinilor,

cltirea energic a gurii i gargara cu ap (sau cu soluie salin
fiziologic)

dac proba apare constituit n principal din saliv, trebuie s

solicitm imediat pentru prelevarea unei noi probe care s permit
ulterior definitivarea diagnosticului. n IACRI o prob mucopurulent
n volum de 2-3 ml ar putea fi suficient.

stimularea expectoraiei prin inhalarea de aerosoli calzi cu

soluie salin (3%) ofer, de regul, probe citologic nesatisfctoare
(sputa indus ar putea fi util n izolarea Pneumocystis carinii). n
cazul n care se presupune o infecie mycobacterian sau fungic
este recomandat recoltarea i prelucrarea a 3 produse, n 3 zile
consecutive.

splarea sputei intens mucopurulente (n 3 bi succesive de

soluie salin izoton) reduce contaminarea orofaringian fr a
influena semnificativ concentraia bacteriei infectante prins n
trama fibrinoas a probei. Fluidifierea (de ex. cu N-acetil-L-cistein)
permite omogenizarea produselor patologice; se realizeaz n cteva
minute.

n cazul suspicionrii unei infecii fungice, probele fluide se

concentreaz prin centrifugare 20 de minute la 3000 rot/min., apoi
se examineaz sedimentul. Din probele bioptice se disec mici
fragmente suspecte cu volume de circa 1 mm care sunt apoi
examinate la stereomicroscop (mrire 30). esutul cazeos, fibros i
grsimea ascund n mod frecvent hifele iar tratarea cu KOH nu
clarific preparatul fiind necesar disocierea i omogenizarea probei.

produsele patologice recoltate pentru diagnosticul

microbiologic trebuie transmise prompt ctre laborator (preferabil n
maxim 1 or, acceptabil n 1-2 ore)

produsele recoltate ntr-un recoltor steril de 50-200 ml, cu

capac care permite o nchidere etan, sunt etichetate i expediate
imediat la laborator pentru a fi examinate. Nu exist modaliti
optime de conservare a probelor. Meninerea la o temperatur de
4C previne multiplicarea contaminanilor, conserv unii patogeni,
dar scade pn la anulare ansa de izolarea a altora (ex. H.
influenzae, N. meningitidis).

utilizarea unui mediu de transport perturb raportul dintre

bacterii i reperele citologice ale probei, eseniale pentru apreciare
calitii probei i interpretarea rezultatelor sputoculturii, dar n
cazul n care se apreciaz c se va depi timpul de transport
recomandat se poate utiliza mediul Stuart sau Amies. n cazul n care
se urmrete, spre exemplu, izolarea M. pneumoniae, cultivarea
trebuie fcut ct mai rapid; produsul patologic poate fi conservat
maxim 4 ore n lipsa unui mediu special i pn la maxim 24 de ore
dac se utilizeaz mediul de transport pentru molicute. n cazul n
care ar fi necesar o conservare prelungit, este necesar utilizarea
unei temperaturi de 70C (n nici un caz temperatura congelatorului
obinuit).

4. Puroiul

exist numeroase condiii clinice n care apar supuraii

(superficiale sau profunde) iar tehnica de recoltare variaz n funcie
de originea puroiului (arsuri i plgi suprainfectate, abcese,
flegmoane, fistule etc)

este recomandat ca pentru recoltare s folosim tampoane cu

vat sterile numai n cazul n care nu avem o alt soluie

puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologic, pipeta Pasteur,

prin biopsiere, chiuretare sau, atunci cnd este vorba de colecii
profunde, prin puncie i aspirare

n special pentru situaiile n care vom recolta p.p. dintr-o

colecie profund, colaborarea ntre clinic i laborator trebuie s fie
foarte bun

atunci cnd suspicionm o infecie cu microorganisme

anaerobe sunt necesare pregtiri speciale i cel puin utilizarea
seringii care se nchide cu dop (vezi mai sus); exist germeni
anaeobi care pot fi distrui n cteva secunde de contact cu oxigenul

transportul ctre laborator se va realiza utiliznd medii de

transport sau containere speciale (pentru asigurarea anaerobiozei);
p.p. trebuie s fie prelucrat n 1-2 ore
5. Materiile fecale (vezi capitolul 28)

6. Urina (vezi capitolul 29)

7. Sngele (vezi capitolul 31)

8. Lichidul cefalo-rahidian

se recolteaz n cazul suspicionrii prezenei unui sindrom

meningeal, dup examinarea fundului de ochi (verificm presiunea n
artera central a retinei, semne de staz papilar)

suspiciunea este ridicat de medicul de specialitate (boli

infecioase, neurologie, medicin intern etc) iar recoltarea se va
face la patul bolnavului de ctre medicul care are competena de a
executa aceast manevr (ex. prin puncie lombar)

tehnicile de asepsie trebuie s fie riguroase n toate situaiile,

dar n cazul recoltrii LCR atenia trebuie s fie i mai sporit

chiar dac acest manual de lucrri practice se adreseaz

numai infeciilor bacteriene i fungice, trebuie s privim lucrurile n
ansamblul lor i drept exemplu, s nu uitm c exist meningite
infecioase i meningite neinfecioase iar meningitele infecioase pot
fi fungice, bacteriene, parazitare, virale, prionice; n plus, pentru
elucidarea etiologiei unei meningite este necesar efectuarea unor
examinri biochimice adiacente celor citologice i microbiologice
astfel nct este de dorit recoltarea (la adult) a unei cantiti de 5-10
ml LCR; recoltarea p.p. este invaziv i va trebui s fim n stare s
executm toate testele necesare fr a solicita repetarea punciei
lombare

recomandm recoltarea LCR n 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor

fi centrifugate iar din al treilea tub se vor realiza testele biochimice
i alte teste utile pentru a sugera etiologia); dac LCR este franc
purulent, examenul microscopic direct se face fr centrifugare

n mod ideal, LCR trebuie prelucrat imediat, cu alte cuvinte

recoltarea i procesarea p.p. trebuie s nceap la patul
bolnavului; recomandm ca pe lng trusa necesar manevrei de
recoltare s avem la dispoziie o spirtier, stative pentru eprubete,
medii de cultur diverse (agar-snge, Lwenstein, Sabouraud etc)

dac LCR urmeaz a fi transportat, transportul trebuie s se

fac ct mai rapid i la o temperatur apropiat de temperatura
corpului uman (n nici un caz la +4C; att Haemophilus influenzae
ct i Neisseria meningitidis, ageni etiologici recunoscui ai
meningitelor bacteriene sunt distrui prin refrigerare)

un al motiv n favoarea unui transport i o prelucrare foarte

rapid a LCR este reprezentat de studiul citologic al p.p. i mai
precis de numrarea leucocitelor polimorfonucleare care ncep s fie
distruse n numr semnificativ nc din primele 30-60 minute dup
recoltare

9. Secreii recoltate de la nivelul aparatului genital

exist mai multe tipuri de secreii care ar putea fi recoltate n

funcie de manifestarea clinic; n materialul de fa vom discuta
doar o parte dintre acestea

n cazul secreiei uretrale, la brbat

recoltarea p.p. trebuie s se fac dimineaa, nainte de

miciune, sau la cel puin 2 ore dup aceasta; n cazul n care
pacientul nu se prezint dimineaa i nu este respectat condiia de
mai sus iar dup 2 ore de la micionare secreia este n cantitate
prea mic, i vom recomanda s consume ct mai puine lichide n
restul zilei i s revin n dimineaa urmtoare, nainte de miciune

sunt necesare tampoane de vat sterile (un tampon pentru

examenul microscopic i al doilea pentru cultivare) sau, alternativ o
ans bacteriologic steril; este recomandabil ca ansa s aib firul i
bucla de platin (sau ar putea fi o ans bacteriologic de unic
ntrebuinare)

se observ penisul i meatul urinar precum i dac exist

secreie uretral

dac exist secreie uretral, aceasta este recoltat cu

tamponul (sau cu ansa)

n cazul n care nu se evideniaz secreie uretral n mod

spontan, cu mna protejat de o mnu de latex, exprimm uretra
utiliznd degetul mare i indexul i recoltm secreia care apare

dac nici prin aceast manevr nu putem obine p.p. vom

recurge la recoltarea intrauretral cu tamponul (sau cu ansa)

n acest scop sunt necesare tampoane de dimensiuni mai mici,

preferabil din alginat de calciu (sau dacron n suspiciunea unei
infecii cu Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.); dup introducerea
blnd, pe circa 2 centimetri lungime i rotirea intrauretral a
primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproximativ 1
centimetru mai profund

n suspiciunea de gonoree se recomand cultivarea imediat

dup recoltare pe mediul de cultur nclzit la 37C; n cazul n care
acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu p.p. va fi transmis
laboratorului n mediu de transport (ex. mediul Stuart pentru
Neisseria gonorhoeae sau alte variante pentru Chlamydia spp. sau
Mycoplasma spp.)

n cazul secreiilor cervicale, la femei

recoltarea se va face preferabil n primele 10 zile dup ciclul

menstrual, pe masa ginecologic, dup introducerea valvelor
ginecologice i examinarea vizual a vaginului i colului uterin

dac se remarc o secreie purulent, cu ajutorul unor

comprese sterile se ndeprteaz secreia de la nivelui colului extern

folosim 3 tampoane sterile introduse i rotite uor 1-2

centimetri n colul uterin (2 dintre tampoane le vom utiliza pentru
frotiuri Gram i Giemsa iar al treilea pentru cultivare procednd aa
cum am menionat mai sus).

10. Diferite p.p. recoltate n suspiciunea unor infecii fungice

n infeciile fungice, n funcie de localizare se pot recolta p.p.

foarte variate

spre exemplu, n micozele cutanate superficiale

dup antiseptizarea leziunii cu alcool medicinal (70) raclm

tegumentul i utilizm pentru examinare scuamele produse

att scuamele ct i alte structuri (fire de pr, fragmente de

unghie etc) se mpacheteaz n hrtie steril care se introduce ntr-o
cutie Petri i se trimite pentru prelucrare i examinare n laborator
(n maxim 48 de ore)

n micozele profunde, n funcie de localizare

recoltm p.p. i l transmitem ctre laborator avnd grij s

prevenim deshidratarea produsului

se recomand prelucrarea i examinarea imediat (unii fungi

sunt fragili; este de dorit s putem evalua situaia fungilor foarte
aproape de momentul recoltrii pentru a putea nelege care a fost
situaia in vitro)
 iar n caz contrar adugm penicilin, streptomicin i
cloramfenicol pentru inhibarea multiplicrii bacteriene i meninem
p.p. la +4C (supravieuirea la aceast temperatur depinde de
fungul implicat i poate varia de la ore la 2 sptmni, aa cum se
ntmpl n cazul unor fungi dimorfi).

Aa cum am menionat, datele prezentate nu cuprind toate

posibilitile i variantele. Am ncercat s dm doar cteva exemple
care sunt orientative. Pentru cei interesai exist manuale dedicate
exclusiv recoltrii i transportului produselor patologice, n
microbiologie.

Pentru trei dintre p.p. am ales o alt modalitate de prezentare.

Recoltarea urinii, materiilor fecale i sngelui va fi discutat n
partea special.

7. Preparate microscopice, frotiuri i principalele coloraii utilizate n

microbiologie

Microorganismele studiate au dimensiuni foarte mici, de ordinul

micronilor, astfel nct pentru examinarea lor este necesar o mrire
de circa 1.000X, aa cum vom discuta i n capitolul urmtor. Exist
diferite tehnici prin care se poate pune n eviden prezena unor
microorganisme ns, de mare utilitate este examenul microscopic
care se poate adresa unor preparate microscopice proaspete
(umede, ntre lam i lamel) sau unor frotiuri fixate i colorate n
funcie de suspiciunea diagnostic, p.p. examinat etc.

n schema general de diagnostic microbiologic (direct) vom

examina microscopic produsul patologic (etapa a 2-a) sau colonia
aprut pe mediul de cultur (etapa a 4-a, punctul b, identificarea
pe baza caracterelor morfotinctoriale).

Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic, alteori

are un rol orientativ, ns, chiar din al doilea an de studiu ar fi bine
ca viitorii medici s neleag, rein i ulterior s aplice cele
nvate, indiferent de specialitatea pe care o vor urma.

Preparate microscopice proaspete (umede, native, ntre lam i

lamel)

este de preferat s folosim lame i lamele noi supuse

urmtoarelor proceduri succesive (imersare n amestec sulfo-cromic
cteva zile, splare, cltire, pstrare n alcool 50%)

lamele se usuc (folosim o crp curat) apoi se degreseaz

suplimentar prin flambare (trecere de cteva ori prin flacra becului
Bunsen)

depunem pe lam o pictur din produsul care urmeaz a fi

studiat

dac produsul patologic are consisten lichidian (ex. urin,

sediment urinar, materii fecale, LCR, serozitate din ancru presupus
sifilitic etc) va fi utilizat ca atare; pentru o mai bun vizualizare
putem aduga albastru de metilen, lugol, tu de India, nigrozin etc

dac cultura este realizat n mediu lichid (ex. pentru

Leptospira spp.) se va utiliza ca atare

dac vrem s studiem spre exemplu mobilitatea

microorganismelor care au format colonii pe un mediu solid vom
descrca o ans din colonie ntr-o pictur de soluie salin
fiziologic, ap distilat sau bulion

dac p.p. este recoltat ntr-o suspiciune de micoz

superficial, pe lama de microscop se va depune o pictur dintr-o
soluie 10-20% KOH-glicerol n care se va descrca i dispersa p.p

dac vrem s studiem aspectul fungilor filamentoi

(mucegaiuri) dintr-o colonie, pe lam se va depune o pictur de
soluie lactofenol-albastru coton n care vom descrca un fragment
din periferia coloniei respective

acoperim pictura cu o lamel

cel mai frecvent presm uor lamela pentru a elimina

eventualele bule de aer

n cazul p.p. recoltat ntr-o suspiciune de micoz superficial,

nclzim uor preparatul prin trecere cu grij, de 2-3 ori, pe
deasupra flcrii becului Bunsen

dac vrem s studiem aspectul fungilor filamentoi

(mucegaiuri) dintr-o colonie, nu trebuie s micm sau s presm
lamela

n microscopia optic pe cmp luminos aezm preparatul pe

platina microscopului i examinm iniial cu obiectivul 10, apoi cu
obiectivul 20 sau 40 (nu folosim obiectivul de imersie); se pot
folosi i alte tehnici microscopice.

Frotiuri (preparate microscopice fixate i colorate)

Structura peretelui microbian determin o anumit afinitate fa de

colorani, ceea ce permite examinarea i diferenierea bacteriilor
sau fungilor n frotiuri.

frotiurile se pot realiza pornind de la produse patologice

(recoltate de la om sau de la animale de experien) sau din cultura
microbian (n mediu lichid sau solid)

frotiul trebuie ntins n strat ct mai subire (preferabil n

unistrat)

este de preferat s folosim lame i lamele noi supuse

urmtoarelor proceduri succesive (imersare n amestec sulfo-cromic
cteva zile, splare, cltire, pstrare n alcool 50%)

lamele se usuc (folosim o crp curat) apoi se degreseaz

suplimentar prin flambare (trecere de cteva ori prin flacra becului
Bunsen)

Executarea frotiurilor din p.p. cu consisten fluid sau din

culturi microbiene realizate n mediu de cultur lichid

dup ce am flambat lama, o aezm cu partea flambat n sus

sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc

prelevm aseptic p.p. / cultur i depunem produsul n centrul

lamei

ntindem prin micri de dute-vino (de haurare) pe axul

lung al lamei produsul prelevat, n strat ct mai subire, avnd grij
s nu ne apropiem de marginile lamei / ntinderea se poate face i
prin micri circulare, excentrice

lsm lama s se usuce lng becul de gaz (nu grbim uscarea

prin eventuale treceri ale frotiului prin flacr) n cazul n care
avem n dotare un dispozitiv n care lama se poate aeza i usca la
+70C, vom utiliza aceast metod

fixm frotiul; exist metode chimice de fixare, ns cel mai

frecvent folosim fixarea prin cldur, distrugnd n acelai timp i
microorganismele (care prezint o afinitate tinctorial mai mare
dect celulele vii)

n acest scop, trecem frotiul prin flacr (aa cum am procedat

i pentru flambarea lamei, nainte de executarea frotiului) ns de
aceast dat partea pe care am ntins p.p. sau cultura este orientat
n sus; ca o modalitate de control, atingem dosul minii cu lama
flambat iar temperatura atins prin flambare nu trebuie s fie mai
mare dect pe care o putem suporta

frotiul fixat este gata pentru colorare

Executarea frotiurilor din p.p. cu consisten solid sau din

culturi microbiene realizate n mediu de cultur solid

dup ce am flambat lama, o aezm cu partea flambat n sus

cu ajutorul flaconului cu picurtor sau cu ansa bacteriologic

sterilizat i rcit depunem n centrul lamei o pictur de soluie
salin fiziologic sau ap distilat

sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc

prelevm aseptic p.p. / un fragment din colonie i depunem

produsul n pictura de fluid de pe lam

omogenizm foarte bine p.p. / fragmentul de colonie n

pictura de fluid

procedm ca mai sus pentru ntinderea, uscarea i fixarea

frotiului

Executarea amprentelor de organ / alte p.p.

flambm lama

cu partea flambat atingem suprafaa de seciune a organului

respectiv

lama se poate aplica i pe suprafaa de seciune a unor

prelevate bioptice sau obinute prin necropsie

procedm ca mai sus pentru uscarea i fixarea frotiului

Colorarea frotiurilor

Exist foarte numeroase metode de colorare a frotiurilor. Dintre

acestea vom prezenta doar cteva dintre coloraiile folosite mai
frecvent.

n vederea colorrii avem nevoie de o trus pentru colorare (stativ

de colorare, colorani conform reetei de colorare, ap distilat
sau ap curent pentru splare, stativ de uscare).

Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai

frecvent coloraiile cu albastru de metilen (A.M.), Giemsa, Gram i
dup caz, Ziehl-Neelsen. n funcie de suspiciunea diagnostic i p.p.
examinat se pot folosi i alte coloraii (de ex. coloraia Gimenez
pentru depistarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale
infectate experimental sau coloraia cu albastru de toluidin pentru
evidenierea Pneumocystis carinii).

n cazul multora dintre coloraiile uzuale au fost realizate diferite

modificri n funcie de experiena autorilor i scopul urmrit. De ex.
coloraia cu A.M poate avea urmtoarele variante:

albastru de metilen Lffler pentru cele mai multe coloraii

simple sau ca un al doilea colorant n coloraia Ziehl-Neelsen

albastru de metilen policrom pentru evidenierea Bacillus

anthracis n p.p., pentru corynebacterii sau nlocuind coloraia de
mai sus

albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.p., cu o

sensibilitate mai bun dect utilizarea A.M. Lffler etc.

n cursul lucrrilor practice precum i n manualul de fa se va

discuta numai cte o variant cu referire la principalele coloraii
folosite n microbiologie. Cei interesai au la dispoziie pentru studiu
un bogat material teoretic iar dup ncheierea antrenamentului
personal n ceea ce privete realizarea de frotiuri i coloraii, fiecare
va putea alege o variant, aplicabil n funcie de situaie.

Pentru colorarea frotiurilor obinute din cultur vom folosi n special

coloraiile Gram, Ziehl-Neelsen i alte coloraii specifice, dup caz
(coloraii pentru cili, capsul, spori etc).

Coloraia cu albastru de metilen

acoperim frotiul cu soluie de albastru de metilen, pentru 3-4

minute (nu are rost s acoperim cu colorant lama n ntregime)

splm cu ap distilat sau ap de la robinet

aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim

uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

Coloraia Giemsa

fixarea frotiului nu se face la cald ci chimic, cu alcool metilic

(de ex. timp de 1 minut)

scurgem lama i ateptm evaporarea alcoolului metilic

 acoperim frotiul cu soluie May-Grnwald (diluat n pri
egale cu tampon fosfat), pentru 3 minute

nclinm lama i scurgem soluia colorant (care are i rol

fixator)

acoperim frotiul cu soluie Giemsa, pentru 10 minute

splm cu tampon fosfat

ateptm ca frotiul s se usuce i examinm cu un obiectiv

intermediar; dac colorarea celulelor este mai slab dect cea
ateptat acoperim din nou frotiul cu soluie Giemsa, nc 10 minute

splm cu tampon fosfat

aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim

uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

Coloraia Gram

dilum ntr-un recipient fucsina (9 pri ap distilat / 1 parte

fucsin)

acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de

genian din punct de vedere istoric), pentru 1-3 minute (nu are rost
s acoperim cu colorant lama n ntregime)

ndeprtm colorantul

acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute

ndeprtm lugolul

acoperim frotiul cu un amestec de alcool-aceton (1 parte

aceton / 3 pri alcool de 96) pentru un timp foarte scurt, 7-8
secunde

splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet

acoperim frotiul cu fucsina diluat 1/10 pentru 1 minut

splm cu ap distilat sau ap de la robinet

aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim

uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

Coloraia Ziehl-Neelsen

Este o coloraie util n identificarea prezenei de bacili acid-alcool

rezisteni (BAAR), solubiliznd peretele bacterian prin creterea
temperaturii, facilitnd penetrarea colorantului.

punem frotiul uscat i fixat pe un suport situat deasupra

tviei de colorare

acoperim complet lama cu fucsin bazic nediluat (filtrat

extemporaneu)

trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperit de fucsin,

pn ncepe emiterea de vapori (nu atingem temperatura de
fierbere). n cazul n care lama nu mai este acoperit complet cu
fucsin, adugm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute,
perioad n care repetm de 3 ori operaia de nclzire a lamei pn
la emiterea de vapori.

splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet

adaugm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric

concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95), pentru 2-3 minute

splm cu ap distilat sau ap de la robinet

recolorm cu albastru de metilen, 1 minut

splm cu ap distilat sau ap de la robinet

aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim

uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

Coloraia Kinyoun

Este o coloraie util n identificarea prezenei de BAAR, fr a

utiliza nclzirea n cursul etapelor de colorare (coloraie la rece).

acoperim lama complet cu o hrtie de filtru decupat n acest

scop

picurm soluie de fucsin fenicat Kinyoun pn cnd hrtia

de filtru se mbib complet i ateptm 5 minute

ndeprtm hrtia de filtru

splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet

 acoperim lama cu amestecul decolorant acid-alcool pentru
circa 30 secunde; vrsm amestecul decolorant i repetm operaia
pentru nc 30 secunde

splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet

acoperim frotiul cu albastru de metilen, pentru 1 minut (nu are

rost s acoperim cu colorant lama n ntregime)

splm cu ap distilat sau ap de la robinet

aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim

uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

Coloraii fluorescente

Exist mai multe variante, inclusiv coloraii n care se utilizeaz

anticorpi marcai fluorescent. Vom prezenta n continuare coloraia
fluorescent cu auramin O. Este o coloraie util n identificarea
prezenei de BAAR (sensibilitate crescut).

colorm cu soluie de auramin O (amestec de auramin O,

alcool etilic, fenol, ap distilat), pentru 15 minute

splm cu ap distilat

decolorm cu amestec de acid-alcool, pentru 5 minute

splm cu ap distilat

contracolorm cu soluie de permanganat de potasiu,

pentru 2 minute

splm cu ap distilat sau ap de la robinet

aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim

uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

Coloraia Gimenez

Este o coloraie util n identificarea rickettsiilor pe amprente de

organ de la animale infectate experimental sau n culturi precum i
pentru identificarea incluziilor de Chlamydia trachomatis sau
Chlamydia spp.
 acoperim lama cu xilol, pentru 5 minute

ndeprtm xilolul

acoperim lama cu alcool etilic (96), pentru 2-3 minute

ndeprtm alcoolul

acoperim frotiul cu soluia de fucsin fenicat preparat dup

reeta Gimenez, pentru 1-2 minute, fucsina se picur pe frotiu printr-
o plnie prevzut cu o hrtie de filtru

splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet

acoperim frotiul cu soluie de verde malachit, pentru 6-9

secunde

splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet

aezm frotiul n stativ pentru uscare

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.

n capitolul urmtor, dup prezentarea microscopului optic (n cmp

luminos), vom enumera o serie de date privind structurile care pot fi
observate.

8. Tehnica examenului microscopic n diagnosticul microbiologic

Microscopul este un instrument absolut necesar n vederea stabilirii

unui diagnostic bacteriologic direct (exist tehnici de microscopie
care pot fi utile i n diagnosticul microbiologic indirect). Exist mai
multe categorii de microscoape. n mod uzual examenul microscopic
utilizeaz microscopul optic (microscopia optic pe cmp luminos).
n anumite situaii se poate recurge la microscopia cu fond negru,
microscopia cu contrast de faz sau la microscopia cu fluorescen.
n cazul utilizrii ultimelor trei tipuri de microscop este necesar o
camer obscur. Microscopia electronic, microscopia protonic sau
alte tehnici sofisticate de microscopie nu fac obiectul materialului de
fa (aceste tehnici ar putea fi utilizate n cercetare, de ex. pentru a
evidenia inter-relaia dintre bacterie i bacteriofag).

Microscopul optic i microscopia optic pe cmp luminos

Microscopul optic este un instrument care permite observarea

obiectelor mai mici dect cele care pot fi vzute cu ochiul liber (sau
cu lupa). Microscopul formeaz imagini virtuale, mrite i rsturnate
ale obiectului cu ajutorul unui sistem de lentile obiectiv i de lentile
ocular.

Distana minim dintre dou puncte ale unui obiect care mai pot fi
vzute separat unul de celalalt prin microscop este:

unde l reprezint lungimea de und a radiaiei folosite, n este

indicele de refracie al mediului strbtut de radiaie ntre obiect i
ocular iar u este unghiul dintre axa optic i razele cele mai
ndeprtate de ax care mai ptrund nc n obiectiv. Pentru a
micora aceast distan i respectiv pentru a mbunti
performanele microsopului exist mai multe metode dintre care
vom meniona dou, utilizate i n studiul microbiologic:

utilizarea unor radiaii cu lungime de und l ct mai mic (de

ex. pentru radiaia ultraviolet se pot distinge obiecte cu dimensiuni
de 0,15 mm)

mediul transparent dintre obiect i obiectiv s aib un indice

de refracie n ct mai mare (aa cum se procedeaz n cazul
microscopului cu imersie).

n microscopia optic pe cmp luminos lumina este transmis de-a

lungul axului optic al instrumentului, prin preparat, n aceste condiii
obinndu-se un cmp vizual puternic luminat, n care obiectele,
pentru a putea fi vzute, se disting pe fondul luminos fie prin
opacitate, fie prin culoarea lor (n special dup utilizarea unor
tehnici de colorare - a se revedea capitolul 7).

Pot fi realizate i msurtori cu ajutorul micrometrelor (utile mai

mult n diagnosticul parazitologic); micrometrele sunt plcue de
sticl pe care sunt marcate scale fin divizate, de dimensiuni
cunoscute, a cror imagine se poate suprapune peste imaginea
obiectului de cercetat.

Prile componente ale microscopului optic

Microscopul optic are urmtoarele prile componente:

1. Piciorul microscopului, alctuit dintr-o mas metalic cu rol de

susinere, pe care se sprijin platina microscopului. Pe platina
microscopului se aeaza preparatul. Platina prezint un orificiu
central care permite trecerea razelor luminoase i orificii laterale n
care sunt prini cavalerii cu ajutorul crora preparatul este fixat
pe platin. Cu ajutorul a 2 uruburi ce se gsesc sub platform,
aceasta se poate deplasa pe 2 direcii perpendiculare.
2. Tubul microscopului susine ocularul i obiectivul. Tubul poate
fi deplasat mai rapid i grosier cu ajutorul macrovizei i mai lent i
fin cu ajutorul microvizei. La captul superior al tubului se pot pune
oculare cu diverse puteri de mrire, care se pot schimba uor.
Frecvent utilizm n microbiologie oculare cu puterea de mrire 10x.

Obiectivul se monteaza n revolver, situat la captul inferior al

tubului. Revolverul este un suport special care permite montarea
mai multor obiective i inter-schimbarea lor prin rotire. Obiectivul
este compus dintr-un sistem centrat de lentile aezate ntr-un tub
metalic care se nurubeaz la revolver. Puterea separatoare a
microscopului este determinat de puterea separatoare a
obiectivului a crui putere de mrire este cu att mai mare cu ct
distana focal a acestuia este mai mic.

Exist obiective uscate (ex. 10x, 20x sau 40x) i cu imersie (ex. 90x
sau 100x). Obiectivele uscate primesc fasciculul de lumin ce trece
prin preparat direct prin aer, astfel c o parte din razele trimise de
obiect ctre lentila concav se pierd prin fenomenul de reflexie
total. Pierderea razelor de lumin datorit acestui fenomen se
poate nltura prin interpunerea ntre lamel i obiectiv a unei
picturi de ulei de cedru sau de alt lichid cu indice de refracie
apropiat de cel al sticlei din care este fcut lentila frontal a
obiectivului, aa cum se petrece n cazul obiectivelor cu imersie,
foarte frecvent utilizate n microbiologie.

3. Dispozitivul de iluminare este format din oglind i

condensator.

Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumin spre axul

optic al microscopului; prezint o suprafa plan i una concav i
este fixat pe un suport, n aa fel nct se poate roti n jurul a doua
axe perpendiculare

4. Condensatorul care este format din 2-3 lentile cu ajutorul

crora lumina reflectat de oglind este concentrat asupra
obiectului; fascicululul paralel de raze de lumin care cade pe
condensator devine convergent. Pentru a obine o imagine clar,
condesatorul se poate deplasa pe vertical pn cnd obiectul se
gsete n focarul fasciculului convergent care iese din condensator.
Razele de lumin, nainte de intrarea n condensator, trec printr-un
suport de filtre i o diafragm iris (diafragm de apertur).
Condensatorul contribuie n mod esenial la luminozitatea imaginii.

Examinarea folosind microscopul optic n cmp luminos

1. Examinarea unui preparat proaspt (ntre lam i lamel)

Pe lam se depune o pictur din suspensia care urmeaz a fi

examinat, se acoper cu o lamel, se aeaz pe platina
microscopului i se fixeaz cu ajutorul cavalerilor.

Condensatorul este cobort circa 1,5 cm sub platin, diafragmul este

semi deschis iar obiectivul 40X este cobort pn deasupra lamelei
(privind prin lateral).

Privind prin oculare, rotim foarte ncet macroviza ridicnd uor tubul
microscopului pn apare cmpul microscopic. Punem la punct
imaginea cu ajutorul microvizei i reglnd lumina prin modificarea
fantei condensatorului.

Se pot examina astfel: sedimentul urinar, materii fecale provenind

de la un pacient cu diaree, suspensii de bacterii care se presupune
c sunt mobile, preparate umede realizate n cazul suspicionrii unei
micoze cutanate superficiale etc

sediment urinar / putem vizualiza: celule epiteliale

(malpighiene, vezicale, uretrale etc), celule sanguine (leucocite,
hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali,
granulari etc), cristale urinare, levuri (eventual nmugurite, cu
blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc; examenul sedimentului
urinar este foarte util

preparat montat n soluie KOH / putem vizualiza: levuri

(numr, form, dimensiuni), blastoconidii, atroconidii, pseudohife,
microorganisme asociate

preparat colorat cu tu de India (coloraie negativ) / putem

vizualiza: levuri capsulate, nconjurate de un halou clar pe fondul
ntunecat al preparatului, ex. Cryptococcus neoformans

n cazul n care se urmrete mobilitatea microorganismelor,

trebuie s putem deosebi micarea real de micarea brownian
(oscilaie pe loc a particulelor); urmrim reperele aflate n
vecintatea microorganismelor etc.

2. Examinarea unui preparat fixat i colorat

Frotiul se aeaz pe platina microscopului i se fixeaz cu ajutorul

cavalerilor.

Centrm zona pe care dorim s o examinm. Procedm ca mai sus

utiliznd obiectivul 40x; alegem cmpul pe care l vom examina
ulterior cu obiectivul cu imersie (de ex. un cmp n care sesizm
prezena leucocitelor).

Ridicm tubul microscopului, punem o pictur de ulei de cedru pe

lam, n zona pe care urmeaz s o examinm. Condensatorul este
ridicat pn sub platina microscopului i are diafragmul deschis.

Privind din lateral, folosim macroviza i coborm obiectivul cu

imersie (90x sau 100x) pn atingem suprafaa lamei realiznd
contactul i cu uleiul de cedru. Manevra trebuie realizat cu grij
pentru a nu sparge frotiul.

Privim prin oculare i rotim foarte ncet macroviza ridicnd foarte

ncet tubul microscopic, pn prindem imaginea cmpului. Cu
ajutorul microvizei punem la punct imaginea.

Se pot examina: morfologia celulelor din produsul patologic,

prezena leucocitelor i dac acestea sunt modificate, prezena
bacteriilor i dispunerea acestora (ex. intra sau extra-leucocitar),
morfologia bacteriilor, morfologia unor parazii, morfologia levurilor,
aspectul frotiurilor de snge etc

frotiu colorat cu albastru de metilen (A.M.) / putem vizualiza:

bacterii colorate n albastru nchis, n cazul bacteriilor capsulate,
aceast structur va aprea ca un halou necolorat, celule diferite (n
funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii pentru care nucleul
apare ntr-o culoare albastru mai nchis n timp ce citoplasma apare
cu nuane de albastru; coloraia cu A.M. permite o mai bun
difereniere a detaliilor structurale

frotiu colorat Giemsa / putem vizualiza: hematii (roz-roii),

polimorfonucleare neutrofile (citoplasm roz, granulaii brune,
nucleu violaceu), polimorfonucleare eozinofile (citoplasm roz,
granulaii brune, nucleu violaceu), limfocite i macrofage
(citoplasm albastr, nucleu violaceu), bacterii colorate n violet,
forme trofice de Pneumocystis carinii (nucleu rou, citoplasm
albastr), Histoplasma capsulatum n citoplasma celulelor fagocitare
(levuri colorate n rou), incluziuni de Chlamydia trachomatis
(corpusculii reticulai apar albatri, corpusculii elementari apar roii)
etc

frotiu colorat Gram

n cazul n care frotiul a fost realizat din cultur pur putem

vizualiza microorganisme cu aceeai form, aceleai dimensiuni
(excepie Proteus spp.), o anumit dispoziie, cu sau fr capsul
(halou necolorat), gram pozitive (colorate n violet) sau gram
negative (colorate n rou), levurile se coloreaz n violet

n cazul n care frotiul a fost realizat din produs patologic

putem vizualiza celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i
celule inflamatorii pentru care nucleul i citoplasma apar n diverse
nuane de rou, bacterii gram pozitive i / sau gram negative, fibrin
i levuri care se coloreaz n violet etc

frotiu colorat Ziehl-Neelsen sau Kinyoun / putem vizualiza:

bacili de culoare roie, relativ fini (n cazul prezenei BAAR), alte
bacterii (ne-AAR), celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i
celule inflamatorii de culoare albastr (toate structurile ne-AAR apar
colorate albastru) etc; n cazul colorrii unui frotiu din cultur pur
vom evidenia numai bacili de culoare roie.

ntreinerea microscopului

Dup terminarea examenului microscopic trebuie efectuate

urmtoarele proceduri:

nchidem sursa de lumin

ridicm cu ajutorul macrovizei tubul microscopului

coborm condensatorul

scoatem lama (sau lama i lamela) de pe platina microscopului

preparatele proaspete le punem n borcanul cu amestec

dezinfectant

preparatele fixate (pe care urmeaz s le pstrm) se introduc

ntr-un container cu xilol (1-2 minute) apoi, dup evaporarea xilolului
se pun ntr-o cutie

tergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau

cu o hrtie moale, special, pentru a o cura de uleiul de cedru
(periodic, vom terge lentila acestui obiectiv cu un tifon foarte curat
mbibat n xilol)

curm platina microscopului i lentila condensatorului cu

tifon curat mbibat n xilol

acoperim microscopul cu o hus de plastic sau pnz, pentru

a-l feri de praf

pentru a preveni efectul nedorit al multiplicrii unor fungi

asupra sistemului optic, o recomandare ar fi meninerea
microscopului ntr-un ambalaj de polietilen mpreun cu o
substan desicant, spre exemplu silicagel.

Microscopul cu fond ntunecat (negru)

Pentru acest tip de examinare este utilizat un microscop optic

obinuit la care se adapteaz o surs de lumin cu intensitate mare
i un condensator cardioid (cu oglinzi sferice concentrice), cu
posibiliti de diafragmare a luminii. Condensatorul pentru cmp
ntunecat (fond negru) oprete accesul spre obiectiv al razelor de
lumin directe iar obiectul este iluminat oblic. Astfel o parte dintre
razele difractate i reflectate de obiectul iluminat oblic ptrund n
obiectiv care apare luminos pe fondul ntunecat al cmpului.

Pentru a evita reflexia total a razelor, nainte ca obiectul s fie

luminat, acesta este imersat ntr-o pelicul de lichid (lichid de
imersie cu indice de refracie mai ridicat, ex. glicerina). Lamele
trebuie s aib grosimea de 1 milimetru (distana focal a
condensatorului fiind 1,2 milimetri).

Tehnica de examinare

Dup centrarea diafragmei de cmp folosind obiectivul cu mrire 10x

i condensatorul pentru cmp luminos, trebuie s nlocuim acest
condensator cu condensatorul cardioid. Condensatorul cardioid este
cu diafragma nchis. Ridicm condensatorul pn la nivelul platinei
microscopului i punem pe lentila condensatorului o pictur de
glicerin.

Pregtim preparatul proaspt (ntre lam i lamel) i l plasm pe

platina microscopului astfel nct s vin n contact cu glicerina de
pe lentila condensatorului. Fixm preparatul cu ajutorul
cavalerilor.

Examinm iniial cu obiectivul 10x, apoi cu obiectivul 40x cobort

pn aproape de suprafaa lamelei; punem la punct imaginea cu
ajutorul microvizei. Cnd obinem imaginea curgerii curentului de
lichid tim c am prins cmpul microscopic. Utiliznd mai departe
microviza punem la punct detaliile i apoi nregistrm ceea ce am
examinat.

Examinarea la microscopul cu fond negru este indicat n mod

special pentru examinarea morfologiei i mobilitii pentru
Treponema pallidum n serozitatea din ancrul sifilitic sau pentru
Leptospira spp. n produs patologic (ex. urin) sau din medii de
cultur.

lichidul clar recoltat i ancrul sifilitic trebuie examinat n

maxim 20 minute dup recoltare; putem vizualiza spirochete
luminoase, fine, lungi, cu spire regulate, capete efilate, cu micri de
nurubare, flexie, translaie, pe fond negru

n preparatul proaspt care conine leptospire putem vizualiza

filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de
nurubare i flexie, pe fond negru.

Microscopul cu contrast de faz

Pentru acest tip de examinare este necesar s avem n dotarea

microscopului o serie de piese strict necesare, respectiv: un
condensator special care include o serie de diafragme inelare,
obiective de faz (de fapt obiective obinuite la care n planul focal
superior a fost montat o plac de faz; obiectivele de faz sunt
gravate cu Ph), oculare de centrare, lamp cu intensitate
luminoas mare, filtru verde.

Folosind microscopia cu contrast de faz este posibil observarea

obiectelor transparente care prezint variaii de grosime sau variaii
ale indicelui de refracie n structura lor. Sunt utilizate preparate
microscopice proaspete. Faptul c aceste preparate nu sunt fixate i
colorate permite examinarea unor caracteristici care ar putea fi
alterate n cursul acestor procese. Se pot examina structuri
citoplasmatice, morfologia celular, dar i structuri bacteriene sau
fungice.

Microscopul cu fluorescen

Microscopul cu fluorescen trebuie s fie dotat cu urmtoarele

piese speciale: sursa de radiaii (de ex. o lamp din sticl de cuar cu
vapori de Hg care emite radiaii ultraviolete), setul de filtre (caloric,
de excitaie, de baraj), condensatorul pentru fond ntunecat.

Filtrele au urmtoarele roluri. Filtrul caloric absoarbe radiaiile

calorice emise de lamp (sursa de radiaii emite att radiaii
ultraviolete ct i radiaii luminoase i calorice). Filtrele de excitaie
permit numai radiaiilor cu lungime de und mic (ex. ultraviolete)
s accead ctre preparatul microscopic. Aceste radiaii reprezint
radiaii de excitaie. Filtre de baraj sunt de fapt filtre de protecie
pentru c nu permit trecerea radiaiilor de excitaie nocive s treac
spre ocular i respectiv spre ochiul examinatorului, n timp ce lumina
emis de fluorocromi trece i poate fi perceput. Filtrele de excitaie
i de baraj sunt alese n funcie de fluorocromul utilizat.

Condensatorul mrete contrastul imaginii mai bine dect un

condensator obinuit.

Pentru examinarea n fluorescen mai sunt necesare cteva

elemente, respectiv obiectivele acromate (cu meniunea c
obiectivul cu imersie trebuie s aib diafragm iris), utilizarea unui
lichid de imersie care nu se usuc uor i lipsit de proprietatea de
fluorescen (ex. glicerin tamponat neutr) i respectiv lame cu
grosimea de 1 milimetru. Este preferabil utilizarea unui dispozitiv
monocular.

Examinarea folosind microscopul cu fluorescen

Preparatele microscopice (care pot include bacterii) sunt tratate cu

flurocromi (colorani fluoresceni). Fluorocromii sunt compui
organici care, dup iradiere cu radiaii ultraviolete absorb radiaia
excitant, intr n stare de excitaie iar atunci cnd revin n starea
normal pierd energia acumulat emind radiaii luminoase.
Dintre fluorocromi am putea aminti auramina O, rhodamina B,
acridin-oranj R sau tripaflavina. Lumina vizibil emis depinde de
fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galben pentru
auramina O, galben-portocalie pentru combinaia de auramin O
rhodamin B etc).

Sunt de menionat n mod special acele substane care se pot lega

covalent de anticorpi, marcnd astfel complexele antigen-anticorp
care devin fluorescente. Atunci cnd marcajul se realizeaz cu
izotiocianat de fluorescein lumina emis va avea culoare verde iar
dac marcajul se realizeaz cu lisamin-rhodamin, lumina emis va
avea culoare portocalie.

Drept exemplu privind utilizarea microscopiei cu fluorescen vom

meniona examinarea frotiurilor colorate fluorescent sau
imunofluorescent n diagnosticul bacteriologic al tuberculozei sau al
leprei. Alte exemple vor fi prezentate n cadrul capitolului 20.

9. Medii de cultur

Populaia = o multitudine de indivizi ai unei specii care habiteaz

ntr-un anumit biotop. Clona reprezint populaia care rezult dintr-o
singur celul prin nmulire vegetativ. Tulpina = populaia
microbian alcatuit din descendenii unei singure izolri n cultur
pur.
n funcie de temperatura de dezvoltare, microorganismele pot fi
mezofile, psichrofile sau termofile. Bacteriile studiate de
microbiologia medical sunt n imensa lor majoritate mezofile (au
temperatura optim de dezvoltare cuprins ntre 30-37C). Pentru
fungi, temperatura optim de dezvoltare este n jur de 28C.

Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii trebuie ca dintr-

un produs recoltat de la pacient s obinem mai nti respectivul
microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i se poat studia
caracterele fenotipice sau genotipice. Cultivarea este esenial i
pentru determinarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice.

Metodele de cultivare a bacteriilor sau fungilor urmresc trei

obiective: obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ
pentru investigaiile propuse, prevenirea contaminrii produsului
cercetat cu un microorganism strin i izolarea fiecrei tulpini
microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi
monomicrobiene denumite culturi pure. Nu exist un mediu unic,
valabil pentru cultivarea oricrui microorganism.

Termenul nsmnare definete operaia de introducere a unei

cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce
pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de
experien folosim termenul inoculare.

Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea microorganismelor pe

medii de cultur. Mediile solide sau lichide care asigur nutrienii i
condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii se numesc
medii de cultur. Totalitatea microorganismelor acumulate prin
multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur
(bacterian, fungic etc).

***

Exist o foarte mare varietate de medii de cultur.

Mediile de cultur se pot clasifica dup mai multe criterii. n primul

rnd, n funcie de coninutul n celule vii avem la dispoziie:

1. Medii necelulare (artificiale, medii de cultur)

2. Medii celulare (care includ celule vii) i anume animale de

laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule.

Exist anumite microorganisme (ex. virusuri, Rickettsii, Chlamydii)

care nu pot fi cultivate dect pe substraturi care includ celule vii.
Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe
medii de cultur (necelulare, artificiale).

Gazdele vii (medii celulare)

Animalele de experien

Fie n situaia microorganismelor care nu se dezvolt pe medii

artificiale, fie n cazul n care se studiaz caracterele de
patogenitate, se pot utiliza n funcie de specia microbian i scopul
urmrit: oarecele alb, cobaiul, obolanul, hamsterul i iepurele.
Pentru producerea de seruri imune sunt folosii cai. Animalele de
laborator necesit condiii speciale de ntreinere iar biobaza trebuie
s respecte o serie de norme care s garanteze calitatea acestor
gazde vii. Astfel se explic costurile ridicate n ceea ce privete
acest tip de medii.

Avnd n vedere microorganismul inoculat, susceptibilitatea gazdei

i scopul urmrit se pot inocula animale cu vrste diferite (embrioni,
nou-nscui, animale tinere, aduli) pe ci diferite de inoculare (per
cutanat, prin scarificare, subcutanat, instilare la nivelul anumitor
mucoase, per os, intramuscular, intravenos, intratesticular etc).

Aa cum, spre exemplu, virulena Mycobacterium tuberculosis scade

pe msur de microorganismul este cultivat pe anumite medii de
cultur (aspect dovedit i prin obinerea tulpinii vaccinale BCG de M.
tuberculosis varianta bovis), n sens invers, este necesar uneori
exacerbarea virulenei, prin pasaje repetate realizate pe gazde
susceptibile. Alte exemple vor fi discutate n capitolele referitoare la
Streptococcus pneumoniae, Shigella spp., Klebsiella pneumoniae,
Treponema pallidum, Rickettsia spp., Chlamydia spp i Candida spp.

Oul de gin embrionat

Are avantajul unui pre mai sczut, este n mod normal steril (n
condiiile producerii acestor gazde vii n uniti specializate), nu
prezint factori antimicrobieni n perioada n care se realizeaz n
mod obinuit inocularea (la 6-14 zile de incubaie).

Oul de gin este nti examinat la ovoscop pentru evaluarea

embrionului i prezenei unor eventuale modificri nedorite. n
condiii de strict asepsie oul de gin embrionat se poate inocula
intraembrionar (intramuscular, intracerebral etc), la nivelul
membranei chorioalantoidian, n sacul alantoidian sau n sacul
amniotic. Oul inoculat se introduce n incubator, la 37C n condiii
de bun ventilaie a aerului i umiditate corespunztoare, pentru 1
sau mai multe zile. Se poate utiliza aceast metod pentru izolarea
i identificarea tulpinilor rickettsiene (utiliznd metode imunologice,
ex. reacia de microaglutinare).

Culturi de celule

Exist posibilitatea utilizrii unor culturi de organ sau a culturilor de

celule dispersate. Acestea din urm se pot clasifica n culturi
primare, tulpini celulare i linii celulare.

Culturile primare deriv din dispersia enzimatic (de ex. cu tripsin-

EDTA) a celulelor unui organ proaspt recoltat i pot fi meninute in
vitro pentru 3-5 pasaje. Tulpinile celulare reprezint culturi cu un
singur tip de celule (culturi omogene) i pot fi meninute in vitro
pentru 50-60 pasaje. Liniile celulare continue (stabile) sunt populaii
celulare care deriv din esut normal sau malign i pot fi
subcultivate (respectnd indicaiile din protocol) n mod nelimitat.
Au fost puse la punct foarte multe linii celulare spre exemplu:

linii celulare derivate din rinichi de maimu (Vero, BSC-1,

BGMK etc), oarece (McCoy), ovar de hamster (CHO)

linii celulare derivate din carcinom de col uterin (HeLa),

laringe (HEp-2)

linii celulare limfoblastoide (MT-4, H9 etc) etc.

Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK,

HeLa, McCoy, pentru Chlamydia pneumoniae se pot utilizat liniile
celulare HeLa, HEp-2, pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia
celular McCoy etc. Liniile celulare pot fi utile i n vederea studierii
efectului unor exotoxine, spre exemplu n cazul toxinelor produse de
E. coli O157:H7 i respectiv de Shigella shiga se poate utiliza linia
celular Vero n timp ce pentru toxinele produse de Vibrio cholerae
i E. coli entero-toxigen se poate utiliza linia celular CHO.

Medii artificiale (necelulare)

Mediile de cultur artificiale sunt mai ieftine, se pot prepara mai

uor (folosind reete foarte asemntoare celor de buctrie sau
alte variante despre care vom discuta pe scurt n continuare) i, fr
a fi ideale, sunt cel mai frecvent utilizate n practicat
microbiologic.

Condiii impuse mediilor de cultur artificiale:

- s fie sterile,
- s fie nutritive (s conin factorii de cretere necesari),

- s aib un anumit pH (cel mai adesea ntre 7,2-7,6),

- s aib o anumit presiune osmotic,

- s aib umiditatea favorabil multiplicrii germenilor

- alte condiii.

Clasificarea mediilor de cultur artificiale

Mediile de cultur artificiale se pot clasifica dup o serie de criterii.

Dup starea de agregare, mediile de cultur artificiale pot fi:

solide (agar / geloz, agar-snge, AABTL, ADCL, Bordet-

Gengou, Chapman, Lffler, Lwenstein, Mueller-Hinton, Sabouraud,
TCBS, TSI etc)

lichide (ap peptonat alcalin, bulion Mueller-Hinton, bulion

nutritiv, bulion-snge, bulion selenit, bulion tioglicolat, Middlebrook
7H9, O.C.S.T. etc)

semisolide (Cary-Blair, MIU, Stuart etc)

Dup complexitatea ingredientelor, mediile pot fi:

simple (agar, bulion simplu etc)

complexe (agar-snge, geloz-chocolat, agar cu factori X i V,

Bordet-Gengou, Mueller-Hinton etc)

Dup scopul urmrit mediile de cultur artificiale pot fi:

de transport (ap peptonat alcalin, Cary-Blair, Stuart etc)

de izolare (agar-snge, Bordet-Gengou, Lffler, Lwenstein,

Sabouraud etc)

de identificare (TSI, MIU, truse API etc)

de conservare (agar nutritiv n coloan etc)

Dup coninutul n ap, mediile pot fi:

cu umiditate obinuit

medii uscate (deshidratate) n scopul conservrii

Medii speciale:
 elective (Lffler etc)

selective (agar-snge azid de sodiu, BSA, Chapman, Mac

Conkey, Tinsdale cu telurit de potasiu, medii cu antibiotice etc)

de mbogire (ap peptonat alcalin, bulion selenit, O.C.S.T.

etc)

difereniale (AABTL, ADCL, agar-snge, MIU, TSI, TCBS etc)

Exist i alte criterii de clasificare.

Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine

dezvoltrii unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser
coagulat de bou, pentru bacilul difteric).

Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv

inhib dezvoltarea altor bacterii dect cea a crei izolare se
urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea
bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care
bacteria care se dorete a fi izolat este rezistent).

Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii

patogene, inhibnd dezvoltarea florei de asociaie dintr-un produs
patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca mediu
electiv.

Mediul diferenial conine un indicator de pH i un anumit substrat

(de exemplu un zahar) care poate fi sau nu metabolizat,
determinnd modificarea pH-ului i a culorii indicatorului sau
modificarea aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de
brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenierea bacteriilor
lactozo-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozo negative
(Shigella, Salmonella etc). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat
citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree).

Iniial, toate mediile de cultur erau preparate n laborator, din

ingredientele stabilite conform reetei. Etapele generale pentru
producerea unui mediu sunt asemntoare:

cntrirea ingredientelor

dizolvarea n ap distilat sau ap deionizat

 verificarea pH-ului i ajustarea la pH-ul corect

filtrarea

sterilizarea (de regul prin autoclavare)

repartizarea n tuburi, flacoane etc.

n momentul de fa foarte frecvent se recurge la cumprare de

medii deshidratate, situaie n care este necesar doar adugarea
apei distilate, demineralizate sau distilate i demineralizate
(conform recomandrilor productorului), condiionarea i
sterilizarea prin autoclavare sau metoda recomandat pentru mediul
respectiv.

Exist de asemenea medii gata pentru utilizare, condiionate n plci

Petri sau tuburi.

Indiferent de forma de condiionare a mediilor de cultur precum i

indiferent de modul de procurare al acestora, laboratorul care le
utilizeaz trebuie s le supun controlului de calitate.

Spre exemplu, pentru a testa sterilitatea mediului agar-snge,

incubm 2 plci la 37C timp de 48 de ore; nu trebuie s apar
modificri macroscopice. Pentru a testa performana mediului
(eficiena biologic) utilizm pe o alt plac, i pe cte o jumtate de
plac, vom cultiva o tulpin de colecie de Streptococcus pyogenes
i respectiv o tulpin de colecie Streptococcus pneumoniae;
incubm placa Petri pentru 18-24 ore la 37C i apoi analizm
dezvoltarea culturii, caracterele coloniilor i respectiv caracterele
hemolizei produse.

n general, mediile de cultur dup producere i pn n momentul

utilizrii sunt conservate la adpost de lumina solar, +4C, n folie
de plastic nchis ermetic. Mediile pentru anaerobi (bulion
tioglicolat, alte medii) se pstreaz n dulapuri, la ntuneric i
temperatura camerei.

Descriere succint pentru unele medii mai frecvent folosite

Agar-snge

Include agar nutritiv baz care se dizolv la temperatur ridicat i

prin agitare n ap distilat; autoclavm (15 minute la 121C) i apoi
rcim pn la 50C. La aceast temperatur adaugm n proporie de
5% sngele defibrinat (snge de berbec, cal, bou sau de iepure;
sngele de om ar putea fi utilizat numai dac nu exist o alt
posibilitate, folosind de exemplu snge care a depit limita de
valabilitate ntr-o banc de snge). Distribuim mediul n condiii
aseptice, n plci Petri. Poate fi meninut la +4C pn la 4
sptmni.

Agar-chocolat

Procedm ca mai sus, pn la obinerea amestecului de agar-snge.

Introducem flaconul cu mediu n baie de ap i meninem timp de 10
minute la 80C; astfel eritrocitele vor elibera factorii nutritivi
necesari dezvoltrii unor bacterii mai pretenioase din punct de
vedere nutritiv. Cnd temperatura revine la 50C turnm mediul n
plci Petri. Se poate conserva la temperatura frigiderului pentru nu
mai mult de 4 sptmni.

Amies

Include agar, tioglicolat de sodiu, crbune farmaceutic neutru

(pentru a facilita supravieuirea microorganismelor fragile, de ex.
Neisseria gonorrhoeae) i o soluie tamponat de sruri anorganice.
Nu conine indicator redox. Este sterilizat prin autoclavare i poate fi
meninut la +4C timp de 12 luni.

Este un mediu de transport care limiteaz i multiplicarea unor

eventuali coliformi de contaminare (ceea ce nu se realizeaz prin
folosirea mediului Stuart).

Ap peptonat alcalin

Este un mediu utilizat pentru transportul probelor n care se

suspecteaz prezena Vibrio cholerae. Include pepton i clorur de
sodiu dizolvate prin nclzire n ap distilat, cu ajustarea pH-ului la
o valoare de 8,6-9,0. Mediul este repartizat n tuburi. Sterilizm prin
autoclavare (15 minute, 121C). Valabilitatea este de circa 6 luni (la
temperatura de 4C).

Bulion selenit

Este un mediu de mbogire, utilizat pentru izolarea Salmonella spp.

Include printre alte componente selenit acid de sodiu. Datorit
riscurilor acest mediu nu va fi pregtit de femei nsrcinate iar cei
care n produc vor avea grij s nu inhaleze sau nghit aceast
substan. Sterilizarea mediului turnat n tuburi se face n baia de
ap la temperatura de fierbere i nu prin autoclavare. Se poate
conserva la temperatura frigiderului timp de 6 luni.
Cary-Blair

Include agar, tioglicolat de sodiu i o soluie tamponat de sruri

anorganice dizolvate (prin nclzire i agitare) n ap distilat. Este
sterilizat prin autoclavare i poate fi conservat la temperatura
frigiderului mai multe luni.

Cary-Blair este un mediu de transport n special pentru germeni

gram negativi.

Lwenstein-Jensen

Reprezint mediul clasic utilizat n mycobacteriologie. Include 3

componente principale: o soluie de sruri i amidon, soluia de
verde malachit i omogenizatul de ou (proaspete i bine
antiseptizate). Dup filtrare produsul se repartizeaz n tuburi (cu
capac nurubat, innd cont de timpul lung de incubare, 2-8
sptmni). Mediul este coagulat n pant, la 85C i dup rcire se
poate menine la temperatura frigiderului cteva luni, pn la
utilizare.

Mac Conkey

Este un mediu slab selectivo-diferenial care include hidrolizat de

gelatin, hidrolizat de cazein, lactoz, sruri biliare, clorur de
sodiu, rou neutru (indicator de pH), cristal violet i agar, dizolvate
n ap distilat i autoclavate timp de 15 minute la 121C. Poate fi
meninut la +4C pn la 4 sptmni.

Medii pentru anaerobi

Exist mai multe tehnici pentru a asigura condiiile de anaerobioz.

Relativ frecvent se utilizeaz montarea plcii Petri, care conine deja
mediul de cultur rcit i nsmnat, rsturnat pe capacul propriu,
pe care se gsete un plicule care conine amestec reductor
(pirogalol, talc, carbonat de potasiu). Utilizm parafin nclzit
pentru a etaneiza placa. Dup solidificarea parafinei, mediul de
cultur este incubat n vederea obinerii coloniilor.

Medii pentru fungi

Vom discuta pe scurt doar un mediu mai frecvent utilizat, respectiv

mediul Sabouraud. Acesta include glucoz, digestie pancreatic de
cazein i agar care se dizolv prin uoar agitare, la cald, n ap
distilat. Dup ajustarea pH-ului la 5,6 urmeaz fierberea i filtrarea
mediului, la cald. Apoi are loc repartizarea n plci Petri sau n tuburi
i acestea se autoclaveaz timp de 15 minute la 121C. nainte de
utilizare, plcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura
frigiderului pentru circa 2 luni. De multe ori acest mediu devine
selectiv prin adugare de antibiotice (cloramfenicol, gentamincin
etc).

Despre mediile multitest TSI (triple sugar iron) i MIU (mobilitate

indol uree) vom discuta n cadrul capitolelor 12 i 28.

Stuart

Include agar, tioglicolat de sodiu, glicerofosfat de sodiu, clorur de

calciu i albastru de metilen, dizolvate prin nclzire la temperatura
de fierbere n ap distilat. Este sterilizat prin autoclavare i poate fi
meninut la +4C timp de 2-3 luni.

Este un mediu de transport universal; bacteriile pot supravieui 1-3

zile.

10. Tehnici de cultivare

Tehnicile de cultivare se folosesc pentru obinerea de colonii izolate

prin nsmnarea produsului patologic pe medii solide i pentru
repicarea coloniilor izolate n vederea obinerii de cultur pur,
precum i n alte situaii.

Pentru a corela noiunile pe care le vom prezenta cu ceea ce a fost

prezentat n capitolele anterioare, facem urmtoarele meniuni:

n capitolul 5 am discutat schema general a diagnosticului

microbiologic

acest diagnostic nu poate fi realizat n lipsa cunotinelor

privind

conduita n laborator i a normelor de protecie a muncii

(capitolul 2)

echipamentul i aparatura necesare (capitolul 3)

dezinfecia i sterilizarea (capitolul 4).

Toate acestea trebuie nelese n contextul unei activiti care s

previn erorile, s realizeze protecia pacienilor, s permit
compararea rezultatelor la nivel naional i internaional, s
contribuie la realizarea unei standardizri n microbiologia clinic
romneasc i s creasc ncrederea tuturor partenerilor din
sistemul sanitar din ara noastr (capitolul 1).

Pornind de la aceste noiuni de baz, n capitolele urmtoare am

discutat:

prima etap a diagnosticului direct (bacteriologic sau

micologic), n capitolul 6

utilizarea examenului microscopic n a doua i respectiv n a

patra etap (de identificare) a diagnosticului direct (capitolele 7 i 8)

substraturile pe care se poate realiza a treia i respectiv a

patra etap (cteva dintre caracterele examinate), n capitolul 9.

n capitolul de fa vom avea n vedere o parte dintre tehnicile

indispensabile diagnosticului microbiologic n general, subliniind
utilizarea acestora n a treia i a patra etap de diagnostic

n capitolele urmtoare (11-13) vom prezenta o parte din elementele

care definesc complexitatea etapei de identificare a
microorganismelor iar n capitolul 14 vom discuta o parte dintre
modalitile de stabilire a sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice (antibacteriene sau antifungice) cu ajutorul crora,
dup ncheierea unui diagnostic corect microbiologic, putem stabili
n mod tiinific tratamentul antimicrobian ce trebuie prescris unui
anumit pacient care prezint o boal infecioas de etiologie
bacterian sau fungic.

Aa cum am menionat i n capitolul 9, tehnicile de cultivare

urmresc trei obiective:

obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ

pentru scopul propus

prevenirea contaminrii produsului cercetat cu alte

microorganisme i

izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui

produs plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi
pure.

Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrui

microorganism.

Este esenial s se neleag necesitatea obinerii coloniilor izolate

precum i a culturilor pure n diagnosticul de laborator bacteriologic
i micologic (direct). n cazul n care coloniile izolate reprezint o
cultur pur (format din acelai tip de microorganism), aceasta va
fi utilizat n vederea identificrii agentului etiologic (bacteria
izolat de la un pacient cu o presupus boal infecioas) precum i
la efectuarea antibiogramei n vederea stabilirii tratamentului
intit (antibioticul la care bacteria izolat este sensibil). n
situaia n care nu s-a reuit obinerea culturii pure, pornind de la
coloniile obinute se vor face repicri pe medii de cultur
neselective.

Obinerea de colonii bacteriene izolate dintr-un produs patologic se

poate realiza prin epuizarea inoculului pe mediile de cultur
folosind:

- ansa bacteriologic

- pipeta Pasteur

- tamponul de vat montat pe o tij

- bagheta de sticl n form de L

- alte tehnici de nsmnare.

Ansa bacteriologic trebuie sterilizat nainte i dup fiecare

utilizare a sa prin nclzirea pn la incandescen (la rou) a
buclei i firului urmat de flambarea portansei, pe cnd celelalte
ustensile pentru nsmnare vor fi sterilizate prin alte metode (vezi
capitolul 4).

Obinerea coloniilor izolate prin epuizarea inoculului cu ansa

bacteriologic

nsmnarea n pentagon deschis a mediului solid aflat ntr-o

plac Petri folosind ansa bacteriologic, pentru obinerea de colonii
bacteriene izolate, pornind de la un produs patologic recoltat i
transportat ctre laborator ntr-o eprubet / tub nchis cu dop de
vat include urmtoarele etape:

atenie: toate activitile se desfoar n stricta vecintate a

becului de gaz !

atenie: pe suprafaa mediului de cultur poate exista lichid

de condens care ar putea facilita contaminarea culturii bacteriene;
este necesar ca placa Petri cu mediu de cultur pe care dorim s
facem cultivarea s fie meninut n termostat, cu mediul n sus,
ntredeschis, pentru evaporarea condensului !
 se sterilizeaz ansa bacteriologic la flacra becului de gaz
prin aducerea la incandescen a buclei i firului ansei urmat de
flambarea portansei (trecere prin flacr de 2-3 ori)

se noteaz pe placa cu mediu de cultur data inoculrii,

numrul de identificare i tipul produsului (tipul produsului poate fi
inclus printr-un simbol n numrul unic de identificare)

se ia eprubeta cu produs patologic n mna stng (n cazul n

care fiind dreptaci, ansa bacteriologic este inut n mna dreapt,
ca un creion), se scoate dopul eprubetei utiliznd n acest scop
degetele 4-5 de la mna dreapt

atenie: s nu se scape dopul din mn = pericol de

contaminare a mesei de lucru !

atenie: dopul nu trebuie strns n podul palmei = pericol de

contaminare !

se flambeaz gura eprubetei (trecere prin flacr de 2-3 ori,

imprimnd o uoar micare de rotire n ambele sensuri)

se introduce ansa n eprubet fr s se ating gura sau

pereii acesteia n partea superioar, se rcete bucla pe pereii
eprubetei n vecintatea produsului patologic i se ncarc bucla
ansei din profunzimea produsului patologic, recoltnd fragmente
care ar putea include cu o mai mare probabilitate bacterii implicate
n procesul infecios (ex. poriuni cu aspect purulent)

se scoate ansa fr sa atingem pereii sau gura eprubetei

atenie: contaminarea pereilor eprubetei n poriunea n care

se va monta dopul, va duce la contaminarea dopului i respectiv la
o mare probabilitate de contaminarea a celui care va utiliza ulterior
eprubeta / tubul cu produs patologic

se flambeaz gura eprubetei

se monteaz dopul la eprubet printr-o micare de rsucire ce

are ca scop fixarea lui

atenie: gura eprubetei poate fi fierbinte dup flambare !

atenie: n toat aceast perioad se contraindic efectuarea

unor micri brute cu ansa ncrcat cu produs patologic; micrile
brute i necontrolate pot determina contaminarea cu produs
patologic a mesei de lucru, a mediului de lucru sau a celui care
manipuleaz produsul patologic !
 dup ce eprubeta a fost aezat n stativ, mna stng
eliberat va lua o plac Petri pe care o va aeza pe mas cu capacul
n jos i mediul n sus

tot cu mna stng se va deschide placa iar cu ansa ncrcat

cu produs patologic se vor trasa linii (striuri) aproximativ paralele
ntre ele, ca un zig-zag (fr a se ridica ansa de pe mediul de
cultur) reprezentnd o prim latur a unui pentagon deschis

se nchide placa Petri

ansa se sterilizeaz la flacr, portansa se flambeaz

se rcete ansa (se poate ncerca rcirea ei prin atingere pe

suprafaa mediului solid steril, nensmnat, lng peretele
exterior al plcii Petri)

fr s se mai ncarce ansa cu produs patologic se traseaz a

doua latur a pentagonului intersectnd-o pe prima, tot ca linii
paralele, dup care ansa se va steriliza din nou

se va proceda la fel ca mai sus i pentru urmtoarele laturi

avnd grij s nu se uneasc ultima latur cu prima latur

n momentul interesectrii cu ansa a laturii precedente a

poligonului, ansa este rencrcat cu microorganisme, dar n
cantitate din ce n ce mai mic, pn ce se va ajunge la cteva
celule microbiene izolate care, diseminate pe plac vor da natere la
colonii microbiene izolate

se introduce placa Petri pe care a fost realizat cultivarea n

termostat, rsturnat (cu mediul n sus i capacul n jos), la
temperatura optim multiplicrii microorganismului suspectat
(pentru cele mai multe bacterii termostatul va fi reglat pentru o
temperatur de 35-37C, pentru fungi la 28C)

dup o perioad de incubare de 18-24 ore (pentru cele mai

multe dintre microorganismele studiate), pe prima latur se va
obine cea mai important cantitate de cultur (cultur microbian
confluent), pe urmtoarele laturi se va remarca scderea
cantitativ a culturii iar cel puin pe ultima latur a pentagonului
deschis se vor obine colonii izolate.

Dac mediul de cultur pe care s-a realizat cultivarea n pentagon

deschis este neselectiv, coloniile izolate obinute pot fi utilizate n
etapele ulterioare (identificare prin diferite metode, testarea
sensibilitii la antibiotice i chimioterapice). n cazul n care cultura
primar este obinut pe un mediu selectiv, este obligatorie
repicarea coloniilor izolate deoarece coloniile izolate vizibile pot fi
asociate cu microorganisme inhibate datorit selectivitii mediului,
care nu se vd cu ochiul liber sau cu lupa i care se vor multiplica pe
mediile de identificare fcnd imposibil interpretarea rezultatelor.

Tehnica descris este o tehnic de baz i cu anumite modificri se

poate utiliza i n alte situaii (spre exemplu atunci cnd produsul
patologic este recoltat n alte tipuri de recipiente).

Alte tehnici de cultivare (nsmnare)

Am ales pentru o prezentare amnunit tehnica obinerii coloniilor

izolate prin epuizarea inoculului cu ansa bacteriologic
(nsmnarea n pentagon deschis) deoarece considerm c
aceast reprezint o tehnic esenial, care poate fi reinut nc din
al doilea an de studiu). n continuare vom prezenta alte tehnici de
cultivare, fr a epuiza toate variantele posibile.

nsmnarea cu ansa calibrat

se poate utiliza pentru urocultura i n alte scopuri n care

aproximarea numrului de microorganisme dezvoltate pe mediul de
cultur este util

putem utiliza anse de platin sau anse de unic folosin

pentru 0,01 sau pentru 0,001 ml / calibrul anselor de platin trebuie
verificat n fiecare lun

urina recoltat corespunztor (vezi capitolele 6 i 29) se

omogenizeaz prin rsturnarea de cteva ori a recipientului de
recoltare (nchis etan)

respectnd regulile lucrului aseptic, nclinm recipientul de

colectare n aa fel nct s putem s punem bucla ansei, paralel pe
suprafaa urinei i s prelevm p.p.

pe o plac Petri cu mediul de cultur se descarc urina n

striu, pe unul dintre diametre; apoi epuizm inoculul pe toat
suprafaa plcii n striuri perpendiculare pe striul de descrcare,
cu micri de zig-zag
 dup incubare, n ziua urmtoare vom numra coloniile
aprute i spre exemplu vom nmuli numrul de colonii cu 1000
dac am utilizat pentru nsmnare ansa de 0,001 ml

din motive economice putem s realizm nsmnarea n mod

asemntor a urinei pe o jumtate sau chiar pe o ptrime de plac.

nsmnarea cu tamponul sau cu bagheta de sticl n L

aceste tehnici se pot folosi att pornind de la produs patologic

(metod preferat n unele laboratoare) ct i de la colonii care sunt
utilizate pentru obinerea de cultur pur

nsmnarea cu tamponul poate fi folosit i pentru

realizarea antibiogramei difuzimetrice

vom prezenta n continuare varianta n care se utilizeaz

tamponul pentru cultivarea unui produs patologic (exsudat faringian
etc), presupunnd c suntem dreptaci

notm pe placa cu mediu de cultur data inoculrii, numrul

de identificare i tipul produsului (tipul produsului poate fi inclus
printr-un simbol n numrul unic de identificare) nu vom mai nota
aceast etap la prezentarea urmtoarelor tehnici dar menionm
acum faptul c este obligatorie, de fiecare dat; alte lucruri cu
importan general, menionate la tehnica obinerii coloniilor
izolate prin epuizarea inocului cu ansa bacteriologic rmn valabile

scoatem tamponul din tubul protector cu primele trei degete

de la mna dreapt

flambm gura tubului protector i l aezm pe un stativ

cu mna stng lum o plac Petri (care nu mai prezint lichid

de condens interior) pe care o aezm pe mas cu capacul n jos i
mediul n sus

tot cu mna stng deschidem placa iar cu dreapta descrcm

tamponul ncrcat cu produs patologic (exist mai multe modaliti
de descrcare a tamponului, dintre care vom prezenta dou)

descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe o raz a plcii,

urmnd ca s dispersm produsul cu o baghet de sticl n L,
steril, pe toat suprafaa plcii

descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe un cadran al

plcii, urmnd ca s dispersm produsul cu ansa bacteriologic n
celelalte cadrane, ca n metoda pentagonului deschis (dup
nsuirea tehnicii, pentru economie, se poate realiza cultivarea pe
jumtatea unei plci).

Tehnica diluiilor succesive n lichidul de condens al mediilor solide

mediul de cultur este turnat n eprubete sau tuburi; utilizm

mai multe eprubete

prelevm cu ansa p.p. i l descrcm n pictura de lichid de

condens al primului tub

fr s ncrcm din nou ansa cu p.p. o descrcm n pictura

de condens a celui de al doilea tub .a.m.d

dup nsmnare, nclinm eprubetele pentru a sclda

suprafaa mediului nclinat, cu pictura respectiv de lichid de
condens, realiznd n acest mod dispersia microorganismelor din
pictura de inocul, pe suprafaa mediului.

Tehnica epuizrii ansei pe medii solide

const n efectuarea unei serii de nsmnri cu ansa

bacteriologic ncrcat o singur dat cu amestecul de
microorganisme, ntr-un ir de eprubete cu geloz nclinat, fr a
steriliza sau a rencrca ansa bacteriologic pe parcurs

nsmnm pornind de la baza eprubetei, atingnd mediul i

urcnd prin descrierea unor striuri n zig-zag, pentru fiecare
eprubet n parte

realizm astfel o epuizare a coninutului ansei, n final,

ajungnd s nsmnm numai cteva celule microbiene, din care
vor aprea dup incubare colonii izolate.

nsmnarea prin nepare a mediului turnat n tuburi sau eprubete

metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale

unor tulpini considerate reprezentative, a tulpinilor de colecie, a
tulpinilor de referin, pentru nsmnarea unor medii multitest
(TSI, MIU etc) etc

se prefer utilizarea unei anse fir, sau a unei anse cu o bucl

mic (dup caz)

n funcie de scopul urmrit exist anumite variante ale

acestei tehnici, iar tuburile (eprubetele) utilizate au dimensiuni
diferite i o cantitate de mediu care difer (respectnd protocolul de
lucru corespunztor)
 spre exemplu n cazul nsmnrii mediului TSI

se utilizeaz tuburi de dimensiuni mici, cantitatea de mediu

utilizat pentru un tub fiind de 3 ml

iniial se nsmneaz partea dreapt prin nepare, fr a

se atinge baza tubului

ulterior se nsmneaz partea nclinat prin realizarea

unor striuri n zig-zag, atingnd suprafaa mediului.

nsmnarea cu seringa

produsele lichide (n special snge, pentru hemocultur dar i

alte p.p.) se pot nsmna direct cu seringa cu care s-a fcut
recoltarea

nsmnarea cu pipeta (Pasteur sau pipeta gradat, dup caz)

la deschiderea i nchiderea recipientelor flambm gura

fiecruia n parte, aa cum am prezentat mai sus

nainte de a folosi pipeta, dei sterilizat n prealabil, o vom

flamba prin trecere pe toat lungimea prin flacr

pentru a preleva p.p. din recipientul de transport precum i

pentru nsmnare n mediul lichid sau solid, folosim un dispozitiv
ct de simplu (este contraindicat aspirarea cu gura)

dup ncheierea nsmnrii eliminm lichidul rmas eventual

n pipet n flaconul cu amestec sulfo-cromic, introducem pipeta n
amestecul sulfo-cromic i aspirm soluia dezinfectant pn
aproape de dopul de vat al pipetei

toate pipetrile se realizeaz cu ajutorul dispozitivului adaptat

la pipet

pipeta va fi meninut timp de 24 ore n amestecul sulfo-

cromic.

nsmnarea cu pipeta, prin inundare

reprezint o variant a tehnicii prezentate mai sus

se poate folosi pentru depunerea inoculului n vederea

realizrii antibiogramei difuzimetrice, pentru verificarea sensibilitii
la bacteriofag (lizotipie) etc

dup ncrcarea pipetei cu cultura pur, inoculul se descarc

pe suprafaa mediului solid din placa Petri, apoi se nclin n mod
repetat placa pentru nsmnarea uniform a suprafeei mediului

excesul de inocul se aspir cu pipeta Pasteur i se descarc n

soluia dezinfectant

placa se las apoi lng flacr pentru uscare, cu capacul

ntredeschis.

Tehnica diluiilor succesive n medii lichide

poate fi folosit pentru diluare unor suspensii antigenice,

seruri, fagi etc

n acest scop folosim un ir de eprubete; n toate eprubetele

repartizm cu aceeai pipet o cantitate constant soluie salin
fiziologic (0,9 ml n fiecare eprubet)

pipetele gradate sterile i mpachetate n hrtie se desfac n

momentul utilizrii n modul urmtor: rupem hrtia chiar la mijlocul
pipetei, printr-o micare de rsucire n sens opus a celor dou mini;
tragem partea de hrtie care se termin cu un capt rsucit liber
(corespunde poriunii superioare a pipetei), de care vom ine pipeta
n timpul lucrului; scoatem a doua jumtate a hrtiei fr a atinge
partea efilat a pipetei i astfel pipeta rmne steril pentru lucru

cu o alt pipet prelevm 0,1 ml din cantitatea de suspensie

microbian i introducem inoculul n prima eprubet; aspirm i
eliminm lichidul din pipet de cteva ori pentru omogenizarea
suspensiei; apoi punem pipeta se pune n amestec sulfocromic

lum o nou pipet cu care aspirm 0,1 ml lichid din tubul 1 i

introducem acest lichid n tubul 2, aa cum am menionat mai sus;
schimbm pipeta i repetm manevra pn la ultimul tub; din ultimul
tub scoatem 0,1 ml pe care i eliminm n amestecul dezinfectant

Cteva tehnici de izolare speciale

1. Metode fizice

nclzirea n baie de ap, timp de 10 minute la 80C a p.p.

recoltat n mod corespunztor i suspensionat n bulion VF (mediu
anaerob) din care se dorete izolarea unor germenii sporulai
anaerobi

2. Metode chimice

utilizarea mediilor selective sau a mediilor de mbogire

 adugarea la 1 ml de p.p. recoltat n mod corespunztor (i
suspensionat n bulion VF) a 1 ml de alcool etilic de 95 urmat de
agitarea tubului timp de o or la temperatura camerei; produsul
rezultat se nsmneaz pe medii anaerobe, pentru izolarea unor
germeni sporulai

3. Metode biologice

inocularea sputei n care se suspecteaz prezena S.

pneumoniae la oarecele alb

dup 1-4 zile de la inoculare, oarecele face o infecie

septicemic cu pneumococ

se poate izola o cultur pur de pneumococ din snge, cord,

splin, ficat etc.

Aplicarea acestor tehnici va fi discutat n capitolelor urmtoare, iar

unele dintre tehnici vor putea fi executate sau prezentate
demonstrativ n cadrul lucrrilor practice.

11. Examinarea caracterelor de cultur, metabolice precum i a altor

caractere fenotipice utile n identificarea microorganismelor

n capitolul 5 am prezentat Schema general a diagnosticului de

laborator microbiologic i pe aceast schem am ncercat s
evolum, adugnd treptat noi date teoretice i practice. n acest
capitol vom continua discutarea celei de a 4-a etape a diagnosticului
direct (care include i verificarea din punct de vedere microscopic a
coloniilor izolate), strict necesar pentru identificarea
microorganismelor izolate de la pacienii cu boli transmisibile.

Iniial vom relua cteva definiii i elemente teoretice urmnd ca mai

departe s prezentm principalele caractere studiate n unele dintre
sub-etapele acestui moment diagnostic, mai precis caracterele de
cultur, cteva noiuni privind caracterele biochimice, metabolice,
de patogenitate; n cursul lucrrilor practice se va discuta i despre
alte caractere microbiene.

Definiii i alte aspecte teoretice

Colonia izolat

Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii.

Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei
singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian.
Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii
prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul), aa cum a
fost prezentat n capitolul 10.

Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n

condiiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor
bacteriene se dezvolt i duc la apariia unei culturi n circa 18-24 de
ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare asigurat n
termostat (de regul 35-37C). Pentru bacteriile care necesit o
atmosfer de 3-5% CO2 (carboxifile), plcile cultivate se vor pune n
exsicator, mpreun cu o lumnare aprins. Pentru bacteriile strict
anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz. O mare parte
dintre fungi, n special levuri, au temperatura optim de dezvoltarea
n jurul a 28-30C.

Dezvoltarea microorganismelor pe medii de cultur poate permite

evaluarea anumitor aspecte macroscopice sau microscopice (ex.
coloniile produse de Mycoplasma spp.) care pot reprezenta, dup
caz, modaliti de identificare sau de orientare n alegerea
algoritmului de identificare. Caracterele de cultur includ:

necesitile specifice n vederea cultivrii

bacterii nepretenioase (care se pot cultiva pe medii simple

ex. E. coli)

bacterii pretenioase (care necesit medii complexe,

mbogite sau / i adugarea n medii a unor factori de cretere ex.
Haemophilus influenzae)

bacterii strict aerobe (Bordetella pertussis), aerobe facultativ

anaerobe (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc), carboxifile (S.
pneumoniae etc), microaerofile (Campylobacter spp., etc), strict
anaerobe (Clostridium spp.)

temperatura optim de cultivare (20-30C pentru Listeria

monocytogenes, 42C pentru Campylobacter jejuni, 35-37C pentru
majoritatea bacteriilor, 28-30 pentru unele levuri etc)

intervalul de timp pentru apariia coloniilor izolate, n funcie

de timpul de generaie

18-24 ore pentru majoritatea bacteriilor

24-48 ore pentru majoritatea fungilor

sptmni pentru Mycobacterium tuberculosis etc

aspectul, consistena i aderena coloniilor / culturii

 modificrile aprute pe mediu n vecintatea coloniilor /
culturii etc.

Examinarea culturilor / coloniilor izolate este un proces foarte

important, necesit cunoaterea teoriei, mult exerciiu, atenie i
experien. Pentru a obine cele mai bune rezultate este necesar o
bun iluminare (preferabil lumina natural) iar iluminarea mediului
care urmeaz a fi citit se va face cel puin i n inciden oblic.
Examinarea se poate face cu ochiul liber (cel puin iniial) dar ar
trebui completat cu examinarea fcut cu ajutorul unei lupe sau a
unui stereomicroscop pentru a putea nregistra toate aspectele
importante i pentru a putea sesiza apariia coloniilor de dimensiuni
mici sau foarte mici.

Aspectul culturilor pe medii lichide

Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de

lichid, tulburndu-l. Bacteriile strict aerobe se dezvolt
preponderent la suprafaa mediului.

Se accept c de obicei tulpinile care pe mediile solide formeaz

colonii de tip S tulbur omogen mediul (majoritatea bacteriilor) n
timp ce tulpinile care formeaz colonii de tip R realizeaz o
tulburare mai puin omogen. Variantele R pot lsa mediul
limpede, formnd flocoane care se depun sau un strat (vl) la
suprafaa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul
tuberculos).

n urma dezvoltrii microorganismelor n medii de cultur lichide se

mai pot remarca i pigmentogeneza (ex. Pseudomonas aeruginosa)
sau utiliznd simul olfactiv se poate constata apariia unui miros
caracteristic (ex. un miros de corn ars n cazul clostridiilor).

Vom prezenta cteva exemple, menionnd c exist i variaii de la

regul:

mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.)

mediul este clar, cu depozit grunjos pe perei i la baza tubului

(ex. S. pyogenes)

mediul este clar, cu vl la suprafa (V. cholerae n ap

peptonat alcalin)

dezvoltarea culturii se realizeaz ca un inel aderent de

pereii tubului, la suprafaa mediului (ex. E. coli)
 mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la
suprafa (ex. Bacillus subtilis)

mediul este clar cu apariia unui depozit floconos aderent la

baza tubului (B. anthracis)

mediul este clar, iar la suprafa se dezvolt o membran

groas, plisat (M. tuberculosis).

Aspectul culturilor pe medii solide

Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n

identificarea bacteriilor. Aspectul coloniilor variaz n funcie de
microorganismul implicat, fr a permite diferenieri de specie
definitive (dar au utilitate n contextul studierii tuturor caracterelor);
n anumite cazuri sugereaz diagnosticul, dar ntotdeauna
orienteaz spre alte testri necesare.

Trebuie s examinm urmtoarele elemente:

dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm aa cum se

formeaz n cazul Staphylococcus spp., K. pneumoniae etc sau n
cazul levurilor; medii, de circa 1-2 mm pentru multe dintre bacteriile
studiate; mici, sub 1 mm, spre exemplu n cazul Streptococcus
viridans, etc i foarte mici, care se pot examina cu ajutorul
stereomicroscopului, aa cum se ntmpl n cazul Mycoplasma spp.
sau Ureaplasma spp.)

marginile (regulate, neregulate, ntregi, circulare, erodate,

zimate, ondulate, lobate, filamentoase, acoperite cu miceliu pufos,
invadnd mediul n valuri etc)

forma (punctiform, circular, neregulat, dendritic,

filamentoas, lenticular)

relieful (plat, acuminat, convex, bombat, ombilicat, papilat)

suprafaa (neted, umed, lucioas, mat, uscat, granular,

rugoas, papilat, zbrcit, mucoid, pufoas etc)

culoarea (pigmentate, pigmentarea este la nivelul coloniei sau

al mediului, nepigmentate; acest caracter depinde de pigmenii
produi sau / i de indicatori de culoare din mediu)

opacitatea (transparente, semitransparente, opace)

consistena, aderena la mediu (examinate de ex. cu ajutorul

ansei bacteriologice)
 alte caractere, care vor fi prezentate n continuare.

Tipuri de colonii

Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, umed, margini

circulare i adesea aspect strlucitor. Germenii pstreaz structura
antigenic i nu aglutineaz spontan cu soluie salin fiziologic.
Germenii capsulai i pstreaz capsula. Virulena este conservat.
Majoritatea bacteriilor studiate precum i levurile formeaz colonii
de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli, Candida albicans etc).

Colonia R (rough) este plat, mat, uscat, suprafaa ei prezint

rugoziti, marginile sunt crenelate (zimate). Structura antigenic
nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu este
conservat (excepii B. anthracis, M. tuberculosis, C. diphteriae).

Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, umed, mucoas. Este

dat de exemplu de bacteriile care prezint capsul (exemplu
Klebsiella pneumoniae).

Aspecte particulare

fenomenul de invazie, reprezint un caracter de identificare

preliminar pentru Proteus spp., o bacterie foarte mobil; dac
nsmnm o tulpin care aparine acestui gen la periferia unei
plci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%), de la locul nsmnrii
cultura se dezvolt n valuri concentrice (se ntinde din aproape n
aproape) pe toat suprafaa mediului; pe anumite medii selective,
invazia este inhibat i se pot obine colonii izolate (adugm la
mediul de cultur acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc)

fenomenul liniei de demarcaie, reprezint un caracter util

n studii epidemiologice, n cazul n care tulpinile implicate aparin
genului Proteus; dac pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini
diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadnd pn
la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie
de demarcaie ntre cele 2 tulpini (distan de 1-2 milimetri); dac
tulpinile nu sunt diferite va avea loc creterea n valuri fr
demarcaie cu dezvoltarea unei pnze continue de cultur

fenomenul de crare, reprezint o variant de izolare n

cultur pur a unei tulpini de Proteus; cultivarea unui produs
patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat
incubat n poziie vertical va conduce (n cazul n care n p. p. exist
o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi pure
de Proteus, care se va dezvolta n valuri suprapuse pn la partea
superioar a mediului de cultur

apariia coloniilor n cap de meduz / coam de leu,

aspect care poate fi caracteristic n cazul izolrii unei tulpini de
Bacillus anthracis; coloniile sunt mari, alb-cenuii, de tip R, iar la
periferia coloniei, cu ajutorul unei lupe, se pot observa prelungiri
ondulate care au dus la denumirile menionate mai sus

apariia coloniilor pufoase, spre exemplu pe mediul

Sabouraud, la 28-30 C, dup circa 7 zile, coloniile de Coccidioides
immitis dezvolt un miceliu aerian, devin pufoase, cresc i acoper
n cteva zile suprafaa mediului; iniial albe, devin n timp galben-
maronii; colonii pufoase pot aprea i n cursul dezvoltrii n
anaerobioz a unei tulpini de Clostridium tetani etc.

Caractere metabolice

Exist numeroase teste care permit investigarea acestor caractere

ale microorganismelor. n continuare vom prezenta doar cteva
dintre aceste teste (vezi i capitolul 12 precum i diferite capitole
din partea special). n capitolul 11 vom mai discuta i despre cteva
dintre testele care evideniaz caractere de patogenitate ale
bacteriilor sau fungilor. Este de remarcat faptul c unele dintre
testele care vor fi discutate ar putea fi incluse att n grupul
caracterelor metabolice ct i n grupul caracterelor de patogenitate
(ex. hemoliza n cazul anumitor microorganisme, producerea unor
enzime cu caracter de toxine etc).

1. Pigmentogeneza

Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este

dependent de condiiile de cultivare. Poate reprezenta un element
util pentru identificare (de exemplu pentru Pseudomonas aeruginosa
sau pentru Staphylococcus spp.).

Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi cromofore (pigmentul

este legat n citoplasm); paracromofore (pigmentul este prezent n
perete sau n stratul mucos, de exemplu pigmentul auriu la S.
aureus, pigmentul galben-citrin la S. saprophyticus); cromopare
(pigmentul albastru, sau galben-verzui, sau de alt culoare este
difuzibil n mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa).

Fungii pot produce o serie de pigmeni, spre exemplu coloniile de

Candida albicans au culoare alb. Mucegaiurile produc o varietate
mult mai mare de pigmeni (ex. Aspergillus deflectus colonii cenuii
cu periferia roz sau cu pete galbene, Aspergillus flavus colonii
galben verzui pn la verde nchis iar privite pe partea cealalt a
plcii sunt roii-brune, Aspergillus fumigatus colonii iniial albe
care devin albastre-verzui sau albastre iar privite pe cealalalt parte
a plcii sunt colorate brun sau n alte culori, Aspergillus niger
colonii iniial albe care devin brun negre pstrnd o culoare alb pe
circumferin iar privite pe cealalalt parte a plcii sunt colorate n
galben etc).

2. Producerea unor hemolizine

Unele microorganisme produc enzime (hemolizine) care lizeaz

hematiile din mediile de cultur cu snge. Hemoliza are diferite
aspecte n funcie de mecanismul de aciune i specia de origine a
hematiilor (cal, berbec, iepure etc). Cteva exemple de hemolizine:

1. a-hemolizina produce o liz incomplet a hematiilor, zona avnd o

culoare verzuie (ex. Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae)

2. a-hemolizina produce liza hematiilor n 2 zone, n apropierea

coloniei exist un halou de hemoliz incomplet nconjurat de o zon
de hemoliz complet (ex. unele tulpini de Streptococcus spp.)

3. b-hemolizina produce liza complet a hematiilor, zona de

hemoliz este clar (ex. Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus,
Listeria monocytogenes, Haemophilus ducreyi)

4. b-hemolizina care produce o hemoliz de tip cald-rece (zone de

hemoliz incomplet la 37C care, dup meninerea culturii la +4C
timp de cteva ore, devine complet; ex. anumite tulpini de
Staphylococcus aureus)

5. g-hemolizina produs de Staphylococcus spp. lizeaz de iepure,

om, oaie, dar nu produce zone de hemoliz pe agar-snge; n cazul
streptococilor, g-hemoliza indic absena hemolizei.

3. Producerea altor enzime

catalaz (ex. Mycobacterium spp., Staphylococcus spp.)

carbohidraze (evideniate pe medii difereniale, vezi capitolele

12 i 28-34)

gelatinaz (cultura microbian lichefiaz gelatina, ex.

Clostridium perfringens)

lecitinaz (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.)

 nitrat-reductaz (ex. Mycobacterium spp.)

oxidaz (ex. Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae,

Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae)

termonucleaz (ex. Staphylococcus aureus) etc.

4. Alte caractere metabolice

aciunea reductoare (evideniat de ex. la C. diphteriae

cultivat pe mediu cu telurit de K)

sensibilitatea la diferite temperaturi

tolerana la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplic la pH

alcalin)

tolerana la o anumit concentraie de NaCl (ex.

Staphylococcus aureus)

sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau la

bacitracin (ex. S. pyogenes) etc.

Caractere de patogenitate

Patogenitatea reprezint capacitatea unui germen de a declana n

organismul gazd fenomene morbide, patogene, modificri locale,
generale i functio laesa. Patogenitatea este un atribut de specie
i este determinat genetic. Virulena reprezint gradul diferit de
patogenitate exprimat n cadrul unei specii. Este un atribut al
tulpinii microbiene implicate.

Caracterele de patogenitate pot fi evideniate in vitro sau in vivo.

Teste efectuate in vitro

examinarea aspectului coloniilor (majoritatea speciilor

bacteriene sunt patogene n forma S, cu excepia bacililor
antraxului, difteric i tuberculos); are aspect orientativ

efectuarea anumitor teste biochimice / metabolice, cu aspect

orientativ (examinarea pigmentogenezei, fermentarea manitei,
testul coagulazei, testul fibrinolizei, producerea de hemolizite etc);
dintre testele menionate este de luat n consideraie n primul rnd
testul coagulazei

evidenierea producerii unor toxine

endotoxine (testul Limulus; prezena endotoxinei produce

gelificarea unui lizat de Limulus polyphemus)

exotoxine (testul ELEK / vezi capitolul 16, ELISA, efecte

citopatice, testul producerii de lecitinaz, testul plcilor semi-
neutralizate etc).

Teste efectuate in vivo

n acest scop se utilizeaz animale de laborator sensibile fa de

infecia experimental cu diferite microorganisme sau fa de
anumite toxine microbiene (ex. oareci albi, cobai, iepuri, pisici etc.,
n funcie de specia microbian pentru care se efectueaz testul /
specia de animal cea mai sensibil i calea de inoculare cea mai
potrivit). Animalele de laborator trebuie s fie sntoase,
verificarea se face prin examinarea acestora nainte de efectuarea
testrii, pe parcursul a 10-14 zile. Dup inoculare, animalele sunt
marcate i inute sub observaie (ferite de orice contaminare);
observaia este clinic urmrindu-se evoluia curbei febrile i
apariia semnelor de boal. Pentru orice test se recomand
utilizarea unui lot de animale pentru acelai tip de inoculare, ceea ce
crete suplimentar costul acestui tip de testare. n continuare vom
prezenta cteva exemple:

identificarea Bacillus anthracis: pregtim o suspensie a tulpinii

care urmeaz a fi testat n soluie salin fiziologic i injectm
subcutanat, cte 0,2 ml pentru fiecare animal, la un lot de oareci
albi; urmrim evoluia timp de 2-3 zile i efectum frotiuri din
sngele recoltat prin puncionarea cordului sau amprente de splin

testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium

diphteriae: obinem o cultur de 24 ore a tulpinii de identificat;
inoculm subcutanat, n regiunea abdominal cte 2-5 ml de cultur
pentru fiecare animal, la 2 loturi de cobai (un lot neprotejat, al
doilea lot protejat cu cte 1000 UI de ser antidifteric pentru fiecare
animal); n cazul n care tulpina este toxigen, animalele neprotejate
vor muri n 1-4 zile, cu semne de intoxicaie difteric (congestia
capsulelor suprarenale, lichid seros, serofibrinos sau fibrinos n
pleur, pericard, peritoneu i edem gelatinos la locul de inoculare) n
timp ce animalele protejate nu prezint nici o reacie

toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare

cu Clostridium botulinum: se obine supernatant dup centrifugarea
unor produse patologice sau alimentelor incriminate i triturate la
care se adaug antibiotice pentru a inhiba multiplicarea florei de
asociaie; se va utiliza supernatant ca atare i supernatant dup
meninere timp de 15 minute la 100C (i rcire) toxina botulinic
fiind termolabil; se vor inocula 4 loturi de oareci (0,5 ml / oarece)
sau cobai (1 ml / cobai) dup cum urmeaz

supernatant ca atare

supernatant inactivat

0,1 ml ser antitoxin A urmat la 30 minute de supernatant

0,1 ml ser antitoxin B urmat la 30 minute de supernatant

spre exemplu, n cazul n care animalele din loturile 1 i 4 mor,

iar animalele din loturile 2 i 3 supravieuiesc, n p.p. exist toxin
botulinic de tip A

identificarea infeciei pulmonare cu Streptoccus pneumoniae

sau cu Klebsiella pneumoniae: realizm un amestec de sput i
soluie salin fiziologic steril i inoculm subcutanat sau
intraperitoneal cte 5 ml de p.p. pentru un animal, la un lot de
oareci albi; prezena microorganismului va produce n 24-48 de ore
o septicemie mortal; facem frotiuri i culturi din sngele recoltat
prin puncie cardiac, lichid peritoneal i amprent de splin; pentru
determinarea tipului capsular putem face reacia de umflare a
capsulei (vezi capitolul 12)

identificarea etiologiei stafilococice a unei toxi-infecii

alimentare (producerea enterotoxinei): dup ce se obine n cultur
tulpina de stafilococ (pornind de la materii fecale, lichid de
vrstur, alimente) se repic n agar 0,5% i se incubeaz 48 ore n
atmosfer de CO2; se filtreaz mediul iar lichidul obinut se menine
la temperatura de fierbere timp de 30 minute (enterotoxina este
termostabil); testul Dolman se face la pisoi de 2-3 luni la care se
inoculeaz intraperitoneal 1-3 ml din filtratul rcit; dup 20-120
minute, n cazul prezenei enterotoxinei apare o stare de nelinite,
agitaie urmate de diaree, vrsturi i somnolen; dup 1-2 zile
animalele inoculate i revin

cercetarea patogenitii unei tulpini de stafilococ se face la

iepure, care este animalul de laborator cel mai sensibil la infecia
experimental cu Staphylococcus aureus

testarea patogenitii unor levuri (ex. Candida albicans):

pornind de la o cultur de 24 de ore n mediul Sabouraud lichid
separm sedimentul i realizm o suspensie 0,2% a acestuia n
soluie salin fiziologic steril; inoculm n venele cozii la un lot de
oareci (cte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) suspensia obinut i
urmrim evoluia animalelor timp de 4-10 zile; dac este vorba de o
tulpin de C. albicans patogen, animalele vor muri dup circa 1
sptmn (anatomopatologic vom putea evidenia abcese miliare
renale, splenice, hepatice) etc.

12. Teste de identificare avnd la baz diferite caractere biochimice

ale bacteriilor i fungilor

Exist numeroase teste utile n identificarea bacteriilor i fungilor,

avnd la baz diferite proprieti biochimice ale acestora; cteva
dintre teste vor fi prezentate n continuare.

Aceste teste de identificare au o importan diferit la diferitele

genuri i specii bacteriene i respectiv fungice i fac parte din
etapa a patra a diagnosticului de laborator bacteriologic sau
micologic. Schema de prezentare este ns asemntoare.

12. 1. Utilizarea unui carbohidrat ca unic surs de carbon

Auxanograma

Principiu:

Diferitele levuri prezint un anumit echipament enzimatic cu ajutorul

cruia pot, spre exemplu, s utilizeze un anumit carbohidrat ca unic
surs de carbon. Dezvoltarea unei levuri pe un mediu n care este
inclus un singur carbohidrat demonstreaz utilizarea acestuia ca
unic surs de carbon (asimilarea carbohidratului respectiv). n mod
asemntor se poate testa capacitatea asimilrii unor substane
azotate de ctre levuri.

Materiale necesare:

cultura pur a levurii de identificat, pe pant de agar

Sabouraud

mediu pentru asimilarea carbonului de ctre levuri

soluie de vitamine

soluii 5% ale carbohidrailor (ex. glucoz, maltoz, zaharoz,

lactoz, galactoz, trehaloz etc) n ap distilat, sterilizate prin
filtrare

rondele din hrtie de filtru, sterile (diametru 6 milimetri)

Tehnica de lucru:

Cultura fungic este suspensionat n 5 ml de ap distilat steril.

Mediul de cultur pentru asimilarea carbonului este nclzit pn la
topire i apoi rcit la 50C. ntr-un tub steril cu capacitatea de 30 ml
introducem aseptic 20 ml de mediu, 2 ml soluie de vitamine i 0,25
ml din suspensia fungic (levuric) dup care amestecul este turnat
ntr-o plac Petri steril i se ateapt solidificarea mediului
mpreun cu celelalte componente.

Depunem aseptic 5 rondele din hrtie de filtru, una n centru i 4

spre periferia fiecrui cadran al plcii i imediat, utiliznd o ans cu
diametrul buclei de 3 mm, depunem pe fiecare dintre rondele ceea
ce vom preleva din diferite (5) soluii de carbohidrai

obligatoriu vom preleva din soluia de glucoz

dac dorim s testm pentru 9 carbohidrai diferii avem

nevoie de 2 plci Petri.

Incubm la 28-30C pentru 24-48 ore, apoi urmrim apariia culturii

n jurul rondelelor.

Exist i alte modaliti tehnice n realizarea auxanogramei.

Interpretare:

trebuie s existe multiplicare levuric (cultur prezent) n

jurul rondelei pe care am depus o ans din soluia 5% de glucoz;
toate levurile pot folosi glucoza drept unic surs de C

se noteaz dezvoltarea culturii n jurul rondelelor unde

aceasta este evideniat i utiliznd rezultatele obinute, n
contextul celorlalte date de laborator, se stabilete specia levuric

Control de calitate:

tulpina de referin de Cryptococcus laurentii

tulpina de referin de Candida pseudotropicalis

12. 2. Testul sensibilitii la bacitracin

Principiu:

Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibat de bacitracin

(antibiotic produs de Bacillus licheniformis). Se apreciaz c dintre
tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puin de 1% sunt
rezistente la bacitracin.

Materiale necesare:
 colonii -hemolitice izolate pe geloz-snge

microcomprimate de bacitracin cu 0,04 U i cu 0,1 U (i nu cu

10 U / microcomprimat)

Tehnica de lucru:

Se preleveaz 3-4 colonii -hemolitice i se nsmneaz n striuri

foarte apropiate, suprapuse n 3 direcii, pe o jumtate de plac
Petri cu geloz-snge (din motive de economie se poate utiliza i un
sector de plac).

Plasm n centrul ariei nsmnate un microcomprimat cu

bacitracin i incubm pentru 18-24 ore la 35-37C.

Interpretare:

Testul este pozitiv (bacteria este sensibil la bacitracin) n cazul n

care

rezult o inhibiie a creterii bacteriene, indiferent de

diametru, n jurul microcomprimatului cu 0,04 U bacitracin

rezult o inhibiie a creterii bacteriene cu diametrul 11 mm,

n jurul microcomprimatului cu 0,1 U bacitracin.

Control de calitate:

Martor pozitiv Streptococcus pyogenes

Martor negativ Streptococcus agalactiae

12. 3. Testul bilolizei (Neufeld)

Principiu:

Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulai sunt lizai n

prezena bilei sau srurilor biliare (unele tulpini necapsulate nu
sufer acest proces) prin activarea unei enzime autolitice.

Materiale necesare:

colonii izolate, a-hemolitice

soluie de dezoxicolat de sodiu 10%

soluie salin izoton

ap distilat
Tehnica de lucru:

Se prepar n soluie salin fiziologic o suspensie pornind de la

coloniile ahemolitice izolate. Turbiditatea suspensiei trebuie s fie
asemntoare cu turbiditatea etalonului McFarland 0,5 sau 1.

Repartizm cte 0,5 ml din suspensie n 2 eprubete de sticl.

n primul tub adugm 0,5 ml dezoxicolat de sodiu iar n al doilea

tub adugm 0,5 ml ap distilat. Incubm timp de 2 ore la 35-37C.

Interpretare:

Testul este pozitiv (bacteriile au fost lizate n prezena

dezoxicolatului de sodiu i sunt pneumococi) dac suspensia s-a
clarificat n tubul n care am adugat dezoxicolat i nu s-a clarificat
n tubul n care am adugat ap distilat

Testul este negativ dac ambele tuburi au rmas opace.

Control de calitate:

Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae

Martor negativ Streptococcus viridans.

12. 4. Testul CAMP

Principiu:

Streptococii de grup B produc o substan extracelular de natur

proteic denumit factorul CAMP (dup iniialele cercettorilor care
au pus la punct testul / Christie, Atkins, Munch-Petersen), care
acioneaz sinergic cu b-lizina produs de unele tulpini de
Staphylococcus aureus. Dac aceste 2 microorganisme sunt cultivate
n 2 striuri perpendiculare (fr s se ating), acolo unde cele 2
striuri se nvecineaz, liza hematiilor (de berbec sau de bou) apare
mrit, n form de vrf de sgeat.

Materiale necesare:

colonii de streptococi hemolitici sau nehemolitici (dac un

anumit context sau anumite teste sugereaz prezena unui
streptococ de grup B)

plci Petri cu geloz snge de berbec sau de bou

tulpina de S. aureus productoare de b-lizin (ATCC 25923) /

alternativ am putea utiliza fii din hrtie de filtru impregnate cu b-
lizin stafilococic

ATCC = American Type Culture Collection

tulpini de cercetat

Tehnica de lucru:

Inoculm n striu o tulpin de S. aureus productoare de b-lizin, pe

unul din diametrele plcii cu agar-snge. Perpendicular pe acest
striu vom inocula (fr s atingem striul de stafilococ) o tulpin
CAMP pozitiv, o tulpin CAMP negativ i tulpini de cercetat.

Incubm la 35-37C aerob pn a doua zi sau timp de 6 ore n

atmosfer de 5-10% CO2.

Interpretare:

apariia unei zone de hemoliz lrgite, n vrf de sgeat

(vrful spre tulpina de stafilococ) reprezint un test pozitiv
(confirmat de martorul pozitiv)

hemoliz nemodificat test negativ (confirmat de martorul

negativ)

Control de calitate:

Martor pozitiv Streptococcus agalactiae

Martor negativ Streptococcus pyogenes sau un streptococ de

grup D

12. 5. Testul producerii de catalaz

Principiu:

Catalaza descompune peroxidul de hidrogen n ap i oxigen.

12. 5. A. pentru mycobacterii

Materiale necesare:

cultura pur a microorganismului care urmeaz a fi testat, pe

mediu Lwenstein

soluie de peroxid de hidrogen n Tween 80 i ap distilat

Tehnica de lucru:

Peste cultura bacterian se adaug 1 ml de soluie de peroxid de

hidrogen i se las tubul la temperatura camerei.

Se msoar nlimea coloanei de bule de oxigen i se nregistreaz

valoarea n mm.

Interpretare:

Acesta este un test semi-cantitativ, care ajut la diferenierea

speciilor de mycobacterii n funcie de cantitatea de catalaz
produs. n vederea unei diferenieri suplimentare, se poate utiliza
testul termosensibilitii catalazei (Mycobacterium tuberculosis,
spre exemplu, produce o catalaz termosensibil).

Notificarea se poate face n modul urmtor

peste 20 mm +++

10-20 mm ++

5-10 mm +

< 5 mm -

Control de calitate:

Martor pozitiv M. fortuitum

Martor mai slab pozitiv (test semicantitativ) M. tuberculosis /

n cazul testului pentru termosensibilitatea catalazei rezultatul va fi
negativ dup nclzire 20 minute la 68C

Martor negativ mediu neinoculat peste care se adaug

soluie de peroxid de hidrogen

12. 5. B. pentru alte microorganisme (spre exemplu diferenierea

stafilococilor de alte microorganisme)

Exist mai multe tehnici dintre care vom prezenta testul realizat pe
o suspensie bacterian i respectiv testul catalazei prin
suspensionarea culturii pe lam

Materiale necesare:

colonii izolate dezvoltate pe medii fr snge / n cazul n care

urmeaz s testm o bacterie care s-a dezvoltat pe geloz-snge,
deoarece pot aprea reacii fals pozitive datorit catalazei
eritrocitare, urmeaz s prelevm cultura bacterian fr a atinge
mediul de cultur; n acest sens urmeaz s utilizm o ans fir i
s prelevm cultur din poriunea cea mai bombat a coloniei de
identificat

soluie de peroxid de hidrogen 3%

ap distilat

Tehnica de lucru:

B1.

Realizm o suspensie bacterian dens n 1-2 ml de ap distilat la

care adugm 1-2 picturi de soluie de peroxid de hidrogen 3%.

Observm imediat i dup trecerea a 5 minute apariia bulelor de

oxigen.

B2.

Pe o lam de sticl punem o pictur din soluie de peroxid de

hidrogen. Suspensionm cultura n pictura de H2O2 i urmrim
timp de 30 de secunde apariia bulelor de oxigen.

Interpretare:

apariia bulelor de gaz semnific un test pozitiv, bacteria

produce catalaz

absena bulelor de gaz semnific un test negativ.

Control de calitate:

Martor pozitiv Staphylococcus aureus

Martor negativ Streptococcus pyogenes

12. 6. Testul utilizrii citratului ca unic surs de carbon (Simmons)

Principiu:

Unele dintre enterobacterii dein un echipament enzimatic care

permite asimilarea i utilizarea citratului ca unic surs de carbon.
Utiliznd un mediu care conine citrat i un indicator de pH, putem
indentifica alcalinizarea mediului i respectiv acea enterobacterie
care poate utiliza citratul ca unic surs de carbon.

Materiale necesare:

o suspensie relativ dens obinut din colonia (cultur pur)

bacteriei pe care dorim s o identificm
 mediul care conine acid citric 0,2% (Simmons), turnat n
pant n eprubete mici; n prezena indicatorului de pH i la pH
neutru, mediul nensmnat are o culoare verde

Tehnica de lucru:

cu ajutorul unei anse, prelevm suspensie bacterian pe care

o nsmnm ntr-un singur striu pe suprafaa mediului Simmons

incubm la 37C i examinm dezvoltarea culturii i eventuala

modificare a culorii mediului

Interpretare:

apariia unei culturi bacteriene de-a lungul striului, nsoit de

modificare culorii care devine albastr, semnific un test pozitiv =
bacteria utilizeaz citratul ca unic surs de carbon

n prezena unui tub fr dezvoltarea culturii, culoarea

mediului fiind verde putem notifica un rezultat negativ

Control de calitate:

Martor pozitiv Klebsiella pneumoniae / Enterobacter cloacae

Martor negativ Escherichia coli

12. 7. Testul coagulazei

Principiu:

Stafilococii coagulazo pozitivi produc o enzim care activeaz

coagularea plasmei. Exist 2 tipuri de coagulaz: coagulaza liber i
coagulaza legat de peretele celular (clumping factor). Coagulaza
liber acioneaz pe protrombin. Coagulaza legat acioneaz
direct pe fibrinogenul plasmatic. Stafilococii coagulazo pozitivi sunt
considerai Staphylococcus aureus.

Materiale necesare:

colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmeaz s

fie testat

plasm de iepure (de preferat) / n cazul n care plasma de

iepure nu este disponibil se poate folosi plasm uman (cu
sensibilitate mai mare la coagulaza produs de S. schleiferi i S.
lugdunensis)

lame, tuburi
Tehnica de lucru:

a. Testul coagulazei pe lam

Verific prezena coagulazei legate. Pe lam se depune o pictur de

ap distilat (nu soluie salin fiziologic). Suspensionm i
omogenizm 1-2 colonii n pictura de ap distilat (suspensia
trebuie s fie tulbure omogen).

Ateptm circa 10 secunde i urmrim apariia unei eventuale

autoaglutinri (caz n care nu putem interpreta rezultatul testului;
trecem la efectuarea testului coagulrii n tub). Dac pictura
rmne tulbure omogen, adugm 1 pictur de plasm i urmrim
apariia coagulilor timp de 10-15 secunde.

Alternativ se pot utiliza truse comerciale.

Interpretare:

apariia coagulilor n 10-15 secunde semnific un test

pozitiv

absena coagulilor semnific un test negativ / 5% din S.

aureus dau reacii fals negative la testul pe lam, fiind necesar
realizarea testului coagulazei n tub

b. Testul coagulazei n tuburi

Verific prezena coagulazei libere. Pipetm aseptic 0,5 ml de

plasm ntr-un tub steril. Prelevm o colonie i o descrcm n
plasma din tub (alternativ putem nsmna o colonie de testat n
0,5 ml bulion glucozat, incubm 18-24 ore la 35-37C i vom
amesteca plasma cu suspensia microbian rezultat dup cultivare).

Incubm tubul timp de 4 ore la 35-37C (pentru unele tulpini reacia

poate fi pozitiv chiar i mai repede de 4 ore). Rezultatul reaciei
este examinat prin nclinarea tubului. Dac reacia este negativ la 4
ore, reincubm pn la 24 ore.

Atenie, cheagul poate fi lizat destul de rapid dup momentul

formrii (unele tulpini de S. aureus produc fibrinolizin). Din acest
motiv, unii autori recomand examinare tubului test din 30 n 30
minute, n primele 4 ore.

Interpretare:

formarea unui cheag, semnific un rezultat pozitiv

 absena cheagului semnific un rezultat negativ

Control de calitate:

Martor pozitiv S. aureus

Martor negativ S. epidermidis

12. 8. Testul filamentrii, pentru Candida albicans

Principiu:

Dup cultivare n ser uman, ser bovin, ser de berbec etc timp de 2-4
ore, la 35-37C, blastoconidiile individuale de C. albicans produc
filamente scurte (tubi germinativi).

Materiale necesare:

colonii izolate, n scopul identificrii

ser uman, ser bovin, ser de berbec, ser fetal de viel,

serumalbumin bovin etc

aplicatoare de lemn sau sterile pipete Pasteur cu vrful efilat,

lame i lamele, tuburi mici

Tehnica de lucru:

ntr-un tub de dimensiuni mici (ex. 12 / 75 mm) introducem aseptic

0,5-1 ml de ser uman sau alt tip de ser. Cu un aplicator steril (ca un
beiga) atingem colonia care trebuie identificat i apoi l
introducem n tub. Incubm timp de 2-4 ore, la 35-37C.

Realizm un preparat ntre lam i lamel i examinm la

microscopul optic.

Interpretare:

prezena unor tubi germinativi cu un calibru mai ngust dar cu

o lungime de 3-4 ori mai mare dect diametrul celulei de origine,
care continu direct, fr nici o strangulare sau sept blastoconidia,
semnific un test pozitiv

absena aspectului menionat mai sus sau prezena unor

pseudotubi germinativi care sunt delimitai printr-o strangulare i un
sept de blastoconidie semnific un test negativ

Control de calitate:
 Martor pozitiv C. albicans

Martor negativ C. tropicalis

12. 9. A. Mediul multitest MIU (mobilitate indol uree)

Principiu:

Mediul conine uree, triptofan, rou fenol (indicator de pH) i este

condiionat n tuburi de dimensiuni mici. Geloza este moale
permind mobilitatea microorganismului nsmnat; hidroliza ureei
va duce la alcalinizare mediului (culoarea vireaz de la galben la
rou); producerea de indol din triptofan va fi indicat de nroirea
reactivului Ehrlich

Materiale necesare:

tuburi de dimensiuni mici cu mediul MIU

hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi i reactiv

Kovacs) sau reactiv Ehrlich / Kovacs condiionat n sticlue de culoare
brun

colonii de identificat (colonii izolate, cultur pur)

ans fir etc

Tehnica de lucru:

Utilizm pentru nsmnare o ans fir. Prelevm din colonia izolat

pe mediu neselectiv (dac pentru cultivare au fost utilizate medii
selective trebuie s prelevm cu grij, fr s atingem mediul de
cultur) i nsmnm mediul prin nepare ncercnd s realizm o
nsmnare n linie dreapt. Fixm de dop hrtiua indicator n
aa fel nct s ajung deasupra coloanei de mediu, fr s l
atingem. Incubm la 35-37C timp de 24 ore. n cazul n care nu are
loc virarea culorii mediului, incubm pn la 48 de ore.

Interpretare:

din punctul de vedere al mobilitii

opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare bacteria

este imobil

opacifierea este uniform n coloana de mediu bacteria este

mobil

din punctul de vedere al producerii ureazei

 culoarea coloanei rmne galben bacteria este ureazo
negativ

culoarea devine roie bacteria este ureazo pozitiv

apariia unui inel de culoare roie la suprafaa mediului nu

reprezint un test pozitiv

din punctul de vedere al transformrii triptofanului n indol

schimbarea culorii hrtiei la rou-violet bacteria este indol

pozitiv

culoarea hrtiei rmne alb bacteria este indol negativ

alternativ, n lipsa hrtiuelor indicator se poate picura reactiv

Ehrlich la suprafaa mediului i interpreta modificarea / lipsa
modificrii culorii

Control de calitate:

Martor pozitiv Proteus mirabilis M+ U+ I+

Martor negativ Shigella spp. M- U- I-

12. 9. B. Mediul multitest MILF (mobilitate indol lizin-decarboxilaz

fenil-alanin-dezaminaz)

Principiu:

Mediul conine o cantitate sczut de glucoz, pepton cu DL-

triptofan, L-lizin, DL-fenil-alanin, bromcrezol purpur soluie 2%
(indicator de pH) i este condiionat n tuburi de dimensiuni mici.
Geloza este moale permind mobilitatea microorganismului
nsmnat. Producerea de indol din triptofan va fi indicat de
nroirea reactivului Ehrlich. Decarboxilarea lizinei va duce la
alcalinizare mediului (n absena lizin-decarboxilazei rezult o uoar
acidifiere a mediului datorit fermentrii glucozei). Dezaminarea
fenil-alaninei duce la apariia de acid fenil-piruvic i amoniac;
adugnd clorur feric rezult o culoare verde.

Materiale necesare:

tuburi de dimensiuni mici cu mediul MILF

hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi i reactiv

Kovacs) sau reactiv Ehrlich / Kovacs condiionat n sticlue de culoare
brun
 colonii de identificat (colonii izolate, cultur pur)

ans fir etc

Tehnica de lucru:

Tehnica de lucru este asemntoare cu cea expus la punctul 12. 9.

A.

Interpretare:

din punctul de vedere al mobilitii

opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare bacteria

este imobil

opacifierea este uniform n coloana de mediu bacteria este

mobil

din punctul de vedere al transformrii triptofanului n indol

schimbarea culorii hrtiei la rou-violet bacteria este indol

pozitiv

culoarea hrtiei rmne alb bacteria este indol negativ

din punctul de vedere al producerii lizin-decarboxilazei

alcalinizarea coloanei traduce prezena enzimei

acidifierea uoar a coloanei traduce absena enzimei

din punctul de vedere al producerii fenil-alanin-dezaminazei

apariia unui inel de culoare verde la suprafaa mediului i

la nivelul traiectului de nsmnare dup adugarea unei picturi
de clorur feric 10% traduce prezena enzimei

Control de calitate:

Martor pozitiv Proteus mirabilis M+ I+ FD-az+ LD-az-

Martor negativ Klebsiella pneumoniae M- I- FD-az- LD-az+

12. 10. Mediul multitest TSI (triple sugar iron)

Principiu:

Mediul este agarizat, condiionat n dou zone (n coloan la baz

i n pant) i conine glucoz (n raport de 1/10 fa de celelalte
zaharuri), lactoz, zaharoz, citrat feric i un indicator de pH (rou
neutru). Partea dreapt (coloana) nu vine n contact cu aerul i ofer
condiii relative de anaerobioz. Partea nclinat (panta) ofer
condiii de multiplicare n aerobioz.

Concentraia glucozei este mai mic, pentru ca fermentarea acestui

zahar s poat fi detectat chiar dac este singurul zahar
metabolizat. Dac o bacterie se dezvolt n partea dreapt vor fi
eliberai aminoacizi, care n zona aerob vor fi decarboxilai oxidativ
i vor modifica pH-ul spre alcalin. n cazul n care lactoza i / sau
zaharoza nu sunt fermentate, cantitatea de acid produs prin
fermentarea glucozei (toate enterobacteriile fermenteaz glucoza)
este suficient de mic pentru ca pH-ul de la nivelul pantei s revin
rapid la neutru. n acelai timp, pH-ul rmne acid (i culoarea
mediului rmne galben) la nivelul coloanei pentru c n condiii de
relativ anaerobioz nu are loc decarboxilarea oxidativ. Dac
zaharurile de la nivelul pantei sunt fermentate, cantitatea de acid
produs este suficient de mare pentru ca pH-ul de la acest nivel s
rmn acid i respectiv culoarea pantei s rmn galben.

Prezena citratului feric, n cazul n care bacteria produce H2S duce

la apariia unei culori negre (se formeaz sulfit feros).

La nivelul coloanei se mai nregistreaz i producerea de gaz (de la

apariia unor bule fine pe traseul de nsmnare, pn la
fragmentarea sau ruperea coloanei).

Materiale necesare:

tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI

colonii de identificat (colonii izolate, cultur pur)

ans fir etc

Tehnica de lucru:

Utilizm pentru nsmnare o ans fir. Prelevm din colonia izolat

pe mediu neselectiv (dac pentru cultivare au fost utilizate medii
selective trebuie s prelevm cu grij, fr s atingem mediul de
cultur) i nsmnm coloana prin nepare, apoi retragem ansa i
atingnd suprafaa coloanei descriem un striu n zig-zag. Incubm
la 35-37C timp de 24 ore.

Interpretare:

n ceea ce privete fermentarea glucozei

 culoarea coloanei este galben glucoza este fermentat

culoarea coloanei rmne roie glucoza nu este fermentat

(nu este enterobacterie)

fermentarea glucozei poate fi sau nu nsoit de producere de

gaz

interpretarea se face similar pentru fermentarea lactozei /

zaharozei, la nivelul pantei

n cazul n care se produce H2S, remarcm apariia unei culori

negre la nivelul coloanei

alte elemente privind interpretarea acestor rezultate vor fi

prezentate n capitolul 28

Control de calitate:

Martor pentru pH acid la nivelul coloanei i pantei, fr

producere de H2S E. coli

Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul

pantei i producere de H2S Salmonella typhimurium

este posibil i utilizarea altor tulpini martor.

12. 11. Testul producerii de niacin

Principiu:

Mycobacteriile produc n timpul multiplicrii niacin (acid nicotinic)

pe care o utilizeaz n sinteza NAD i NADP. Majoritatea
mycobacteriilor posed o enzim care poate transforma niacina
liber n acid nicotinic mono-nucleotid. Dac microorganismele nu
prezint aceast enzim (ex. M. tuberculosis), n mediul de cultur
se va acumula niacin. Niacina este solubil n ap i poate fi extras
din mediu (de ex. n soluie salin fiziologic) iar n reacie cu
bromura de cianogen (atenie la utilizare !) n prezena anilinei
rezultnd un compus de culoare galben.

Materiale necesare:

soluie de anilin 4% (conservat n sticl de culoare brun la

2-8C)

soluie de bromur de cianogen 10% (ar fi de preferat datorit

riscurilor fii de hrtie indicator impregnate n soluie de bromur
de cianogen, produse comercial)
 folosim culturi (realizate pe mediul Lwenstein-Jensen), n
vrst de minim 3 sptmni

Tehnica de lucru:

Folosim o subcultur mycobacterian cu cretere confluent.

Adugm cu ajutorul unei pipete Pasteur ap distilat steril sau
soluie salin fiziologic. cu ajutorul pipetei Pasteur (sau cu ajutorul
unei anse) raclm coloniile pentru a permite extracia niacinei din
mediu. Tuburile rmn 1 or la temperatura camerei.

Transferm cte 0,5 ml n fiecare dintre n tuburile de testare.

Adugm succesiv 0,5 ml anilin 4% i respectiv 0,5 ml bromur de
cianogen. Examinm dup 5 minute pentru a observa apariia culorii
galbene n cazul reaciei pozitive. nainte de eliminare, vom
neutraliza tuburile prin adugarea unui volum egal (aproximativ 3
ml) de NaOH 10 % n fiecare tub.

Interpretare:

apariia unei culori galbene, reprezint un test pozitiv

absena culorii galbene, reprezint un test negativ

Control de calitate:

Martor pozitiv Mycobacterium tuberculosis

Martor negativ Mycobacterium avium.

12. 12. Testul producerii de citocrom oxidaz

Principiu:

Unele bacterii produc citocrom oxidaz, enzim care lipsete la

bacteriile strict anaerobe. Aceast hemoprotein acioneaz i
asupra unei substane, tetra-metil p-fenilendiamin rezultnd un
compus de culoare purpurie

Dintre bacteriile oxidazo-pozitive amintim Vibrio spp., majoritatea

speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre
germenii gram negativi) i Micrococcus spp. (dintre germenii gram
pozitivi)

Materiale necesare:

soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1% conservat

n sticl de culoare brun la temperatura frigiderului sau fii de
hrtie indicator impregnat n reactiv (preparate comercial)
 hrtie de filtru

ans cu fir de platin sau pipet Pasteur (cudat)

colonii izolate dezvoltate pe agar-snge, agar-chocolat sau

agar Mueller Hinton

Tehnica de lucru:

Exist mai multe variante tehnice, dar vom discuta doar una dintre
acestea. Punem ntr-o cutie Petri un fragment de hrtie de filtru pe
care depunem 1-2 picturi de soluie apoas de tetra-metil p-
fenilendiamin 1%. Dup sterilizarea i rcirea ansei, prelevm
dintr-o colonie izolat i descrcm cultura pe hrtia de filtru prin
micri circulare de mic amplitudine.

Urmrim apariia unei reacii de culoare n interval de 10 secunde

Interpretare:

apariia unei zone de culoare purpurie n 10 secunde,

reprezint un test pozitiv

absena culorii purpurie, semnific un test negativ

apariia zonei colorate mai tardiv nu permite interpretarea

testului, n principiu este vorba despre un rezultat negativ

Control de calitate:

Martor pozitiv Pseudomonas aeruginosa

Martor negativ Escherichia coli

12. 13. Testul sensibilitii la optochin

Principiu:

Majoritatea tulpinilor de pneumococi (Streptococcus pneumoniae)

sunt sensibile la concentraii sczute (< 5 g/ml) de optochin
(hidroclorid de etil-hidrocuprein). Unele tulpini ale altor streptoci
care produc hemoliz viridans pot fi sensibile, dar la concentraii mai
mari ale substanei active, n timp ce alte tulpini sunt rezistente.

Materiale necesare:

discuri cu optochin (5 g / disc), cu diametrul de 6 milimetri

plci cu agar-snge
 tampoane sterile

colonii -hemolitice izolate, care urmeaz a fi testate

Tehnica de lucru:

Prelevm cu un tampon steril de preferat 2-3 colonii i realizm o

nsmnare pe jumtatea unei plci cu agar-snge, n aa fel nct
s rezulte o cultur confluent (din motive de economie,
nsmnarea s-ar putea realiza i pe o ptrime de plac Petri).
Plasm un disc cu optochin n centrul zonei nsmnate i presm
uor pentru ca discul s adere uniform. Incubm timp de 18-24 ore la
35-37C n atmosfer de 5% CO2.

Interpretare:

apariia unei zone de inhibiie cu diametrul mai mare de 14

mm, semnific un test pozitiv

absena inhibiiei n jurul discului semnific un test negativ

interpretarea este diferit dac se folosesc discuri de optochin

cu alte dimensiuni (ex. cu diametrul de 10 mm)

Control de calitate:

Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae

Martor negativ Streptococcus viridans.

Fr ndoial c aceste teste reprezint doar cteva exemple din

multitudinea testelor utilizate n laboratorul de microbiologie. Numai
n vederea identificrii diferitelor specii mycobacteriene se pot
utiliza, spre exemplu, peste 130 de teste fenotipice.

nelegerea lor din punct de vedere teoretic precum i utilizarea lor

n mod practic sunt utile att pentru studeni, medicii rezideni aflai
la debutul pregtirii n specialitatea de medicin de laborator, pentru
viitorii medici din alte specialiti ct i pentru medicii i biologii
implicai n diagnosticul de laborator la nivel clinic sau n interesul
sntii publice.

Avnd la baz noiunile teoretice nvate, diferitele exemple

precum i manualele care prezint din punct de vedere practic
diagnosticul microbiologic, fiecare dintre cei implicai va putea s
aplice aceste elemente, deprinznd arta acestui diagnostic att de
util n practica medical la nivel individual sau populaional.

Ultimul test pe care l vom prezenta n finalul acestui capitol nu se

bazeaz pe proprietile biochimice ci are la baz caracterele
antigenice (structura antigenic) ale microorganismelor din specia
Streptococcus pneumoniae.

Datorit faptului c nu exist un capitol special al tehnicilor

imunologice unde ar putea fi integrat, precum i datorit faptului c
n paginile precedente am prezentat testul bilolizei i respectiv
testul sensibilitii la optochin (ambele teste fiind necesare n
diferenierea Streptococcus pneumoniae de Streptococcus viridans)
am decis s includem aici, acest test.

12. 14. Testul umflrii capsulei (Neufeld, Quellung test)

Principiu:

Complexul antigen-anticorp format n urma cuplrii antigenului

capsular pneumococic cu anticorpii anti-capsulari are o refringen
superioar mediului nconjurtor i apare, la examinarea cu
microscopul optic, ca un halou clar dispus n jurul bacteriilor, halou
care are dimensiuni mai mari dect haloul identificat prin
microscopie (preparat colorat cu albastru de metilen) n lipsa serului
anti-capsular.

Materiale necesare:

cultura unei bacterii care se presupune c aparine speciei S.

pneumoniae

se pot utiliza i produse patologice (ex. LCR)

ser anti-capsular polivalent; seruri anti-capsulare monovalente

(de tip)

soluie de albastru de metilen (1%)

soluie salin fiziologic

lame i lamele

microscop optic

Tehnica de lucru:

A. examinarea preparatului martor

realizm o suspensie omogen opalescent din cultura

bacterian n 0,5 ml soluie salin fiziologic i adaugm 0,5 ml
soluie de albastru de metilen

depunem o pictur din suspensie pe o lam de microscop,

acoperim cu o lamel i examinm dimensiunea haloului care apare
datorit prezenei capsulei

B. examinarea preparatului test

depunem pe o alt lam de microscop o pictur din suspensia

bacterian i n stricta vecintate a acesteia depunem o pictur din
serul polivalent anti-capsular

amestecm prin micri circulare cele 2 picturi

ateptm 10 minute (preparatul se menine n camer

umed)

Interpretare:

identificarea unor coci colorai n albastru, dispui izolat sau n

pereche, nconjurai de un halou clar, mai bine definit i de
dimensiuni mai mari dect haloul vizualizat prin examinarea
preparatului martor semnific un test pozitiv, respectiv prezena
pneumococilor

n cazul n care nu este sesizat nici o diferen ntre

preparatul test i preparatul martor ne aflm n situaia unui test
negativ

dup identificarea unui test pozitiv fa de serul polivalent,

putem utiliza seruri monovalente, specifice de tip pentru a
indentifica tipul capsular

testul umflrii capsulei se poate realiza i pornind pe produs

patologic

Control de calitate:

Martor pozitiv tulpin capsulat de Streptococcus

pneumoniae

Martor negativ Streptococcus viridans.