Sunteți pe pagina 1din 84

Metode si tehnici de biologie celulara si

moleculara utilizate in cercetarea


biomedicala

Dr. Florin Iordache

Cuprins
Culturi de celule
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a
apoptozei
Citometrie in flux
Analiza ciclului celular
Metode de dozarea a proteinelor
Electroforeza, ELISA, Western blot
Tehnici de imunohistochimie simpla si dubla
Tehnica PCR si Real-Time PCR
Variante si aplicatii ale tehnicii PCR: MS-PCR, SNP-PCR, PCRRFLP
Microarray
Secventiere genica
Transfectie si clonare

CULTURI DE CELULE

Cnd sunt ndeprtate din esuturi, majoritatea celulelor vegetale i animale


pot supravieui, se pot multiplica i chiar pot exprima proprietile lor
difereniate dac li se furnizeaz nutrieni i condiiile adecvate
Proces realizat n laborator Culturi de celule pot fi vizionate la microscop
sau analizate din punct de vedere biochimic, putnd fi explorate i efectele
adugrii sau ndeprtrii unor molecule specifice, ca de exemplu hormoni i
factori de cretere; n culturile mixte pot fi studiate interaciunile dintre un tip
de celule i altul
Experimentele realizate n cultur - in vitro (pe sticl)
Experimentele care se realizeaz pe organisme intacte - in vivo (pe
organisme vii)
Celulele n cultur: - identice dpdv genetic (populaie omogen) cnd deriv
dintr-o singur celul parental- clon
- pot manifesta variaie genetic (populaie heterogen)
Celulele EK - mult mai dificil de cultivat dect majoritatea PK - necesit medii
complexe i sunt foarte susceptibile la contaminarea cu microorganisme
(bacterii, drojdii i fungi)

CULTURI DE CELULE

secolul al XIX-lea - examinarea n detaliu a esuturilor i fragmentelor de


organ n recipiente de sticl:
Sydney Ringer - dezvoltarea de soluii saline (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2)
meninerea btilor unei inimi izolate de la un animal
1907 - Ross Harrison a stabilit metodologiei culturii tisulare: cultivarea unei
piese foarte mici de esut din tubul neural al unui embrion amfibian timpuriu
ntr-o pictur de limf mbogit cu substane nutritive celulele crescute n
aceste condiii, rmn vii i chiar difereniaz la neuroni ai cror axoni cresc n
mediul de cultur
1912 - Alexis Carrel - cultivare de celule n diferite condiii: dac mediul este
adecvat i schimbat cu regularitate - celulele pot crete n cultur pentru o
perioad ndelungat de timp
1940 - laboratoarele lui Wilton Earle i Renato Dulbecco: dezvoltarea
metodelor de cultivare a celulelor - piese de esut au fost disociate n
suspensii de celule izolate, ce pot fi utilizate la iniierea culturilor celulare
1952 NATEREA domeniului culturilor celulare: introducerea tripsinizrii
esuturilor (Moscona)

CULTURI DE CELULE

Endothelial Growth Factor EGF


Vascular Endothelial Growth Factor VEGF
Fibroblast Growth Factor FGF-B
Insulin Growth Factor IGF-1
Hydrocortisone
Fetal Bovine Serum
Ascorbic Acid
Heparin GA-1000
(Gentamicin, Amphotericin-B)

CULTURI DE CELULE

CULTURI DE CELULE

Cultura tisular - termen general pentru ndeprtarea celulelor, esuturilor i


organelor dintr-un organism animal sau plant i plasarea lor ulterioar ntr-un
mediu artificial favorabil creterii: un mediu lichid sau semisolid, care furnizeaz
celulelor substane nutritive eseniale pentru supravieuire i cretere, plasat ntrun recipient de cultur din sticl sau plastic
- se refer n general la creterea celulelor EK in vitro
-cultura de celule mamaliene dar i la culturile de explant i de organ
Cultura de organ - cultura tridimensional a ntregului organ sau fragmentelor
intacte de organ ce rein o parte sau toate caracteristicile histologice manifestate
de ctre esutul respectiv in vivo; piesa este cultivat la interfaa lichid-gaz (pe un
grid sau gel) - favorizeaz meninerea formei sferice sau tridimensionale
reine interaciile celulare existente n esutul de origine tinde s manifeste
proprietile difereniate specifice
celulele nu cresc rapid (proliferarea celular este limitat la periferia explantului i
este mai evident n esuturile embrionare) nu pot fi propagate
necesit explant proaspt implic un effort mai mare i o mai slab
reproductibilitate dect este realizat cu cultura de celule

CULTURI DE CELULE

Cultura de celule ndeprtarea celulelor din fragmentele de organ i


ntreruperea interrelaiilor lor normale cu celulele nvecinate
se refer la celulele obinute prin dezintegrare enzimatic, chimic sau
mecanic (celule ce provin dintr-un esut, cultur primar sau linie celular)
poate fi propagat ca suspensie celular (celulele din snge numai
celulele albe sunt capabile de a crete n cultur) sau monostrat celular
O alternativ la a studia celulele n cultur primar este de a cumpra
culturi celulare stabilizate (linii celulare de calitate superioar, care sunt
testate cu atenie pentru a asigura autenticitatea celulelor ) de la organizaii:
- American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org)
-European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC;www.ecacc.org)
- Coriell Institute for Medical Research (arginine.umdnj.edu).

cercettorii obin (mprumut) linii celulare din alte laboratoare practic


larg rspndit;
neajuns: riscul amestecrii sau contaminrii cu alte linii celulare sau
contaminrii cu microorganisme (micoplasma, bacterii, fungisau drojdii)

CULTURI DE CELULE
Cultura organotipic - celule de diferite tipuri sunt recombinate n rapoarte
determinate experimental i relaii spaiale, pentru a crea un component al
organului de origine
obinerea unui echivalent de piele: Keratinocitele epidermale cresc expuse
la aer pe o matrice de colagen nativ de tip I (extras din tendon de coad de
obolan sau piele de viel) n care sunt nglobate fibroblaste viabile
- reorganizeaz matricea prin producerea de componente ale MEC
- celulele sunt hrnite prin difuzia mediului de cultur de la baza recipientului de
cultur (medii definite sau ce conin ser)

CULTURI DE CELULE
Cultura histotipic (histiotipic sau histocultura) - cultivarea unui singur tip celular la
densitate mare ntr-o matrice tridimensional
Permite studiul interaciilor celul-celul i celul-matricereconstituirea structurilor
celulare tridimensionale n:
agregate celulare n suspensie (celulele disociate sunt cultivate pe un agitator giratoriu ce le
permite s reasocieze n clusteri tridimensionali de 150- 240 m denumii sferoizi mas
heterogen de celule: proliferative, latente i necrotice)
gel de colagen (celule epiteliale mamare structuri tubulare i glandulare mamare, celule
endoteliale structuri vasculare)
Celulele din sferoizi - menin funciile lor difereniate pe o perioad extins de cultur i
ofer caracteristicile din vivo ntr-o manier uor de manipulat in vitro
Aplicaii ale culturilor de sferoizi:
- Teste de toxicitate
- Studii de metabolism
- Screening de medicamente (ofer potenialul de a reduce semnificativ numrul de
animale folosit n screening de medicamente)
Celule capabile de a forma sferoizi: HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells),
HUAEC (Human Umbilical Artery Endothelial Cells), HUSMC, (Human Uterine Smooth
Muscle Cells) HMVEC (Human Microvascular Endothelial Cells), celule din citotrofoblast
uman, BAEC (Bovine Arterial Endothelial Cells), celule din gliom C6 i diferite tipuri
celulare epiteliale

CULTURI DE CELULE

Sferoizii de hepatocite proprieti tipice esutului: au suprafae netede i structur


compact, hepatocitele din interior comunic prin canale delimitate de tight
junctions similare canaliculelor biliare existente n
Formarea sferoizilor depinde de proprieti celulare diverse: molecule de adeziune,
interacii celul-MEC, sarcina de suprafa celular, formarea de complexe
joncionale

CULTURI DE CELULE

CULTURI DE CELULE
cultur de mas se cultiv un numr mare de celule care
colonizeaz baza recipientului i formeaz un strat de celule relativ
uniform
- celulele care supravieuiesc procedurii de izolare se divid - dup
un numr de generaii formeaz un monostrat celular
cultur clonal - numrul de celule cultivate este relativ mic astfel
nct ele se fixeaz de suport la o anumit distan unele de celelalte
- proliferarea celulelor determin formarea de colonii individuale
sau clone celulare, ale cror membri sunt derivai din aceeai celul
iniial
Cele dou tipuri de culturi celulare tind s aib:
- cerine de cretere diferite
- caracteristici diferite
- avantaje diferite n ceea ce privete studiul activitilor celulare

CULTURI DE CELULE

CULTURI DE CELULE
celulele aderente (majoritatea celulelor normale) - dependente de fixarea
de suport i se propag ca un monostrat celular
- proliferarea celular - numai prin aderare de suport
- nceteaz cnd celulele devin confluente inhibiie de contact a
creterii (Abercrombie i Heaysman (1954) fenomen incomplet elucidat)
-contactele celul-celul prin glicoproteine specifice din membrana
plasmatic a cror component glican interacioneaz cu receptori
principalul principiu reglator al creterii celulare
- E-cadherina molecul de adeziune homofilic important n
inhibiia de contact a celulelor epiteliale normale (inhibat sau pierdut n
numeroase carcinoame)
celulele n suspensie - pot supravieui i prolifera fr a fi fixate de
suport (celulele hematopoietice, anumite linii celulare transformate i
celule derivate
din tumorile maligne pot fi crescute n suspensie independente de fixare

CULTURI DE CELULE
1)Tipul epitelial-like:
- celule care sunt fixate de support i apar
aplatizate i poligonale - keratinocite epidermale
umane n cultur primar
2) Tipul limfoblast-like:
- celule care nu se fixeaz de substrat n mod
normal i rmn n suspensie cu o form sferic
neutrofile polimorfonucleare umane
3) Tipul fibroblast-like:
- celule care sunt fixate de support i apar
alungite i bipolare, formnd frecvent vrtejuri n
cultura confluent - fibroblaste dermale n
cultur primar

CULTURI DE CELULE
Culturile primare - multiplicarea celulelor ce migreaz dintr-un
fragment de esut (cultura de explant): fibrinogenul i trombina
favorizeaz aderarea esutului de suport
-prin dezintegrarea esutului prin metode
enzimatice (tripsina, hialuronidaza, colagenaza), chimice (EDTA)
sau mecanice
Cultura de explant: piese mici de esut fixate de recipientul de
cultur i plasate n mediul de cultur celulele individuale se vor
deplasa din esutul explantat pe suprafaa suportului de cultur, de
unde vor ncepe s se divid i s creasc

CULTURI DE CELULE
Culturile celulare finite (secundare):
formate dup prima subcultivare (pasaj)
a culturii primare numr limitat de
diviziuni senescen fibroblastele
umane
normale
50-100
dublri
populaionale senescen
Extinderea
potenialului
proliferativ
introducerea
unor
gene
virale
transformante (gena T-large antigen din
virusul simian SV40)
Linii celulare continue: potenial
proliferativ nelimitat att timp ct sunt
meninute condiiile de cultivare =
imortalizate - se coreleaz frecvent cu
tumorigenicitatea celulele

CULTURI DE CELULE

Avantajele liniilor celulare


- imortalitatea celular
- mai uor de manipulat dect culturile celulare primare sau finite
- modele experimentale extrem de puternice cea mai mare parte din
- observaiile dobndite folosind liniile celulare poate fi aplicat tipului celular iniial
Dezavantajele liniilor celulare
- nu sunt normale - sufer modificri genetice (aberaii cromozomiale: poliploidie,
translocaii cromozomiale, etc) comportarea lor in vitro nu poate reprezenta situaia in
vivo
- morfologie modificat prin comparaie cu tipul celular iniial
- pierd caracteristica de inhibiie de contact (ele pot crete suprapuse formnd focare)
Exemplul clasic de linie celular imortal
HeLa - celule epiteliale umane dintr-un carcinom cervical transformat de HPV 18
(Henrietta Lacks, n 1951) - celule aderente George i Margaret Gey (Johns Hopkins
Hospital -Baltimore)
- nu manifest inhibiia de contact - trstur clasic a celulelor tumorale
- nu sunt tumorigene n animale; transformare cu un virus oncogen devin tumorigene

CULTURI DE CELULE

Henrietta Lacks
1920-1951

CULTURI DE CELULE
MEDIILE COMPLETE

Aminoacizi
Vitamine
Sruri
Glucoz
Suplimente organice
Hormoni i factori de cretere
Antibiotice
Ser

CULTURI DE CELULE

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei
MTT (MTS) assay
- proliferare celularasi citotoxicitate
- reducerea unei saruri de tetrazoliu galbene MTT (bromura de 3
(4,5dimetiltiazoliu)-2,5-difeniltetrazoliu) la formazan de culoare albastruinchis 570 (nm)
- formazanul insolubil in apa poate fi solubilizat cu izopropanol, DMSO sau
alt solvent organic

CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega)


Cell Viability and Proliferation ( Sigma-Aldrich)
Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Life Technologies)

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei
LHD assay
- studii de citotoxicitate

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei

GSH assay
- evaluarea stresului oxidativ

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei
Marcarea celulelor cu Acridine Orange/Bromura de etidiu
Caracteristicile morfologice in urma colorarii:
- caracteristicile nucleare normale: cromatinei verde stralucitor cu
structura organizata
-celulele apoptotice au nucleul condensat si / sau fragmentat,
membrana veziculare, si condensare citosolica
- in stadiul incipient de apoptoza, celulele sunt impermeabile la
bromura de etidiu si nucleul este colorat in verde
- In timpul etapele ulterioare ale apoptozei, celulele au nucleul
condensat si / sau fragmentat care se coloreaza in rosu/portocaliu
- Celulele necrotice prezentat o coloratie rosie nucleara, dar cromatina
nu este condensata.

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei
Marcarea celulelor cu Acridine Orange/Bromura de etidiu

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei

Marcarea celulelor cu substante fluorescente vitale


-

in prezent sunt utilizati o gama larga de compusi care patrund in celula


si devin fluorescenti: rodamina, calceina, coumarina, fluoresceina.
In ultimii ani s-au dezvoltat fluorocromi care permit urmarire pe termen
mai lung a viabilitatii celulelor (6-10 generatii), timp de 1- 2 saptamani
in cultura.

CMTPX

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei

Anexina V-FITC
- Se leaga de fosfatidilserina expusa
la exteriorul membranei celulare lezate

Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului


oxidativ si a apoptozei

Bromdeoxiuridina, Iodura de propidiu, Hoechst


- proliferarea si viabilitatea celulara prin analiza ciclului
celular
- metoda folosita citometrie in flux

CITOMETRIE IN FLUX
Flux=miscare, citos=celula, metrie=masurare
Analizeaza celule aflate n suspensie din: snge, lichid sinovial,
ganglioni limfatici, tumori solide
Este o metod de surare a caracteristicilor fizice i/sau
biochimice ale particulelor (celule, nuclei, organite celulare):
Mri ea
Granularitatea
Cantitatea de ADN
A tige e de suprafa
Metod de sortare a celulelor

CITOMETRIE IN FLUX

CITOMETRIE IN FLUX
CE MASOARA CITOMETRIA DE FLUX LA NIVELUL CELULELOR?
Dimensiunea celulelor

Forma (Granularitatea) celulelor

Proteinele de suprafata ale celulelor, clusteri de diferentiere (CD)

Proteinele citoplasmatice - prin permeabilizarea membranei


celulare

Densitatea celulelor

CITOMETRIE IN FLUX
ETAPE
1.

Prepararea suspensiei de celule

2.

Marcarea celulelor

3.

Achiziia datelor

4.

Stocarea datelor

5.

Interpretarea datelor

CITOMETRIE IN FLUX
Antigen

HGPRT- = Hipoxantin-guanozin-ribozil-transferaza
HAT = hipoxantin-aminopterina-timidina

Fuzionarea
celulelor
HIBRIDOM

HGPRT-

Mielom
HGPRT-

Plasmocite
producatoare de Ac

HGPRT+

Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor

Hibridoamele se separa si
se cultiva

Clonele dorite
se cultiva sau
se
congeleaza

Mentinerea
hibridoamelor in
soareci
Anticorpii monoclonali sunt
purificati

CITOMETRIE IN FLUX
Ac. monoclonali
- Toate moleculele de Ac sunt identice dpdv imunochimic si
recunosc acelasi epitop de pe un antigen
- Specificitate f. mare
- Fara variatii de la un lot la altul
Ac. policlonali
-fiecare molecula de Ac va recunoaste epitopi diferiti de pe Ag
- Poate satura u a tige , emitand un semnal mai mare
- Este mai putin specific
- Poate avea variatii mari de la un lot la altul
Ac. izotip
Legare nespecifica - alte regiuni ale Ac se pot lega la epitopii Ag.
- Pentru a cuantifica acest efect se foloseste Ac. izotip: Ac ale
carui regiuni variabile sunt nespecifice. Prin urmare, orice legare
va fi datorata interactiei nespecifice a regiunii constante cu Ag

CITOMETRIE IN FLUX

CITOMETRIE IN FLUX

CITOMETRIE IN FLUX

CITOMETRIE IN FLUX

COMPONENTELE CITOMETRULUI IN FLUX

Sistem fluidic
Sistem optic
Sistem electronic

CITOMETRIE IN FLUX
SISTEMUL FLUIDIC - celulele sunt analizate individual pentru a realiza
acest lucru, celulele sunt invelite intr-un flux de lichid acest proces este
numit focusare hidrodinamica"
Camer de
curgere

Ac de injecie

Lichid de
nveli
Flux
Laminar
(sir indian)

CITOMETRIE IN FLUX
SISTEMUL OPTIC DE EXCITAIE Intersectarea cu un fascicul de
lumina surse laser:
Argon
UV 350/364 nm
Visible 458 465 472 488 496 502 515
nm
Krypton
UV 350/356 nm
Visible 468 476 482 520 530 568 647
676 nm
Helium/Neon 633 nm

Fascicul luminos dispersia luminii i stimularea fluorocromilor


(emisia de fluorescenta)

CITOMETRIE IN FLUX

SISTEMUL OPTIC
Conversie semnal optic semnal electronic semnal digital
Detectori pentru:
Lumina dispersat: n fa (FSC), lateral (SSC)
Emisia de fluorescen: ~ cantitatea de
fluorocromi informatii calitative i
cantitative
Filtre optice
Elemente optice de focalizare
(lentile si oglinzi dicroice)

Laser(s)

CITOMETRIE IN FLUX
Dichroic mirrors
1
2
3

Cell

Collection
Lenses

Scatter
Low & High
angle

Band Pass
Filters
Photomultiplier
tubes

hoy@cf.ac.uk

CITOMETRIE IN FLUX
Dispersia luminii
Forward Scatter (FS) dimensiunea
Side Scatter (SS) granularitatea

Forward Scatter
LASER

LASER

Side Scatter

CITOMETRIE IN FLUX

Sistemul electronic preia datele colectate si le


transmite computer-ului

CITOMETRIE IN FLUX
ANALIZA DATELOR OBTINUTE
Software-ul permite analiza datelor brute obtinute, atat grafic cat i
numeric
Parametri diferii (variabile pe un grafic) indica lucruri diferite
Lumina imprastiata in unghi mic este captata de fotodetectorul
forward scatter (FSC) - indic dimensiunea celulei, n timp ce
lumina imprastiata in unghi mare este captata de fotodetectorul side
scatter (SSC) indica granularitatea celulei
Ali parametri care se pot observa pe un grafic includ diferiti markeri
fluorescenti folositi pentru a colora celulele

CITOMETRIE IN FLUX

TIPURI DE HISTOGRAME

CITOMETRIE IN FLUX
GRAFIC DOT-PLOT PENTRU FITC I PE
Grafice para etri: pu ct = particul dot-plot)
FITC+ / PE+

PE+

PE: FL2

FITC- /
PE-

FITC: FL1

FITC
+

CITOMETRIE IN FLUX
Control

IL 6

IL-1

ICAM-1

PECAM- 1

P- SELECTIN

VE- Cadherin

CD 146

OdDHL

C4HSL

PQS

HHQ

CITOMETRIE IN FLUX
SORTAREA CELULELOR
Separarea unei (sub)populaii celulare
dintr-un amestec in functie de fluorescenta
Etape:
1.Identificarea criteriului
2.Marcarea cu Ac + fluorocromi
3.Identificarea celulelor
4.Separarea celulelor una cate una
(transducer sonicator) pt ca fiecare celula
sa fie intr-o picatura de lichid
5.ncrcare cu sarcini
pozitive/negative/fr
6.Deflectare spre tuburi colectoare placi
magnetice
7.Centrifugare

CITOMETRIE IN FLUX

Analiza ciclului celular

CITOMETRIE IN FLUX
APLICATII
Cercetare: microbiologie, biologie celulara, cancer, imunologie, boli
cardiovasculare, inflamatie, nanomedicina
Clinica:
Identificarea unor molecule HLA;
Determinarea unor autoanticorpi asociati plachetelor in
trombocitopatii
Studiul ciclului celular
monitorizarea transplantelor
Analiza subpopulaiilor limfocitare (HIV -> scaderea nr. de limfocite T
CD4)
Diagnosticul, evoluia, prognosticul tumorilor maligne solide si a
hemopatiilor maligne

Expresia aberanta a unor antigene pe suprafata celulelor


- Imunofenotiparea prin citometrie in flux este in mod particular utila pentru subtiparea
limfoamelor/leucemiilor cu celula B compuse predominant din celule mici
- Expresia CD5 la nivelul celulelor B este in general raportata ca un fenotip aberant, desi
exista populatii mici de celule B normale mature CD5+, aflate de obicei in sangele periferic.
Astfel expresia CD5 trebuie interpretata in corelatie cu alte anomalii, incluzand restrictia
lantului usor de Ig (sIg) sau alterarea intensitatii prezentei CD20, CD22 si CD79b.
- Expresia bcl-2 pe celulele B CD10+ . In conditii normale, bcl-2 este absent.
Antigenele de suprafata in limfoamele/leucemiile cu celula B mica
NHL

sIg

CD5

CD10

CD23

CD11c

CD103

CD25

CLL/SLL

Slab

++/+

MCL

-/+

-/+

Folicular

+/-

LPL

MZL

+/- slab

SMZL

+/- slab

+/- slab

Hairy
cell

-/+

++

NHL = limfom non-Hodgkin, CLL = leucemie limfocitara cronica, SLL = limfom cu limfocite mici,
LPL = limfom limfoplasmocitar, MCL = limfom cu celule de manta (folicul limfoid), MZL = limfom
de zona marginala (folicul limfoid), SMZL = limfom de zona marginala splenic

METODE DE DOZARE A PROTEINELOR


1.Determinarea concentratiei proteice prin spectrofotometrie
Absorbtia radiatiilor in UV de catre proteine depinde de continutul acestora in
tirozina si triptofan (si intr-o masura mai mica de Phe si legaturile
disulfurice). Astfel absorbanta la 280 nm variaza in functie de proteine,
pentru 1 mg/ml solutie proteica de la 0 la 4.
Avantajul acestei metode consta in simplitate si sensibilitate. Proba este total
recuperabila, variatia intre proteine este mica ceea ce permite determinari
absolute ale proteinelor
Dezavantajul consta in faptul ca aparatul trebuie bine calibrat. Multe bufere
si alti compusi interfera cu citirea: acetat, succinat, citrat, ftalat, barbiturat
gruparile hem, gruparile piridoxal

METODE DE DOZARE A PROTEINELOR


2. Dozarea proteinelor prin metoda Lowry
Aceasta metoda se bazeaza pe :
- reactia biuretului in care legaturile peptidice ale proteinelor
reactioneaza cu Cu2+ in conditii alcaline pentru a reduce Cu+ care
reactioneaza cu reactivul Folin-Ciocalteau
- reactia Folin-Ciocalteau, al carui principiu consta in reducerea
fosfomolibdatului de tungsten prin oxidarea aminoacizilor aromatici (in
special tirozina si triptofan) cu ajutorul Cu.

Interfera cu: SDS, pH, buffer, acizi nucleici, zaharuri, medicamente, lipide
saruri

METODE DE DOZARE A PROTEINELOR


3. Dozarea proteinelor prin metoda BCA (acid bicinchoninic)
Legarurile peptidice, cisteinele, triptofanul, tirozinele din lanturile laterale
ale proteinelor reduc Cu2+ din sulfatul de cupru la Cu+ (reactie dependenta
de temperatura), cantitatea de Cu+ redus fiind proportionala cu cantitatea
de proteina din reactie.
Apoi 2 molecule de BCA chelateaza fiecare ion de Cu+ formand un complex
colorat in mov care absoarbe puternic la o lungime de unda de 562 nm.

METODE DE DOZARE A PROTEINELOR


4. Dozarea proteinelor prin metoda Bradford
Aceasta metoda este mai simpla, mai rapida si mai sensibila decat Lowry.
Metoda consta in capacitatea de legare a colorantului Commassie Blue la proteine
(in special de aminoacizii aromatici). Studiile au aratat ca colorantul liber poate
exista in 3 forme ionice. Dintre cele 3 forme incarcate ale colorantului care
predomina in solutia de reactiv formele rosu si verde au absorbanta la 470 nm si
650 nm. Forma rosie a colorantului doneaza electronii liberi la gruparile ionizabile
ale proteinelor care modifica starea native a proteinelor, expunandu-si astfel
gruparile hidrofobice. De aceste grupari se leaga prin interactii de tip van der Waals
colorantul. Aceste legaturi sunt stabilizate si cu ajutorul intercatiilor ionice. Forma
anionica albastra care se leaga la proteine are un maxim de absorbanta la 590 nm,
astfel cuantificarea proteinelor poate fi estimata prin determinare colorantului
albastru prin masurarea absorbantei la 590-595 nm (570-610 nm). Colorantul se
pare ca se leaga de resturile de arginina, lizina si histidina ale proteinelor.
Aceasta metoda interfera cu detergenti, amfoliti, pH foarte alcalin, cantitati mari de
Tx100, SDS.

ELECTROFOREZA

1937 Arne Tiselius- aparat sofisticat care sa permita separarea


diferitelor particule in prezenta unui camp electric
1948 Tiselius- Premiul Nobel pentru Chimie (separarea
coloizilor prin metode electroforetice)

1960 Vin Thorne - electroforeza acizilor nucleici

ELECTROFOREZA

Denumirea: gr. Electron= electric, lat. Phore = purttor,


evideniindu-se astfel rolul esential al campului electric

reprezint o metod de analiz i separare bazat pe


migrarea particulelor solide incarcate electric dispersate
ntr-un lichid sub aciunea unui cmp electric
Moleculele de ADN sunt incarcate negativ si vor migra spre
polul pozitiv

ELECTROFOREZA
Fortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajul
aplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara si
coeficientul de frictiune
- teoretic: 5 v/cm

ELECTROFOREZA

Cuva (tanc) de electroforeza


2 electrozi conectati la o sursa de curent
Gel de electroforeza (pentru o migrarea mai buna a moleculelor)
un lichid (tampon de electroforeza)

ELECTROFOREZA

Gelul de electroforeza

- Gel de agaroza (polizaharid, D-galactoza and 3,6-anhidro-Lgalactopiranoza, extras din alge)


- Gelurile de agaroza au o concentratie de 1-5%, in functie de
dimensiunea fragmentelor ce trebuie separate
- Gelurile de agaroza permit separarea acizilor nucleici cu
dimensiuni intre 100-1500 pb

ELECTROFOREZA
Gel de poliacrilamida: permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuni
intre 60-450 pb si a proteinelor
- dezavantaje: neurotoxic si cancerigen
Gelurile de agaroza se formeaza prin incalzirea agarozei la cuptorul cu
microunde timp de 3-4 minute. Aceste geluri polimerizeaza formand o
retea cu ochiuri de dimensiuni variabile in functie de concentratia gelului
Gelurile de poliacrilamida polimerizeaza la temperatura camerei in
prezenta unor agenti de polimerizare
Gelurile cu concentratie mica (< 3%) separarea moleculelor cu MM
mare
Gelurile cu concentratie mare (> 3%) separarea moleculelor cu MM
mica

ELECTROFOREZA
-

260
250

260, 250

200

200

+
Gel de agaroza

Gel de poliacrilamida

Gel de agaroza

ELECTROFOREZA
Tamponul de electroforeza
- TAE: Tris, acid acetic, EDTA
- TBE: Tris, acid boric, EDTA
- Acid citric
- Glicina
- Acid fosforic
TRIS = tris(hidroximetil)aminometan
Pentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici :
- colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen,
GelGreen, GelRed sau
- Colorarea tamponului: bromura de etidiu

ELECTROFOREZA

ELECTROFOREZA
Tipuri de electroforeza
In functie de suportul folosit:
1. Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilara
2. Electroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri
In functie de planul de electroforeza:
1. Electroforeza orizontala acizi nucleici
2. Electroforeza verticala - proteine

ELECTROFOREZA

Electroforeza pentru acizi nucleici


1. In gel de agaroza
2. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient denaturant
3. TGGE: (temperature gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient de temperatura
- Ambele metode sunt folosite in domeniul biomedical (mutatii) si ecologie
microbiana
4. PFGE (pulse field gel electophoresis): electroforeza in camp pulsatoriu
- Gel de agaroza, dar voltajul este schimbat in 3 directii (1 catre centru
gelului, 2 care actioneaza intr-un unghi de 60o)
- Pentru genotipare, epidemiologie moleculara

ELECTROFOREZA
DGGE

ELECTROFOREZA
Electroforeza pentru separarea proteinelor
1. PAGE: in gel de poliacrilamida
2. SDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante
- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida
1. IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecare
proteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI
2. 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH
izoelectric si MM)

ELECTROFOREZA

ELECTROFOREZA

ELECTROFOREZA
Electroforeza biochimie clinica

Electroforeaza proteinelor serice: albumina, 1 globuline,


2 globuline, 1 globuline, 2 globuline, globuline
- malnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii,
hepatita, boli autoimune
Electroforeza hemoglobinei anemie
Electroforeza lipoproteinelor boli cardiovasculare

METODE IMUNOLOGICE- ELISA

Pentru evidenierea complexelor Ag-Ac se folosesc moleculele


indicator pentru marcarea unuia dintre reactani, de obicei a
anticorpilor. Cele mai folosite teste sunt acelea care folosesc un
anticorp secundar marcat, pentru a evidenia legarea anticorpului
primar de antigen.
Anticorpul secundar poate fi marcat cu:
- radioizotopi
- fluorocromi
- substane chemiluminiscente
- enzime
Toate testele cu molecule marcate se pot realiza n dou variante:
- competitive i
- necompetitive

METODE IMUNOLOGICE- ELISA


ENZIMA

SUBSTRAT

PEROXIDAZA DE HREAN (HRP)

OPD (o-phenylenediamine)
TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidine)
DAB (diaminobenzidina)
ABTS (2,2'-azino-di [3-ethylbenzthiazoline]
sulfonate)
5AS

FOFATA)A ALCALIN PA

pNPP (p-nitrophenylphosphate)
BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro-3-indolylphosphate/nitroblue tetrazolium)

-GALACTOZIDAZA (GAL)

ONPG (o-nitrophenyl-D
galactopyranoside)
MUG (4-methylumbelliferyl galactoside)

UREAZA

Uree bomcresol

METODE IMUNOLOGICE- ELISA


n testele competitive, toi reactivii se adaug simultan n reacie,
iar Ag marcat intr n competiie cu Ag nemarcat al eantionului,
pentru un numr limitat de situsuri de legare ale anticorpilor.
Cantitatea de marker legat este invers proporional cu
concentraia Ag din eantion: cu ct este detectat mai mult marker,
cu att concentraia Ag n eantion este mai mic.

METODE IMUNOLOGICE- ELISA


n testele necompetitive, antigenul din eantion se combin cu
anticorpii n exces fixai de faza solid. Anticorpul absorbit pasiv pe
o faz solid este anticorp de captare. Antigenul necunoscut din
eantionul analizat reacioneaz cu anticorpul de captare. Dup
splare pentru ndeprtarea Ag nelegat, n reacie se adaug al
doilea Ac marcat. n acest caz, cantitatea de marker este direct
proporional cu cantitatea de Ag din proba analizat.

METODE IMUNOLOGICE- ELISA

METODE IMUNOLOGICE- ELISA

VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE !