Ionica Deliu

BACTERIOLOGIE
MEDICALĂ
– LUCRĂRI PRACTICE –

2019
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

2. Diagnosticul infecţiilor cu bacterii din genul Vibrio

Cea mai importantă specie din genul Vibrio pentru patologia umană este Vibrio cholerae.
În condiţii naturale, vibrionul holeric este patogen numai pentru om, producând o infecţie la
nivelul tractului intestinal, fără pătrunderea bacteriilor în torentul sanguin. Simptomele care se
manifestă după o perioadă de 1 - 4 zile de incubaţie sunt caracteristice unei infecţii digestive:
greaţă, vărsături, scaune diareice numeroase (apoase, cu mucus, celule epiteliale şi un mare număr
de bacterii), crampe abdominale.
Diagnosticul de laborator în holeră este bacteriologic şi trebuie realizat cât mai repede
posibil. Cazurile grave se diagnostichează uşor, mai ales în contextul unei epidemii, dar pentru
cazurile uşoare se impun etapele unui diagnostic de laborator pentru o boală diareică acută.

Etapele diagnosticului microbiologic

1. Recoltarea produsului patologic
Produsul patologic se recoltează cât mai curând după debutul bolii, înainte de începerea
antibioterapiei şi se transportă la laborator în maxim 1 - 3 ore. Acesta este reprezentat de materiile
fecale, dar se poate recolta şi lichid de vărsătură.
Materiile fecale se examinează macroscopic, în holeră fiind scaune riziforme (similare cu
apa de orez), de culoare verzuie, cu miros fetid, cu flocoane de mucus. Se poate folosi un mediu de
transport Cary – Blair sau apa peptonată, care are rol atât de mediu de transport, cât şi de mediu de
îmbogăţire.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic
Pentru examinarea microscopică se realizează un preparat proaspăt între lamă şi lamelă, care
se examinează la microscop. Se vizualizează vibrionii prezenţi în număr mare, cu mişcări active
caracteristice.
3. Cultivarea pe medii de cultură
Cultivarea pe mediu are drept scop obţinerea unei culturi pure. Se folosesc medii moderat
selective (de exemplu BSA – bile salts agar = agar cu săruri biliare) şi înalt selective (TCBS –
thiosulphate citrate bile salts agar = agar cu tiosulfat citrat şi săruri biliare).
Obţinerea culturilor de vibrioni se poate realiza punând înainte produsul patologic pe apă
peptonată alcalină pentru 6 - 8 ore la 37°C, unde se va forma o cultură sub formă de văl la suprafaţa
mediului. Din vălul respectiv se face însămânţarea pe mediile selective. De asemenea, din cultura în
apă peptonată se pot face examinări microscopice între lamă şi lamelă, unde vibrionii se observă cu
forma caracteristică, foarte mobili, cu mişcări de rostogolire sau haotice.
4. Identificarea microorganismelor
Se face pe baza mai multor caractere:
 caractere morfotinctoriale: vibrionii sunt bacterii Gram negative, de 1 - 3 /0,5 - 0,8 µm;
 caractere de cultură:
• colonii de tip S, galbene, mari, de 2 - 4 mm diametru pe TCBS (Fig. 49);
• colonii de tip S rotunde, strălucitoare, transparente ca picăturile de rouă pe BSA (spre
deosebire de E. coli care formează colonii mate);
 caractere biochimice:
• bacterii oxidazo - pozitive,
• alte caractere biochimice, care se stabilesc numai în laboratoarele de referinţă, prin teste
clasice sau automate, deosebesc biotipul clasic de biotipul El Tor;
 testul „şuviţei de ADN” deosebeşte bacteriile care au aspect colonial similar şi sunt oxidazo -
pozitive, de exemplu Vibrio cholerae şi Aeromonas spp.; se suspendă o colonie suspectă într-o
picătură de soluţie 0,5% dezoxicolat de sodiu, pe o lamă de microscop; dacă este vorba de vibrioni
holerici, celulele sunt lizate şi ADN-ul poate fi „tras” cu ansa ca o şuviţă (Fig. 48);
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

 caractere antigenice:
• se face un test de aglutinare pe lamă cu ser antiholeric O:1; reacţiile pozitive se confirmă
la centrul de referinţă, stabilindu-se serotipul Ogawa, Inaba sau Hikojima; reacţiile
negative sunt urmate de testarea cu ser anti-holeric O:139;
• în studii epidemiologice se poate realiza şi lizotiparea (se pot defini peste 140 de
lizotipuri diferite) în laboratoarele de referinţă;
 capacitatea de toxigeneză se poate determina prin teste de latex aglutinare pasivă inversă;
 se pot aplica teste moleculare (ribotipie);
 antibiograma se realizează pentru supravegherea apariţiei unor tulpini rezistente la antibiotice.
Testul oxidazei se realizează pentru identificarea rapidă a bacteriilor oxidazo - pozitive
(pseudomonade, campilobacterii, neiserii, hemofili, vibrioni) şi pentru diferenţierea stafilococilor de
interes medical (oxidazo - negativi) de genuri similare, oxidazo - pozitive (Micrococcus). Pune în
evidenţă prezenţa citocrom-oxidazei, absentă la bacteriile strict anaerobe. Testul se efectuează prin
mai multe metode:
- pentru bacteriile Gram negative:
o prin punerea în contact a câtorva picături de reactiv pentru oxidază (tetrametil-parafenilen-
diamină 1%) pe o bucăţică de hârtie de filtru, într-o cutie Petri, cu un fragment de cultură
bacteriană proaspătă (depus cu ajutorul unei anse de platină sau de unică folosinţă, ori cu un
beţişor steril de lemn pe porţiunea umedă a hârtiei); se utilizează un martor pozitiv
(Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus) şi unul negativ (Escherichia coli,
Staphylococcus epidermidis); se urmăreşte virarea culorii în purpuriu în decurs de 10 secunde;
un viraj mai tardiv al culorii (la peste 10 - 60 secunde) nu este caracteristic, se poate datora unei
culturi îmbătrânite sau unei culturi de pe un mediu cu glucide fermentescibile;
o se poate efectua reacţia şi direct pe cultură mixtă, punând reactiv peste colonia suspectă şi
urmărind reacţia de culoare; reacţia pozitivă este indicată de apariţia unei coloraţii purpurii (sau
de la culoarea florii de levănţică la purpuriu închis) în decurs de 10 secunde; cu dimetil-p-
fenilendiamină culoarea trece rapid de la roz la roşu închis, maro şi în final negru; o reacţie
negativă este indicată de absenţa culorii purpurii; nu se utilizează testarea pe colonii crescute pe
geloză cu sânge de berbec, datorită culorii intense a mediului; nu se testează direct coloniile
mucoide, impermeabile pentru reactiv;
o se pot utiliza benzi comerciale pentru oxidază, urmărind indicaţiile producătorului (Fig. 50);
- pentru bacteriile Gram pozitive:
o se foloseşte soluţie de tetrametil-parafenilen-diamină 6% în dimetilsulfoxid; pe hârtia de filtru
se pune un spot de cultură pură de pe geloză cu 7% sânge de berbec într-o manieră similară
celei descrise anterior, peste care se pune o picătură de reactiv; reacţia pozitivă este observată
prin apariţia în decurs de 1 – 2 minute a unei coloraţii albastre; dacă se foloseşte o cultură
crescută pe alte medii, cultura trebuie să aibă o vechime de trei zile şi reacţia se va pozitiva abia
după 5 – 10 minute.

Fig. 48. Testul şuviţei de ADN pentru Vibrio cholerae (string test) Fig. 49. Cultură de Vibrio cholerae pe TCBS
(http://www.pharmaceutical-technology.com/projects/sbl_vaccin/sbl_vaccin5.html) (https://www.flickr.com/search/?tags=vibriocholerae)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

Fig. 50. Testul oxidazei

a – reacție pozitivă (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853); b – reacție negativă (Escherichia coli ATCC 25922)
(https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/OxiStripsOxisticks.htm)

Fig. 51. API 20E cu tulpină de Vibrio cholerae (a) și Vibrio parahaemolyticus (b)
(http://www.scionpublishing.com/medmicro)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

Principii de diagnostic pentru infecțiile cu bacterii anaerobe

În practica diagnosticului de laborator se studiază bacteriile anaerobe implicate în procese

infecțioase dintre cele rezidente ale țesutului cutanat (Eubacterium, Propionibacterium,
Peptostreptococcus), cele prezente în cavitatea bucală (Bacteroides, Peptostreptococcus,
Fusobacterium, Veillonella, Bifidobacterium, Actinomyces), bacterii prezente la nivelul tractului
respirator, la nivelul mucoasei vaginale (Lactobacillus, Prevotella, Peptostreptococcus), la nivelul
colonului (Bacteroides grup fragilis, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Clostridium).
Bacteriile anaerobe pot produce infecții la nivel cerebral (abcese cerebrale), infecții oculare,
sinuzite, infecții bucale și dentare, infecții pleuropulmonare, endocardite, infecții intraabdominale,
colite pseudomembranoase, peritonite, infecții genitale etc.
De cele mai multe ori, infecțiile sunt mixte, implicând atât bacterii anaerobe, cât și bacterii
aerobe sau facultativ aerobe.
Infecțiile plăgilor diferă în funcție de localizarea acestora, dar și de mecanismul de
producere a plăgii. De obicei infecțiile tegumentului sunt determinate de stafilococi, streptococi, dar
specii de Actinomyces pot produce infecții subacute sau cronice de tip abcese granulomatoase.
Infecțiile produse postoperator la nivelul abdomenului sunt determinate de obicei de
microorganisme din microbiota tractului gastrointestinal, în timp ce arsurile infectate se asociază de
obicei cu septicemii. La nivelul mușcăturilor se pot produce infecții cu germeni din cavitatea bucală
a animalului (stafilococi, streptococi, enterobacteriacee, coci anaerobi Gram pozitiv, bacili
anaerobi Gram negativi, Pasteurella, Fusobacterium).
Prelevarea produselor patologice pentru diagnosticul de laborator în infecțiile produse de
bacterii anaerobe se realizează din focarul de infecție, prin puncționare cu ac steril atașat la seringă
sau cu pipetă Pasteur sterilă (ori cu chiureta din profunzime), după aseptizare cu iod și apoi cu
alcool 70%. Se poate face și recoltarea aseptică prin biopsie, cu debridare (deschiderea colecției de
puroi).
Dacă recoltarea nu se face în laborator, proba se transportă de preferință în maxim două ore,
pe mediu de transport pentru anaerobi sau într-o seringă închisă la ambele extremități. Nu se
folosesc tampoane sterile pentru recoltare. În laborator anaerobioza se poate asigura cu ajutorul
sacilor pentru anaerobioză, din plastic, închiși ermetic, cameră de anaerobioză sau gaz - vacuum.
Anaerobioza trebuie verificată cu un indicator oxido-reducător (de exemplu bandă de hârtie
de filtru impregnată cu rezasurină)
Etapele diagnosticului microbiologic
Examinarea macroscopică a plăgii va evidenția supurația cu miros neplăcut și țesuturi
necrotice (datorită produșilor finali de metabolism).
La examinarea microscopică prin colorație Gram un caracter Gram variabil este sugestiv
pentru infecția cu anaerobi; la microscop se pot evidenția microorganisme sporulate și cu
polimorfism accentuat, leucocite și fibrină.
Cultivarea în aerobioză a produsului patologic nu va duce la formarea de culturi bacteriene.
În funcție de morfologia și caracterul Gram al bacteriilor din frotiu, diagnosticul poate fi
orientat:
- cocobacili Gram negativi: Prevotella, Haemophylus, Porphyromonas;
- bacili Gram negativi efilați la capete: Fusobacterium;
- bacili Gram negativi lungi, cu un capăt filiform și unul pătrat: Leptotrichia;
- coci mici, Gram negativi: Veillonella;
- bacili Gram pozitivi, sporulați: Clostridium;
- bacili Gram pozitivi, nesporulați: Bifidobacterium, Actinomyces, Propionibacterium,
Eubacterium.
Înainte de folosire mediile trebuie regenerate (pentru eliminarea oxigenului) în baie de apă la
100°C, timp de 20 minute. Mediile de cultură gelozate care se pot folosi trebuie să asigure factori de
creștere și selectivitate ridicată (Chifiriuc și colab., 2011):
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

- Schaedler cu sânge, vancomicină 7,5 mg/l și neomicină 75 mg/l pentru Bacteroides grup
fragilis, Prevotella, Fusobacterium;
- Columbia cu sânge și feniletilalcool 4,2g/100 ml, pentru bacteriile Gram pozitive și
Porphyromonas;
- TSN, geloză cu gălbenuș de ou și neomicină pentru Clostridium; Columbia cu sânge,
cicloserină și cefoxitin pentru Cl. difficile.
Geloza repartizată în tuburi în coloană înaltă poate fi incubată în aerobioză. Jarurile de
anaerobioză nu se deschid la mai puțin de 24 (uneori 48) de ore de la incubare. Pe medii pot să
apară uneori colonii cu caractere diferite care să reprezinte forme disociate ale aceleiași specii.
Deseori coloniile au miros fetid, sunt pigmentate și mai mari decât cele crescute în aerobioză.
Se examinează microscopic fiecare morfotip în parte, se însămânțează în bulion cu vitamina
K și hemină și din cultura rezultată se realizează teste:
- pentru indol,
- pentru catalază,
- pentru urează,
- pentru aerotoleranță (în atmosferă de CO2 5%).
Se realizează o mini-antibiogramă pentru fiecare morfotip pentru o pre-identificare a
genurilor de bacterii anaerobe (Tabel).

Vancomicină Kanamicină Colistin Rezistență Sodiu Metronidazol

5μg 10μg 10μg la bila polietanol 4μg
bovină 2% sulfat (SPS)
Bacteroides grup fragilis R R R + S
Prevotella sp. R R V - S
Porphyromonas sp. S R R - S
Fusobacterium sp. R S S V S
Veillonella sp. R S S - S
Peptostreptococcus S R R V S S
anaerobius
Peptostreptococcus sp. S S R V R S
Clostridium sp. S S R V S
Eubacterium sp. S S R + S
Actinobacterium sp. S S R - R
Bifidobacterium sp. S S R + R
Propionibacterium sp. S S R V R

Anaerobii facultativi din clasa Actinobacteria (Actinomyces, Actinobacterium,

Bifidobacterium, Propionibacterium, Eubacterium) se identifică apoi cu ajutorul testelor API pentru
anaerobi.
Pentru diagnosticul colitei pseudomembranoase, determinată de tulpini de Clostridium
difficile, testele de cultură din scaun se efectuează numai la persoanele simptomatice. Probele de
scaun recoltate se tratează cu alcool (se omogenizează proba de scaun în raport de 1:1 cu alcool
etilic absolut și se incubează timp de 30 de minute la temperatura camerei), se încălzesc la 80°C
timp de 15 minute și se incubează timp de 48-72 de ore în condiții de anaerobioză. Mediile utilizate
sunt: CDSA (Clostridium difficile selective agar), CCFA (Clostridium difficile agar), CLO agar,
geloză-sânge Columbia cu supliment selectiv; ChromID C. difficile, (incubare 24h), oferă un
rezultat mai rapid, este mai sensibil, dar mai puțin specific.
Coloniile suspecte se folosesc pentru a efectua frotiuri colorate Gram. Identificarea bacteriilor
se poate confirma prin aglutinare. Se fac teste pentru determinarea toxinelor A și B, precum și
pentru determinarea glutamat dehidrogenazei.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

Clostridium Trio Toxin A/B/GDH

(https://www.invitech.co.uk/index.php?route=product/product&product_id=802)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

Principii de diagnostic pentru infecțiile cu Helicobacter pylori

Helicobacter pylori este o bacterie spiralată Gram negativă mobilă, microaerofilă,

acidotolerantă, care e întâlnită la nivelul tubului digestiv al omului. Bacteria nu crește la pH-ul acid
din compartimentul gastric (pe fața luminală a stratului de mucus, la pH 1,0 - 2,0), ci în
profunzimea stratului de mucus, unde pH-ul este 7,4. Factorii de virulență ai bacteriei o ajută să
supraviețuiască la acest nivel și să determine infecții care au fost corelate cu ulcerul duodenal și alte
afecțiuni gastrointestinale. Bacteria sintetizează o protează care scade vâscozitatea mucusului și
favorizează deplasarea bacteriei și urează care hidrolizează ureea cu producere de amoniac cu efect
de tampon al HCl din secreția gastrică. Mobilitatea bacteriei și forma spiralată facilitează
traversarea rapidă a stratului de mucus de către bacterie, care ajunge la suprafața epiteliului. Infecția
cu H. pylori este cronică și asociată cu hipoclorhidrie și leziuni de gastrită cronică, cu inflamația
mucoasei și infiltrarea polimorfonuclearelor și monocitelor în stratul epitelial.
Metodele invazive de diagnostic în cazul infecției cu H. pylori presupun biopsia de mucoasă
gastrică în care prin examinare histologică se evidențiază bacteria și ureaza bacteriană. Fragmentul
de biopsie se pune pe un mediu cu uree și indicator de pH, iar după aproximativ 2 zile mediul se
alcalinizează datorită producerii de amoniac (NH4) și culoarea mediului se modifică. Bacteria se
recunoaște în funcție de intervalul de creștere a culturii, minim 3 zile, precum și morfologia
celulelor (spire rigide în formă de S).
Metodele neinvazive de diagnostic pun în evidență anticorpii specifici, antigenul bacterian
și ureaza în ser, salivă, urină, materiile fecale, aerul expirat.
În mod curent în laborator se determină anticorpii specifici anti - H. pylori din ser, folosind
un antigen marcat enzimatic și impregnat pe o membrană. Complexul antigen - anticorp format este
un precipitat evidențiat printr-o reacție de culoare în prezența unui substrat cromogen. Anticorpii
formați sunt la început de tip IgM, apoi IgG și IgA și pot persista în ser și după încetarea infecției.
Ureaza se poate determina in vivo folosind uree marcată cu C13 (neradioactiv) sau C14
(radioactiv) care se administrează pacienților sub formă de soluție. Ureea este hidrolizată de urează
cu formare de amoniac și CO2, iar CO2 marcat trece din sânge în aerul expirat și se determină
cantitativ prin spectroscopie de masă (metodă costisitoare, C13) sau prin alte metode (pentru C14).
În unele situații reacția de determinare a antigenului bacterian se poate realiza pornind direct
de la produsul biologic/patologic recoltat de la pacient, fără o izolare prealabilă a agentului patogen
în cultură pură pe mediu caracteristic. De exemplu, determinarea în laborator a antigenului
caracteristic pentru Helicobacter pylori se realizează prin reacție imunocromatografică (folosește
anticorpi specifici acoperiți cu aur coloidal) direct din materiile fecale prelevate de la pacient. De
obicei determinarea antigenului din materiile fecale se recomandă a se efectua după tratament.

Card pentru testul rapid de detectare a antigenului de H. pylori

(https://bosonbio.en.made-in-china.com/product/lefmyrWVbFha/China-Rapid-Test-Card-H-Pylori-Antigen.html)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

XI. DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR CU BACTERII

DIN FAMILIA PSEUDOMONADACEAE

Pseudomonas aeruginosa este cel mai important reprezentant al familiei

Pseudomonadaceae şi al genului Pseudomonas; datorită capacităţii de adaptare şi factorilor de
virulenţă, poate produce infecţii foarte variate, de la infecţii tegumentare, infecții urinare,
bronhopneumopatii, infecții gastrointestinale, până la septicemii cu evoluţie fulminantă. La
persoanele cu reactivitate normală infecţiile sunt de obicei limitate, dar la persoanele spitalizate sau
cu reactivitate diminuată potenţialul diseminării şi apariţiei complicaţiilor este foarte mare. Este
frecvent izolată în mediul spitalicesc de pe suprafețe, de pe instrumente, dispozitive medicale, din
soluții antiseptice, produse medicamentoase sau cosmetice.

Etapele diagnosticului microbiologic

1. Recoltarea produsului patologic
În diagnosticul de laborator al infecțiilor cu Pseudomonas aeruginosa se poate porni de la o
varietate de produse biologice sau patologice: urină, materii fecale, spută, puroi, sânge. Pentru
infecţiile tegumentare supurative diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. Produsul
patologic se recoltează cât mai curând după debutul bolii şi se transportă la laborator cât mai rapid.
Probele recoltate se examinează macroscopic, puroiul putând avea un aspect sugestiv pentru
infecția cu Pseudomonas aeruginosa (culoare albastră sau galben-verzui fluorescentă).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic
Pentru examinarea microscopică se realizează două frotiuri, care se colorează Gram şi cu
albastru de metilen, apoi se examinează la microscop. Pe preparate se pun în evidenţă celule
epiteliale, celule inflamatorii şi bacili Gram negativi, de 1 - 5/0,5 - 1 µm, dispuşi în lanţuri scurte, în
perechi sau izolaţi.
3. Cultivarea pe medii de cultură
Izolarea bacteriilor din această specie se poate face pe medii simple, dar se recomandă totuși
mediul selectiv cu cetrimid, în special pentru prelevatele polimicrobiene. Cultivarea produsului
patologic pe mediul de cultură urmărește obţinerea coloniilor izolate, ca să se poată obţine o cultură
pură.
Pseudomonas aeruginosa creşte pe medii obişnuite la 30 - 37°C, în timp de 18 – 24 ore, dar
se pot folosi medii selective, uneori geloză - sânge. Coloniile sunt de tip S, pigmentate în mod
specific, cu colorarea şi a mediului în albastru sau galben-verde fluorescent (Fig. 52). Pentru
recunoașterea speciei aspectul coloniilor este important, numai 5-10% dintre tulpini neproducând
pigment, iar 1% dintre tulpini producând un pigment roșu sau negru. Cultura poate avea miros de
flori de tei sau iasomie; pe geloză - sânge se produce hemoliză beta; în mediul lichid cultura tulbură
uniform mediul, apoi se formează o peliculă aderentă, cenuşie, la suprafaţa acestuia, care în timp
evidenţiază pigmentul (Fig. 53, 54).
4. Identificarea microorganismelor
Se face pe baza mai multor caractere:
 caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram negativi, de 1 - 5/0,5 - 1 µm, relativ polimorfi;
 caractere de cultură:
• pe medii selective care favorizează pigmentogeneza, coloniile sunt de tip S, pigmentate
specific, cu colorarea mediului; coloniile pot prezenta o suprafaţă cu luciu metalic şi plaje de
autoliză; pentru stimularea sintezei de pigment (fluoresceină, piocianină) se folosesc mediile
King și agar - cetrimidă;
• cultura poate avea miros caracteristic de flori de tei sau iasomie;
• multiplicarea la 42°C poate fi utilă pentru identificare (se pot dezvolta la temperaturi între 5
- 42°C);
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

 caractere biochimice:
• sunt oxidazo - pozitive, catalazo - pozitive, citrat - pozitive, ONPG negative, degradează
oxidativ glucoza, hidrolizează gelatina, scindează ureea, nu fermentează lactoza, nu produc
H2S; pentru identificarea biotipurilor se poate utiliza auxonograma (testul de asimilare a
diferitelor substraturi ca sursă de carbon) pentru glucoză, citrat, malonat, acid lactic, acid
acetic etc.;
• pigmenţi caracteristici (albastru: piocianina; galben - verde fluorescent: fluoresceina sau
pioverdina);
• sistemele microtest comerciale se pot folosi de asemenea pentru identificarea biochimică a
izolatelor;
 se pot testa caracterele antigenice prin determinarea serotipurilor O prin reacții de aglutinare cu
seruri imun specifice; sensibilitatea la bacteriofagi (lizotiparea); capacitatea de sinteză de
bacteriocine; se pot face teste moleculare;
 antibiograma se realizează pentru supravegherea apariţiei unor tulpini rezistente la antibiotice;
este obligatorie pentru tulpinile izolate și se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată.

Fig. 52. Cultură de Ps. aeruginosa pe agar – cetrimidă Fig. 53. Evidențierea piocianinei (pigment verde)
(http://de.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa) produsă de Pseudomonas aeruginosa (stg.)
(http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa)

Fig. 54. Tulpină de Pseudomonas aeruginosa, producătoare de pioverdină

(http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pseudomonas_aeruginosa_pyoverdin.jpg)

Fig. 55. Galerie API NE cu rezultat pentru Pseudomonas aeruginosa

(http://www2.fiu.edu/~makemson/MCB3020Lab/API20neInstructions.pdf)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

XII. DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR CU TREPONEMA PALLIDUM

În patologia umană treponemele importante sunt reprezentate de Treponema pallidum

subspecia pallidum, agentul etiologic al sifilisului sau luesului. Celelalte subspecii ale speciei T.
pallidum sunt considerate agenţi etiologici ai unor boli nevenerice, iar alte specii ale genului sunt
bacterii comensale, cu localizare în cavitatea orală sau pe mucoasa genitală.
Bacteriile patogene din genul Treponema nu se pot cultiva pe medii artificiale. Sunt foarte
pretenţioase din punct de vedere al substratului nutritiv, strict aerobe sau microaerofile, spiralate,
subţiri, foarte mobile. Diagnosticul de laborator în cazul sifilisului primar sau secundar poate fi
bacteriologic sau serologic.

A. Diagnosticul bacteriologic
Diagnosticul bacteriologic în cazul infecțiilor cu Treponema pallidum presupune
următoarele etape:
1. Recoltarea probelor patologice (pentru efectuarea de preparate microscopice)
reprezentate de:
o lichidul clar din leziunile primare sau secundare, după îndepărtarea cu grijă a crustei;
o lichid de la nivelul unor leziuni ”umede” bogate în treponeme în cazul sifilisului congenital
timpuriu,
o probă recoltată din ganglionii limfatici regionali.
Recoltarea se face cât mai repede după debutul bolii şi înainte de începerea tratamentului cu
antibiotice. Probele se prelevează cu ansa sterilă sau pipetă Pasteur, ori aplicând direct lama sterilă
peste leziunea umedă şi acoperind apoi cu lamela de sticlă; se apasă uşor pentru îndepărtarea
bulelor de aer.
2. Transportul probelor patologice la laborator se realizează în maxim 20 de minute de la
prelevare, ceea ce presupune recoltarea probei în imediata vecinătate a laboratorului sau chiar în
laborator.
3. Examinarea preparatului microscopic se poate face cu ajutorul microscopului cu fond
întunecat sau se poate aplica reacţia de imunofluorescenţă directă.
a) Examinarea preparatului microscopic pe fond întunecat
−se pregătesc 2 sau 3 preparate microscopice, care să nu conţină hematii, leucocite, fragmente de
ţesut sau bule de aer, care se păstrează înainte de vizualizare în atmosferă umedă pentru a se
preveni uscarea;
−preparatele se examinează minim 10 minute, iniţial cu obiectiv uscat, ulterior cu obiectiv cu
imersie;
−pe preparate se vor observa microorganisme foarte subţiri, lungi (0,25-0,3/6-14 µm), spiralate, cu
8-14 spire regulate, strânse, adânci şi rigide, luminoase pe un câmp microscopic întunecat; cele
mobile nu sunt foarte rapide, prezintă mişcări de înşurubare, care nu deformează spirele; cele
imobile prezintă uşoare mişcări de translaţie, rotaţie lentă; dacă se pot exclude treponemele
saprofite, diagnosticul bacteriologic confirmă infecţia înainte de apariţia anticorpilor specifici;
−în cazul unui rezultat negativ nu se exclude diagnosticul de sifilis, se repetă recoltarea şi
examinarea.
Colorația negativă poate de asemenea să fie folosită în examinarea microscopică a
preparatelor executate. Proba prelevată se amestecă cu o picătură de tuș de India sau nigrozină, se
depune amestecul în strat subțire pe lamă și se lasă să se usuce. Tușul de India va colora fondul
preparatului dar nu și microorganismele prezente, care vor apărea transparente pe fondul negru al
câmpului microscopic.
b) Imunofluorescenţa directă
Imunofluorescența directă este o reacţie specifică, ce permite diferenţierea treponemelor
saprofite de cele patogene prin folosirea unor anticorpi specifici marcaţi fluorescent; reacția este
rapidă și specifică, dar fluorescența nu este permanentă.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

Dacă examinarea nu poate fi realizată imediat după recoltarea secreţiei, aceasta se recoltează
într-un tub capilar care se închide la flacără şi se transportă la 4°C; secreția este utilizată pentru
executarea unui frotiu, care se acoperă apoi cu ser imun cu anticorpi anti - Treponema pallidum
marcaţi cu izotiocianat de fluoresceină, obţinuţi de la pacienţi cu sifilis sau de la iepuri infectaţi cu
T. pallidum.

Fig. 56. Treponema pallidum – microscopie în câmp întunecat (a) și imunofluorescență directă (b)
(http://www2a.cdc.gov/stdtraining/ready-to-use/syphilis.htm)
(http://web.squ.edu.om/med-Lib/MED_CD/E_CDs/Pathologic%20Basis%20of%20Disease/ind2/record0004.html)

În laboratoarele de referinţă se aplică:

 inocularea treponemelor viabile la iepure, intratesticular sau cutanat; produsul patologic
recoltat de la pacient trebuie inoculat în maxim 60 minute de la recoltare, altfel
treponemele îşi pierd viabilitatea; testul infectivităţii la iepure (RIT) este metoda
standard de determinare a infectivităţii treponemelor;
 tehnici de biologie moleculară, cu sonde nucleotidice sau prin PCR.
B. Diagnosticul serologic
În diagnosticul serologic se utilizează teste netreponemice şi teste treponemice pentru
confirmarea infecției cu Treponema pallidum.
1. Testele nontreponemice utilizează antigene nontreponemice, care pot fi extrase din
anumite ţesuturi. Se pot folosi ca metode de triaj al infecţiilor noi (metode calitative) şi pentru
urmărirea eficienţei tratamentului (teste cantitative).
De exemplu, se poate folosi antigenul cardiolipinic extras din cordul bovin. Anticorpii
evidenţiaţi cu ajutorul acestui antigen sunt cei antilipoidici, numiţi şi reagine, care apar la 4 – 6
săptămâni de la infecţie, au un titru crescut în sifilisul secundar şi un titru redus în perioada de
latenţă şi în sifilisul terţiar.
Antigenul cardiolipinic poate fi folosit în reacții de fixare a complementului (RBW =
Reacția Bordet – Wasserman, detectează anticorpii Wasserman), reacții de floculare (VDRL =
Veneral Diseases Research Laboratory), reacții de aglutinare (RPR = Rapid Plasma Reagine).
Reacţiile frecvent folosite astăzi sunt:
a) VDRL (Veneral Diseases Research Laboratory) este o reacţie de floculare; se bazează pe
faptul că antigenele rămân dispersate în serul normal, dar formează grunji vizibili atunci când se
combină cu reaginele. Dacă se efectuează semicantitativ, pe două probe consecutive, se poate
aprecia eficacitatea tratamentului (scăderea de 4 ori a titrului în tratamentul eficient sau dimpotrivă,
creşterea de 4 ori dacă acesta nu e eficient) sau o infecţie activă în evoluţie, o reinfecţie (creşterea
de 4 ori a titrului). Etapele reacției sunt:
 serul de cercetat se clarifică prin centrifugare, se inactivează 30 minute la 56°C şi se
centrifughează din nou dacă apar particule în suspensie; dacă nu se prelucrează în decurs de 4
ore de la inactivare, serul se inactivează din nou timp de 10 minute la 56°C; testul se efectuează
la temperatura de 23 - 29°C, în plăcuţe cu godeuri, cu ser nediluat; fiecare test necesită martor de
antigen, martor sigur pozitiv, martor sigur negativ; se pot testa în acelaşi timp mai multe seruri,
cu o notare clară a godeurilor;
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

 se pun 0,05 ml ser de cercetat şi o picătură (1/60 ml) de antigen (după ce se agită bine); plăcuţa
cu godeuri se acoperă şi se ţine 4 minute pe agitator, la 180 de turaţii pe minut;
 rezultatul se citeşte imediat, pe fond negru, prin transiluminare; se începe cu martorii (negativ,
slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru antigen) şi apoi serurile de cercetat;
 reacţia este negativă dacă nu se formează flocoane; un rezultat negativ nu exclude total
probabilitatea unei infecţii (perioada de incubaţie sau un sifilis latent nu prezintă anticorpi); se
poate repeta reacţia peste o săptămână, o lună, trei luni;
 dacă apar flocoane mici în lichidul uşor tulbure rezultatul este slab pozitiv; în acest caz reacţiile
se pot repeta; dacă se presupune că o concentraţie prea mare de anticorpi a inhibat parţial sau
total reacţia de floculare (fenomenul de prozonă), se repetă reacţia cu diluţii de ser;
 dacă apar flocoane mari şi lichidul este clar (Fig. 57), rezultatul este intens pozitiv; se corelează
cu rezultatele la testele treponemice, la examenul bacteriologic, cu datele clinice şi
epidemiologice; un rezultat pozitiv al VDRL în condiiţile în care toate celelalte teste au rezultat
negativ este de cele mai multe ori fals pozitiv, întâlnit de exemplu în infecţii virale (hepatite,
rujeolă, pneumonii, mononucleoză infecţioasă), în boli de colagen, la persoane drogate, în vârstă
sau la femei însărcinate.
b) RPR (Rapid Plasma Reagine) este o reacţie de aglutinare ce se realizează pe carduri din
plastic, între un antigen (o suspensie tip VDRL modificată, ce conţine particule de cărbune) şi serul
de cercetat. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpii specifici, particulele lipidice ale antigenului sunt
aglutinate, cărbunele este coaglutinat şi apar granule negre pe fondul alb al cardului de plastic (Fig.
58); reacţia negativă apare ca un amestec gri uniform; dacă se realizează diluţii de ser, reacţia are şi
o valoare cantitativă.
c) RBW (Reacţia Bordet Wasserman) este o reacţie de fixare a complementului ce pune în
evidenţă anticorpii Wasserman, prezenţi la 2 - 3 săptămâni de la debutul infecţiei în serul pacienţilor
şi la 4 - 8 săptămâni în LCR. Folosită încă din 1906, reacţia Bordet Wasserman nu mai este utilizată
atât de frecvent.
Se mai pot efectua:
− Test RST (Reagin Screen Test),
− Test USR (Unheated Serum Reagin),
− Test TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test).
Aceste teste pot avea rezultate fals pozitive, deoarece antigenele nu sunt specifice şi
anticorpii respectivi pot să apară şi în alte situaţii, ca de exemplu în alte boli bacteriene sau virale, în
sarcină. În cazul rezultatelor pozitive se efectuează obligatoriu confirmarea prin teste specifice.

a b c

Fig. 57. VDRL – rezultat negativ (a), slab pozitiv (b), intens pozitiv (c)
(http://www.slideshare.net/harshayaramati/lab-diagnosis-of-syphilis)

Fig. 58. Rezultat pentru testul RPR în diagnosticul sifilisului

(http://microbeonline.com/rapid-plasma-reagin-rpr-test-principle-procedure-and-interpretations/)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

2. Testele specifice (treponemice) sunt de tip RFC, RIF şi RIE, utilizează antigene
treponemice extrase din T. Reiter (cu antigen proteic de grup, nepatogenă, cultivabilă, înrudită
antigenic cu T. pallidum) sau tulpina Nichols (tulpină de referință, cu antigen polizaharidic de tip) şi
evidenţiază anticorpii antiproteici, antipolizaharidici şi imobilizinele. Aceşti anticorpi sunt prezenţi
ani de zile şi testele nu pot fi folosite în aprecierea eficienţei tratamentului.
Reacţiile folosite sunt:
a) testul FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody - absorbtion) este o reacţie de
imunofluorescenţă indirectă (Fig. 59); iniţial se foloseau diluţii ale serului de 1/5, ulterior de 1/200
datorită rezultatelor fals pozitive, în reacţii FTA; din 1962 se foloseşte un extract antigenic de
tulpină Reiter obţinut prin ultrasonicare, pentru a mări specificitatea reacţiei;
 serul de cercetat sau LCR-ul de la pacient se diluează 1/5 cu antigenul treponemic de grup,
comun treponemelor comensale şi patogene;
 pe lame pe care în spoturi este fixată tulpina Nichols de T. pallidum se depun probele şi
martorii corespunzători; dacă în probele de ser sau LCR există anticorpi specifici anti -
Treponema pallidum, aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe lamă şi
complexele imune nu vor fi îndepărtate prin spălările ulterioare;
 lamele se tratează apoi cu un conjugat fluorescent anti-Ig umane, se incubează, se spală pentru
îndepărtarea conjugatelor nelegate şi se examinează la microscopul cu UV; dacă rezultatul
este pozitiv, pe lamă apar treponeme fluorescente galben-verzui.
a) testul TPHA (test de hemaglutinare pentru Treponema pallidum) este o reacţie de
hemaglutinare pasivă; se utilizează hematii de oaie sau pasăre sensibilizate (fixate) pe care
este adsorbit antigenul treponemic extras din tulpina Nichols; ca martor negativ se foloseşte
o suspensie de hematii nesensibilizate (fără antigen legat chimic); se pun în contact
hematiile sensibilizate cu serul de cercetat (calitativ sau semicantitativ), iar în prezenţa
anticorpilor specifici anti - T. pallidum hematiile aglutinează (Fig.60); în reacţia negativă şi
la martor hematiile nu aglutinează şi se depun sub formă de buton pe fundul godeului;
pentru testarea sângelui donatorilor se folosesc variante automatizate ale reacţiei;

Fig. 59. Schema reacțiilor în testul FTA-Abs

(http://www.slideshare.net/doctorrao/syphilis-basics)

Fig. 60. TPHA – aspectul reacţiilor şi interpretarea rezultatelor

(http://www.esanatos.com/ghid-medical/microbilologie/Treponema-pallidum61145.php)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

c) testul TPI (Testul de imobilizare a treponemelor), care evidenţiază imobilizinele, a fost

multă vreme reacţia standard în diagnosticul sifilisului; se foloseşte o suspensie de treponeme vii
din tulpina Nichols, obţinută din şancrul testicular de la iepure, care se pune în contact cu
complement şi cu serul de cercetat pe un preparat proaspăt, ce se examinează la microscopul cu
fond întunecat; dacă mişcarea activă a treponemelor se reduce, reacţia este pozitivă, în serul de
cercetat sunt anticorpi specifici anti-Treponema.
d) Tehnici ELISA (RIE, imunoenzimatice) de detectare a anticorpilor anti - T. pallidum de
tip IgM;
e) Tehnica Western blot pentru detectarea anticorpilor anti - T. pallidum din clasele de
imunoglobuline IgM şi IgG.
La interpretarea reacţiilor se ţine cont şi de examenul clinic şi evaluarea paraclinică, precum
şi de contextul epidemiologic. Un rezultat negativ la VDRL şi TPHA de regulă exclude infecţia, dar
în condiţiile unei suspiciuni puternice de infecţie incipientă (înainte de formarea anticorpilor) se
reface testul peste 3 săptămâni. Un rezultat pozitiv la VDRL şi negativ la TPHA necesită retestare
de asemenea peste 3 săptămâni, dacă la retestare rămân la fel se interpretează ca reacţie fals
pozitivă.

Fig. 61. Schemă de interpretare a diagnosticului de laborator

în suspiciunea infecției cu Treponema pallidum
(http://www.eyecalcs.com/DWAN/pages/v8/v8c070.html)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

XIII. DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR CU MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Genul Mycobacterium cuprinde peste 80 de specii diferite, unele dintre ele patogene şi altele
condiţionat patogene sau saprofite, larg răspândite în natură. Infecţiile cu M. tuberculosis pot avea
diferite localizări, cea mai frecventă fiind cea pulmonară, pacienţii cu tuberculoză pulmonară fiind
sursa cea mai importantă de infecţie pentru persoanele din jur.
Diagnosticul poate fi sugerat de elemente clinice, radiologice, dar trebuie confirmat prin
izolarea şi identificarea Mycobacterium tuberculosis var. hominis în diagnosticul de laborator. Se
pot parcurge etape ale diagnosticului microbiologic, dar se poate efectua și diagnostic imunologic
sau serologic.

Etapele diagnosticului de laborator

A. Diagnosticul microbiologic

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic la laborator trebuie să respecte regulile

de asepsie şi antisepsie, pentru a preveni suprainfectarea produsului, pentru a proteja personalul
medical implicat; trebuie să fie recoltat cât mai aproape de debutul bolii şi înainte de începerea
vreunui tratament cu antibiotice. Se pot recolta: spută, lichid de spălătură bronşică, LCR, urină,
lichid peritoneal, pleural, pericardic, puroi, în funcţie de forma clinică a bolii.
Proba de spută se obține în mod corespunzător de la pacienții cooperanți, prin tuse
spontană, profundă și supravegheată, după periajul simplu al dinților, clătirea energică a gurii și
gargară cu apă, aproximativ 3 ml de probă în recipient steril de aproximativ 100 ml, cu gura largă și
capac. La persoanele cu tuse slab productivă se poate stimula expectorația prin inhalare de aerosoli
calzi cu soluție salină 10% și glicerinată 15%. Proba se examinează în cel mult o oră de la
prelevare. Nu se utilizează un mediu de transport și nici nu se refrigerează proba. Uneori este
necesară centrifugarea produsului patologic, alteori sputa trebuie decontaminată (de exemplu prin
tratare cu NaOH 4%) şi neutralizată pentru cultivare.
2. Examenul microscopic presupune realizarea a minim trei frotiuri din produsul patologic
recoltat şi transportat corespunzător, colorate Gram, Ziehl - Neelsen şi cu albastru de metilen.
Preparatele se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează:
 prezenţa celulelor de la nivelul tractului respirator (de exemplu macrofage alveolare),
 prezenţa celulelor inflamatorii (de exemplu leucocite),
 prezenţa bacililor acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR); aceştia sunt bacili subţiri, rectilinii, de
0,4/3μm, acido-alcoolo-rezistenţi, roşii pe fond albastru la coloraţia Ziehl – Neelsen imobili,
necapsulaţi, nesporulaţi (Fig. 62).
Tehnica Ziehl - Neelsen se aplică pentru evidenţierea celulelor de Mycobacterium
tuberculosis (care sunt acido-alcoolo-rezistente) în produse patologice prelevate de la bolnav
(spută). Bacteriile acestui gen se colorează greu prin tehnici uzuale, datorită cantităţilor mari de
lipide ce formează un înveliş protector în jurul celulelor. După colorare, celulele rezistă la acţiunea
decolorantă a acizilor concentraţi (acid sulfuric 20%), iar unele specii şi la cea a alcoolilor (alcool
etilic 96º). Sunt bacterii Gram (+), imobile, nesporulate. Acido-rezistenţa se datorează conţinutului
bogat în lipide (acizi graşi caracteristici, numiţi acizi micolici). Bacilii non-tuberculoşi sunt acido-
rezistenţi, dar nealcoolo-rezistenţi. De multe ori produc în cultură pigmenţi.
Se poate face şi o coloraţie cu auramină-rhodamină, timp de 10 minute, facilitată de fenol,
în contrast cu acridin-orange, caz în care frotiul trebuie examinat cât mai repede după colorare, la
microscop cu UV (Fig. 63). Bacilii acido-alcoolo-rezistenți apar fluorescenți la vizualizare în UV.
Examinarea microscopică a preparatului realizat din produsul patologic (baciloscopie) are şi
o semnificaţie cantitativă: se calculează numărul de BAAR per număr de câmpuri microscopice
examinate, câte 10 - 30 la coloraţia fluorescentă, câte 100 - 300 la coloraţia Ziehl - Neelsen.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

De exemplu un rezultat pozitiv slab, notat cu “1+”, este dat de 10 - 99 BAAR/100 câmpuri
microscopice la coloraţia Ziehl - Neelsen. Un rezultat intens pozitiv, notat “3+” este dat de > 10
BAAR/1 câmp microscopic la coloraţia Ziehl - Neelsen. Baciloscopia negativă nu exclude
diagnosticul de tuberculoză.

Tabel 13. Interpretarea cantitativă a baciloscopiei

Ziehl-Neelsen 1000x Notarea rezultatelor Auramină - Rhodamină
Mărire 250x Mărire 450x
0 BAAR NEGATIV 0 BAAR 0 BAAR
1-9 BAAR/100 câmpuri număr exact BAAR/ Se împarte numărul Se împarte
100 câmpuri BAAR observaţi/30 numărul BAAR
10-99 BAAR/100 câmpuri POZITIV BAAR 1+ câmpuri observaţi/
1-10 BAAR/câmp POZITIV BAAR 2+ la 10 30 câmpuri
>10 BAAR/câmp POZITIV BAAR 3+ la 4

3. Cultivarea pe mediu de cultură complex

Se folosesc medii lichide (bulion 7H9) sau solide (Löwenstein - Jensen pe bază de ou,
suplimentat cu verde malahit sau chiar antibiotice selective, mediu Middlebrook 7H10 şi 7H11 pe
bază de agar). Dezvoltarea M. tuberculosis rezistente la HIN şi a M. tuberculosis var. bovis este
favorizată de suplimentarea mediului Löwenstein - Jensen cu 0,4% piruvat de sodiu. Formele
patogene sunt foarte pretenţioase în ceea ce priveşte cerinţele nutritive: cresc greu pe medii
nutritive, numai pe cele speciale bogate în lipide.
Produsul patologic (sputa) se decontaminează cu NaOH 4% (maxim 30 minute) şi se
omogenizează, după care se neutralizează cu HCl 8%. După centrifugare 15 minute la 3000
rotaţii/minut, se depune inoculul pe mediu astfel încât să acopere suprafaţa mediului înclinat. După
48 - 72 ore de incubare la 37ºC în poziţie înclinată, pentru evaporarea excesului de lichid (dopul
fiind înfiletat incomplet), tuburile se pun în poziţie verticală şi se înfiletează dopul complet.
Mediile se incubează la 35 - 37ºC, în atmosferă de 8-10% CO2, timp de 6-8-12 săptămâni
(cu notarea rezultatelor la 21, 30, 45, 60 zile), rata de diviziune pentru BAAR fiind de 12 - 27 ore.
Se pot folosi şi sisteme de cultivare “rapide”, de exemplu sistemul Bactec, cu depistarea creşterii
bacteriene în 4 - 25 zile. Cultura se interpretează şi cantitativ (Tabel 14).
În medii lichide Mycobacterium formează la suprafaţă un văl subţire, care treptat se
îngroaşă şi se cutează, se fragmentează.

Tabel 14. Interpretarea cantitativă a culturii de Mycobacterium tuberculosis

Creştere bacteriană Notarea rezultatului
Mai puţin de 30 colonii Nr. exact de colonii/tub
30 - 100 colonii Cultură M. tuberculosis Poz.1+
Mai mult de 100 colonii izolate Cultură M. tuberculosis Poz. 2+
Colonii confluente Cultură M. tuberculosis Poz. 3+
Contaminare cu alte Cultură contaminată
microorganisme decât micobacterii

Fig. 62. M. tuberculosis – colorație Ziehl - Neelsen Fig. 63. M. tuberculosis – colorație fluorescentă
(http://www.scilogs.com/in_scientio_veritas/tb-rational-vaccine-design/) (http://www.thehindu.com/sci-tech/health/tb-how-many-young-children
-are-wrongly-diagnosed-as-diseasefree/article5240319.ece)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

a b

Fig. 64. Aspectul culturii și coloniilor de M. tuberculosis pe mediu Löwenstein - Jensen

(a - http://atlas.microumftgm.ro/bacteriologie/bactsp/tbc.php)
(b - http://youritablets.com/how-to-recognize-the-symptoms-of-tuberculosis/)

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic

Se face pe baza caracterelor:
 morfotinctoriale (frotiul colorat pune în evidenţă prezenţa BAAR);
 de cultură, M. tuberculosis var hominis şi M. tuberculosis BCG formând colonii rugoase,
conopidiforme (Fig. 64), iar tulpinile rezistente la HIN (Hidrazidă) formând colonii de tip S;
 biochimice, utilizând testele: producerii de niacină, reducerii nitraţilor, catalazei la 22ºC şi la
68ºC, hidroliza Tween 80 şi susceptibilitatea la TCH (hidrazida acidului 2-tiofen carboxilic) şi
PAS (acidul p-amino-salicilic);
 antigenice;
 de patogenitate - prin inocularea produsului patologic la cobai;
 fenotipice moleculare - prin studiul cromatografic al acizilor graşi din structura peretelui
celular;
 genotipice - prin PCR;
 de sensibilitate la mycobacteriofagi.
5. Antibiograma utilizează metode directe sau indirecte.
Metodele directe se aplică pentru produsele patologice intens contaminate (pozitive la
microscopie), inoculul fiind preparat direct din produsul patologic.
Metodele indirecte utilizează un inocul proaspăt standardizat, obţinut din cultura tânără (de
21 de zile) obţinută pe mediul solid sau o subcultură.
Inoculul se depune pe suprafaţa mediului înclinat în care a fost inclusă substanţa
antituberculoasă. În paralel inoculul se depune și pe un mediu fără antibiotic, ce va fi martor pentru
creșterea bacteriană.
Toate etapele diagnosticului microbiologic se aplică în laboratoare specializate.

B. Diagnosticul imunobiologic constă în intradermoreacţia (IDR) la tuberculină (derivat

proteic purificat = PPD); se injectează intradermic o cantitate mică de tuberculină (substanță extrasă
din cultura bacililor tuberculoşi); după 72 ore, o reacţie pozitivă indică prezenţa bacteriilor, care pot
fi latente. Testul se folosește pentru detectarea infecțiilor latente în populație.

C. Diagnosticul serologic pune în evidenţă anticorpii antimycobacterieni prin teste

imunoenzimatice de tip ELISA.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

XIV. PRINCIPII DE DIAGNOSTIC PENTRU INFECŢIILE

CU MICOPLASME ŞI UREAPLASME

Micoplasmele sunt cele mai mici microorganisme care se pot cultiva pe medii acelulare în
laborator. Sunt bacterii lipsite de perete celular, la care membrana devine înveliș extern. Câteva
dintre speciile genurilor Mycoplasma și Ureaplasma sunt implicate în patologia umană, alte specii
trăiesc liber în mediul extern. Mycoplasma pneumoniae determină infecții respiratorii, M. hominis a
fost izolată din infecții cu localizare genitală, Ureaplasma urealyticum determină uretrite non-
gonococice sau alte infecții uro-genitale.
Diagnosticul de laborator al infecțiilor micoplasmatice poate fi microbiologic, dar de cele
mai multe ori este serologic, în funcție de afecțiunea produsă de specia implicată.

A. Diagnosticul bacteriologic
1. Prelevarea produsului patologic se realizează ținând cont de regulile generale de
asepsie, cât mai curând după debutul bolii, cu transport și prelucrare cât mai rapide. Produsul
patologic poate fi reprezentat în cazul infecțiilor respiratorii de secreții faringiene, nazale, spută, iar
în cazul infecțiilor genito-urinare de secreții genitale sau urină. Produsul patologic care nu se poate
prelucra imediat în laborator, poate fi transportat în containere frigorifice (la 4°C) și pe medii de
transport.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic recoltat nu aduce beneficii reale pentru
diagnostic, datorită dimensiunilor reduse ale micoplasmelor (125 – 250 nm). Se pot realiza însă
frotiuri care să fie supuse unui test de imunofluorescență. Antigenele de M. pneumoniae pot fi puse
în evidență în probele de spută prin teste imunoenzimatice de tip ELISA.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic
Pentru izolarea micoplasmelor se folosesc medii de cultură speciale. De exemplu, unul
dintre cel mai frecvent folosite medii este mediul PPLO (mediu îmbogățit, pe bază de infuzie de
cord bovin, cu indicator de pH roșu fenol, substanțe nutritive și substanțe selective, care inhibă
creșterea altor categorii de bacterii, de exemplu penicilină și/sau acetat de taliu). Bacteriile genului
Ureaplasma necesită prezența ureei pentru a se dezvolta, sunt relativ sensibile la taliu, iar pH-ul
mediului trebuie să fie 6,0.
Produsul patologic se însămânțează pe mediul solid PPLO, dar și în mediul lichid cu aceeași
formulă (0,2 ml produs patologic în 1,8 ml bulion PPLO), după care se termostatează la 35 - 37°C
în atmosferă de 5% CO2 până la 30 de zile. Inoculul lichid se depune în volum de 0,1 ml pe
suprafața mediului și se omogenizează eventual cu o baghetă de sticlă sterilă; dacă produsul
patologic este recoltat pe un tampon, se poate face însămânțarea direct cu tamponul sub formă de
striuri. Pentru a preveni deshidratarea mediului se etanșeizează cutia cu bandă adezivă. Produsul
patologic poate fi diluat zecimal și se poate cultiva și pe ou embrionat de găină (intravitelin) sau în
culturi de celule.
În bulion PPLO dezvoltarea culturii și fermentarea glucozei determină acidifierea mediului
și virarea culorii indicatorului de pH de la roșu – portocaliu spre galben (în decurs de 10 – 21 zile).
Confirmarea prezenței micoplasmelor se face prin repicare pe medii solide cât mai curând după ce a
avut loc virajul culorii în mediul lichid. Coloniile crescute pe mediu solid (în cel puțin 72 de ore) se
observă la stereomicroscop cu obiectiv 40x – 60x, deoarece coloniile de Mycoplasma spp. pot avea
diametru de 20 – 300 μm.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic
Identificarea micoplasmelor se face pe baza mai multor caractere:
 caracterele morfotinctoriale nu sunt utile în diagnosticul bacteriologic, datorită dimensiunilor
reduse ale micoplasmelor;
 caracterele de cultură:
- se observă coloniile crescute pe mediu solid de cel puțin două ori pe săptămână, la
stereomicroscop; aspectul acestora este fin granular, muriform, iar unele colonii au aspect de ”ou
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

- ochi” (ou prăjit, fried egg) cu centrul dens, opac și o zonă clară periferică; acest al doilea aspect
este considerat de către unii autori ca fiind tipic pentru micoplasme, dar și bacteriile în formă ”L”
pot determina formarea de astfel de colonii, ceea ce implică un diagnostic diferențial;
- coloniile de M. hominis au dimensiuni de 20 – 300 μm;
- coloniile de Ureaplasma au mai puțin de 100 μm diametru (de obicei 30 – 40 μm), deoarece prin
hidroliza ureei și eliberarea amoniacului mediul devine alcalin; dacă se adaugă în mediul sulfat
de magneziu, coloniile de Ureaplasma vor fi colorate în maro închis Fig. 65;
 caracterele biochimice (Tabel 15):
- multe dintre micoplasme fermentează glucoza (M. pneumoniae, M. fermentans, M. genitalium),
nu metabolizează arginina (M. pneumoniae, M. genitalium, Ureaplasma urealiticum);
- nu hidrolizează ureea (cu excepția Ureaplasma urealyticum); peste cultura de pe mediul solid se
adaugă 2-3 ml reactiv Shepard steril; după 1 – 5 minute la temperatura camerei se observă la
stereomicroscop coloniile urează - pozitive colorate în brun-auriu, cele urează - negative
necolorate;
- M. pneumoniae reduce aerob tetrazoliul (test care se poate realiza direct pe placa pe care sunt
prezente coloniile presupuse a fi Mycoplasma pneumoniae); tetrazoliul este un compus incolor
care devine roșu prin reducere la formazan; se adaugă 2 – 3 ml soluție de acetat de tetrazoliu
peste cultura pe mediu solid, se incubează 15 – 60 minute la 37°C; după 15 minute coloniile de
M. pneumoniae devin roz (reacție pozitivă), apoi purpurii până la negre în 3 – 4 ore, coloniile
altor micoplasme rămân necolorate (reacție negativă);
 alte caractere utile în diagnostic:
- proprietatea micoplasmelor din specia M. pneumoniae de a fi adsorbite pe hematii de cobai;
hemadsorbția este evidențiată cu ajutorul unei suspensii 4% de hematii de cobai care se depune
peste coloniile formate pe placă; după incubare 30 minute la 37°C se spală de 3 ori suprafața
mediului cu câte 2-3 ml bulion PPLO prin mișcări de rotație, pentru a îndepărta hematiile
neadsorbite; coloniile acoperite cu hematii observate la stereomicroscop cu mărire de cel puțin
50x sunt de M. pneumoniae;
- colorarea imunofluorescentă a coloniilor suspecte cu seruri specifice marcate cu fluorocromi;
- inhibarea dezvoltării coloniilor de Mycoplasma pneumoniae prin folosirea unor discuri
impregnate cu anticorpi specifici; anticorpii cuplați cu antigenele de suprafață inhibă dezvoltarea
culturii în jurul discurilor respective;
- teste moleculare pot ajuta la identificarea micoplasmelor, de exemplu teste de hibridizare a
ADN-ului, analiza electroforetică a proteinelor celulare, hidroliza enzimatică a ADN-ului
micoplasmelor cu endonucleaze de restricție, teste de amplificare genică prin PCR.
5. Testarea sensibilității micoplasmelor la antibiotice nu beneficiază de tehnici standard,
de obicei se aplică tratamente prelungite (de aproximativ 3 săptămâni) cu eritromicină, alte
macrolide sau tetraciclină. Micoplasmele sunt rezistente față de antibiotice care afectează sinteza
peretelui celular bacterian.
B. Diagnosticul serologic
În timpul infecțiilor cu micoplasme se produc mai multe categorii de anticorpi, dintre care
unii neutralizează antigenele, alții funcționează ca autoanticorpi. Un titru crescut de aproximativ 4
ori de IgG este considerat un indiciu al infecției recente, dar un nivel ridicat al imunoglobulinelor
totale nu este semnificativ în acest sens (titrul rămâne crescut și la un an după infecție).
Se pot folosi teste de aglutinare pasivă (hemaglutinare indirectă, latex aglutinare), în care
hematiile sau particulele de latex sunt îmbrăcate cu antigene de Mycoplasma pneumoniae. Prin teste
imunoenzimatice de tip ELISA se pot evidenția atât antigenele de M. pneumoniae din probele de
spută, cât și anticorpii de tip IgM din infecțiile acute. Deoarece anticorpii fixatori de complement
apar tardiv în infecțiile cu micoplasme, reacțiile de fixare a complementului (RFC) sunt utile numai
în studii epidemiologice.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice - Ionica Deliu

Tabel 15. Caractere de patogenitate și biochimice ale unor specii de micoplasme

(după Buiuc și Neguț, 2009)

Ureaplasma
pneumoniae

urealyticum
M. hominis
fermentans

genitalium
salivarium
M. bucale

M. orale
Caracteristici

M.

M.

M.

M.
Colonizare la nivelul orofaringelui + + + + + ? + +
Colonizare la nivelul tractusului - - - - + + + +
genito-urinar
Patogenitate - - - + + + + +
Fermentarea glucozei - - - + + + - -
Hidroliza argininei + + + - + - + -
Hidroliza ureei - - - - - - - +
Reducerea tetrazoliului -/+ -/- -/slab +/+ -/+ slab -/- -/-
(Aerob/Anaerob) pozitiv pozitiv/+
Hemadsorbția (eritrocite de cobai) - - - + - + - + numai serovar
uman 3

Fig. 65. Imagine la microscop a coloniilor de M. hominis ATCC 23114 (aspect ”fried egg”)
și de Ureaplasma urealyticum ATCC 27618 (colonie închisă la culoare)
(https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/SP4Media.htm)

Fig. 66. Imagine la microscop a coloniilor de M. pneumoniae

(http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&id=1894)