Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cuprins
Culturi de celule
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a
apoptozei
Citometrie in flux
Analiza ciclului celular
Metode de dozarea a proteinelor
Electroforeza, ELISA, Western blot
Tehnici de imunohistochimie simpla si dubla
Tehnica PCR si Real-Time PCR
Variante si aplicatii ale tehnicii PCR: MS-PCR, SNP-PCR, PCRRFLP
Microarray
Secventiere genica
Transfectie si clonare
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
Cultura organotipic - celule de diferite tipuri sunt recombinate n rapoarte
determinate experimental i relaii spaiale, pentru a crea un component al
organului de origine
obinerea unui echivalent de piele: Keratinocitele epidermale cresc expuse
la aer pe o matrice de colagen nativ de tip I (extras din tendon de coad de
obolan sau piele de viel) n care sunt nglobate fibroblaste viabile
- reorganizeaz matricea prin producerea de componente ale MEC
- celulele sunt hrnite prin difuzia mediului de cultur de la baza recipientului de
cultur (medii definite sau ce conin ser)
CULTURI DE CELULE
Cultura histotipic (histiotipic sau histocultura) - cultivarea unui singur tip celular la
densitate mare ntr-o matrice tridimensional
Permite studiul interaciilor celul-celul i celul-matricereconstituirea structurilor
celulare tridimensionale n:
agregate celulare n suspensie (celulele disociate sunt cultivate pe un agitator giratoriu ce le
permite s reasocieze n clusteri tridimensionali de 150- 240 m denumii sferoizi mas
heterogen de celule: proliferative, latente i necrotice)
gel de colagen (celule epiteliale mamare structuri tubulare i glandulare mamare, celule
endoteliale structuri vasculare)
Celulele din sferoizi - menin funciile lor difereniate pe o perioad extins de cultur i
ofer caracteristicile din vivo ntr-o manier uor de manipulat in vitro
Aplicaii ale culturilor de sferoizi:
- Teste de toxicitate
- Studii de metabolism
- Screening de medicamente (ofer potenialul de a reduce semnificativ numrul de
animale folosit n screening de medicamente)
Celule capabile de a forma sferoizi: HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells),
HUAEC (Human Umbilical Artery Endothelial Cells), HUSMC, (Human Uterine Smooth
Muscle Cells) HMVEC (Human Microvascular Endothelial Cells), celule din citotrofoblast
uman, BAEC (Bovine Arterial Endothelial Cells), celule din gliom C6 i diferite tipuri
celulare epiteliale
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
cultur de mas se cultiv un numr mare de celule care
colonizeaz baza recipientului i formeaz un strat de celule relativ
uniform
- celulele care supravieuiesc procedurii de izolare se divid - dup
un numr de generaii formeaz un monostrat celular
cultur clonal - numrul de celule cultivate este relativ mic astfel
nct ele se fixeaz de suport la o anumit distan unele de celelalte
- proliferarea celulelor determin formarea de colonii individuale
sau clone celulare, ale cror membri sunt derivai din aceeai celul
iniial
Cele dou tipuri de culturi celulare tind s aib:
- cerine de cretere diferite
- caracteristici diferite
- avantaje diferite n ceea ce privete studiul activitilor celulare
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
celulele aderente (majoritatea celulelor normale) - dependente de fixarea
de suport i se propag ca un monostrat celular
- proliferarea celular - numai prin aderare de suport
- nceteaz cnd celulele devin confluente inhibiie de contact a
creterii (Abercrombie i Heaysman (1954) fenomen incomplet elucidat)
-contactele celul-celul prin glicoproteine specifice din membrana
plasmatic a cror component glican interacioneaz cu receptori
principalul principiu reglator al creterii celulare
- E-cadherina molecul de adeziune homofilic important n
inhibiia de contact a celulelor epiteliale normale (inhibat sau pierdut n
numeroase carcinoame)
celulele n suspensie - pot supravieui i prolifera fr a fi fixate de
suport (celulele hematopoietice, anumite linii celulare transformate i
celule derivate
din tumorile maligne pot fi crescute n suspensie independente de fixare
CULTURI DE CELULE
1)Tipul epitelial-like:
- celule care sunt fixate de support i apar
aplatizate i poligonale - keratinocite epidermale
umane n cultur primar
2) Tipul limfoblast-like:
- celule care nu se fixeaz de substrat n mod
normal i rmn n suspensie cu o form sferic
neutrofile polimorfonucleare umane
3) Tipul fibroblast-like:
- celule care sunt fixate de support i apar
alungite i bipolare, formnd frecvent vrtejuri n
cultura confluent - fibroblaste dermale n
cultur primar
CULTURI DE CELULE
Culturile primare - multiplicarea celulelor ce migreaz dintr-un
fragment de esut (cultura de explant): fibrinogenul i trombina
favorizeaz aderarea esutului de suport
-prin dezintegrarea esutului prin metode
enzimatice (tripsina, hialuronidaza, colagenaza), chimice (EDTA)
sau mecanice
Cultura de explant: piese mici de esut fixate de recipientul de
cultur i plasate n mediul de cultur celulele individuale se vor
deplasa din esutul explantat pe suprafaa suportului de cultur, de
unde vor ncepe s se divid i s creasc
CULTURI DE CELULE
Culturile celulare finite (secundare):
formate dup prima subcultivare (pasaj)
a culturii primare numr limitat de
diviziuni senescen fibroblastele
umane
normale
50-100
dublri
populaionale senescen
Extinderea
potenialului
proliferativ
introducerea
unor
gene
virale
transformante (gena T-large antigen din
virusul simian SV40)
Linii celulare continue: potenial
proliferativ nelimitat att timp ct sunt
meninute condiiile de cultivare =
imortalizate - se coreleaz frecvent cu
tumorigenicitatea celulele
CULTURI DE CELULE
CULTURI DE CELULE
Henrietta Lacks
1920-1951
CULTURI DE CELULE
MEDIILE COMPLETE
Aminoacizi
Vitamine
Sruri
Glucoz
Suplimente organice
Hormoni i factori de cretere
Antibiotice
Ser
CULTURI DE CELULE
GSH assay
- evaluarea stresului oxidativ
CMTPX
Anexina V-FITC
- Se leaga de fosfatidilserina expusa
la exteriorul membranei celulare lezate
CITOMETRIE IN FLUX
Flux=miscare, citos=celula, metrie=masurare
Analizeaza celule aflate n suspensie din: snge, lichid sinovial,
ganglioni limfatici, tumori solide
Este o metod de surare a caracteristicilor fizice i/sau
biochimice ale particulelor (celule, nuclei, organite celulare):
Mri ea
Granularitatea
Cantitatea de ADN
A tige e de suprafa
Metod de sortare a celulelor
CITOMETRIE IN FLUX
CITOMETRIE IN FLUX
CE MASOARA CITOMETRIA DE FLUX LA NIVELUL CELULELOR?
Dimensiunea celulelor
Densitatea celulelor
CITOMETRIE IN FLUX
ETAPE
1.
2.
Marcarea celulelor
3.
Achiziia datelor
4.
Stocarea datelor
5.
Interpretarea datelor
CITOMETRIE IN FLUX
Antigen
HGPRT- = Hipoxantin-guanozin-ribozil-transferaza
HAT = hipoxantin-aminopterina-timidina
Fuzionarea
celulelor
HIBRIDOM
HGPRT-
Mielom
HGPRT-
Plasmocite
producatoare de Ac
HGPRT+
Testarea clonelor
Cultivarea
hibridoamelor
Hibridoamele se separa si
se cultiva
Clonele dorite
se cultiva sau
se
congeleaza
Mentinerea
hibridoamelor in
soareci
Anticorpii monoclonali sunt
purificati
CITOMETRIE IN FLUX
Ac. monoclonali
- Toate moleculele de Ac sunt identice dpdv imunochimic si
recunosc acelasi epitop de pe un antigen
- Specificitate f. mare
- Fara variatii de la un lot la altul
Ac. policlonali
-fiecare molecula de Ac va recunoaste epitopi diferiti de pe Ag
- Poate satura u a tige , emitand un semnal mai mare
- Este mai putin specific
- Poate avea variatii mari de la un lot la altul
Ac. izotip
Legare nespecifica - alte regiuni ale Ac se pot lega la epitopii Ag.
- Pentru a cuantifica acest efect se foloseste Ac. izotip: Ac ale
carui regiuni variabile sunt nespecifice. Prin urmare, orice legare
va fi datorata interactiei nespecifice a regiunii constante cu Ag
CITOMETRIE IN FLUX
CITOMETRIE IN FLUX
CITOMETRIE IN FLUX
CITOMETRIE IN FLUX
Sistem fluidic
Sistem optic
Sistem electronic
CITOMETRIE IN FLUX
SISTEMUL FLUIDIC - celulele sunt analizate individual pentru a realiza
acest lucru, celulele sunt invelite intr-un flux de lichid acest proces este
numit focusare hidrodinamica"
Camer de
curgere
Ac de injecie
Lichid de
nveli
Flux
Laminar
(sir indian)
CITOMETRIE IN FLUX
SISTEMUL OPTIC DE EXCITAIE Intersectarea cu un fascicul de
lumina surse laser:
Argon
UV 350/364 nm
Visible 458 465 472 488 496 502 515
nm
Krypton
UV 350/356 nm
Visible 468 476 482 520 530 568 647
676 nm
Helium/Neon 633 nm
CITOMETRIE IN FLUX
SISTEMUL OPTIC
Conversie semnal optic semnal electronic semnal digital
Detectori pentru:
Lumina dispersat: n fa (FSC), lateral (SSC)
Emisia de fluorescen: ~ cantitatea de
fluorocromi informatii calitative i
cantitative
Filtre optice
Elemente optice de focalizare
(lentile si oglinzi dicroice)
Laser(s)
CITOMETRIE IN FLUX
Dichroic mirrors
1
2
3
Cell
Collection
Lenses
Scatter
Low & High
angle
Band Pass
Filters
Photomultiplier
tubes
hoy@cf.ac.uk
CITOMETRIE IN FLUX
Dispersia luminii
Forward Scatter (FS) dimensiunea
Side Scatter (SS) granularitatea
Forward Scatter
LASER
LASER
Side Scatter
CITOMETRIE IN FLUX
CITOMETRIE IN FLUX
ANALIZA DATELOR OBTINUTE
Software-ul permite analiza datelor brute obtinute, atat grafic cat i
numeric
Parametri diferii (variabile pe un grafic) indica lucruri diferite
Lumina imprastiata in unghi mic este captata de fotodetectorul
forward scatter (FSC) - indic dimensiunea celulei, n timp ce
lumina imprastiata in unghi mare este captata de fotodetectorul side
scatter (SSC) indica granularitatea celulei
Ali parametri care se pot observa pe un grafic includ diferiti markeri
fluorescenti folositi pentru a colora celulele
CITOMETRIE IN FLUX
TIPURI DE HISTOGRAME
CITOMETRIE IN FLUX
GRAFIC DOT-PLOT PENTRU FITC I PE
Grafice para etri: pu ct = particul dot-plot)
FITC+ / PE+
PE+
PE: FL2
FITC- /
PE-
FITC: FL1
FITC
+
CITOMETRIE IN FLUX
Control
IL 6
IL-1
ICAM-1
PECAM- 1
P- SELECTIN
VE- Cadherin
CD 146
OdDHL
C4HSL
PQS
HHQ
CITOMETRIE IN FLUX
SORTAREA CELULELOR
Separarea unei (sub)populaii celulare
dintr-un amestec in functie de fluorescenta
Etape:
1.Identificarea criteriului
2.Marcarea cu Ac + fluorocromi
3.Identificarea celulelor
4.Separarea celulelor una cate una
(transducer sonicator) pt ca fiecare celula
sa fie intr-o picatura de lichid
5.ncrcare cu sarcini
pozitive/negative/fr
6.Deflectare spre tuburi colectoare placi
magnetice
7.Centrifugare
CITOMETRIE IN FLUX
CITOMETRIE IN FLUX
APLICATII
Cercetare: microbiologie, biologie celulara, cancer, imunologie, boli
cardiovasculare, inflamatie, nanomedicina
Clinica:
Identificarea unor molecule HLA;
Determinarea unor autoanticorpi asociati plachetelor in
trombocitopatii
Studiul ciclului celular
monitorizarea transplantelor
Analiza subpopulaiilor limfocitare (HIV -> scaderea nr. de limfocite T
CD4)
Diagnosticul, evoluia, prognosticul tumorilor maligne solide si a
hemopatiilor maligne
sIg
CD5
CD10
CD23
CD11c
CD103
CD25
CLL/SLL
Slab
++/+
MCL
-/+
-/+
Folicular
+/-
LPL
MZL
+/- slab
SMZL
+/- slab
+/- slab
Hairy
cell
-/+
++
NHL = limfom non-Hodgkin, CLL = leucemie limfocitara cronica, SLL = limfom cu limfocite mici,
LPL = limfom limfoplasmocitar, MCL = limfom cu celule de manta (folicul limfoid), MZL = limfom
de zona marginala (folicul limfoid), SMZL = limfom de zona marginala splenic
Interfera cu: SDS, pH, buffer, acizi nucleici, zaharuri, medicamente, lipide
saruri
ELECTROFOREZA
ELECTROFOREZA
ELECTROFOREZA
Fortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajul
aplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara si
coeficientul de frictiune
- teoretic: 5 v/cm
ELECTROFOREZA
ELECTROFOREZA
Gelul de electroforeza
ELECTROFOREZA
Gel de poliacrilamida: permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuni
intre 60-450 pb si a proteinelor
- dezavantaje: neurotoxic si cancerigen
Gelurile de agaroza se formeaza prin incalzirea agarozei la cuptorul cu
microunde timp de 3-4 minute. Aceste geluri polimerizeaza formand o
retea cu ochiuri de dimensiuni variabile in functie de concentratia gelului
Gelurile de poliacrilamida polimerizeaza la temperatura camerei in
prezenta unor agenti de polimerizare
Gelurile cu concentratie mica (< 3%) separarea moleculelor cu MM
mare
Gelurile cu concentratie mare (> 3%) separarea moleculelor cu MM
mica
ELECTROFOREZA
-
260
250
260, 250
200
200
+
Gel de agaroza
Gel de poliacrilamida
Gel de agaroza
ELECTROFOREZA
Tamponul de electroforeza
- TAE: Tris, acid acetic, EDTA
- TBE: Tris, acid boric, EDTA
- Acid citric
- Glicina
- Acid fosforic
TRIS = tris(hidroximetil)aminometan
Pentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici :
- colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen,
GelGreen, GelRed sau
- Colorarea tamponului: bromura de etidiu
ELECTROFOREZA
ELECTROFOREZA
Tipuri de electroforeza
In functie de suportul folosit:
1. Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilara
2. Electroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri
In functie de planul de electroforeza:
1. Electroforeza orizontala acizi nucleici
2. Electroforeza verticala - proteine
ELECTROFOREZA
ELECTROFOREZA
DGGE
ELECTROFOREZA
Electroforeza pentru separarea proteinelor
1. PAGE: in gel de poliacrilamida
2. SDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante
- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida
1. IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecare
proteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI
2. 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH
izoelectric si MM)
ELECTROFOREZA
ELECTROFOREZA
ELECTROFOREZA
Electroforeza biochimie clinica
SUBSTRAT
OPD (o-phenylenediamine)
TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidine)
DAB (diaminobenzidina)
ABTS (2,2'-azino-di [3-ethylbenzthiazoline]
sulfonate)
5AS
FOFATA)A ALCALIN PA
pNPP (p-nitrophenylphosphate)
BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro-3-indolylphosphate/nitroblue tetrazolium)
-GALACTOZIDAZA (GAL)
ONPG (o-nitrophenyl-D
galactopyranoside)
MUG (4-methylumbelliferyl galactoside)
UREAZA
Uree bomcresol