IMUNOHISTOCHIMIE

Imunohistochimia (IHC) sau imunocitochimia a

apărut ca o tehnică microscopică de identificare a
constituenţilor celulari sau tisulari prin folosirea
interacţiunii antigen-anticorp.

Unii autori folosesc termenul de imunohistochimie

când utilizează aceste tehnici în studiul histologic al
ţesuturilor şi de imunocitochimie când utilizează tehnicile
pentru preparatele citologice (pentru studiul frotiurilor sau
amprentelor). Cei mai multi autori folosesc termenul de
imunohistochimie pentru ambele tipuri de studii.
 Dezvoltată în ultimii 60 de ani, imunohistochimia a devenit o
metodă calitativă foarte valoroasă pentru studii de citologie,
embriologie, histologie, medicină legală şi mai ales pentru anatomie
patologică. Imunohistochimia este la ora actuală o metodă de
diagnostic larg utilizată de majoritatea laboratoarelor de cercetare şi de
diagnostic, fiind deseori preferată microscopiei electronice, datorită
eficacităţii, rapidităţii, preciziei şi costurilor nu prea ridicate.
Tehnicile actuale de IHC au apărut datorită efortului susţinut a
mai multor cercetători şi laboratoare care au dorit să aprofundeze
studiile de microscopie, biologie celulară şi biologie moleculară.
Pentru a putea vizualiza o anumită structură biochimică (un antigen)
într-un ţesut sau într-o celulă este necesar să se utilizeze “anticorpi
marcaţi”, adică anticorpi care să poată fi vizualizaţi la microscop.
 Primele tehnici de imunohistochimie au utilizat anticorpi
marcaţi cu fluorocromi (izotiocianatul de fluoresceină şi rodamina).
Cel mai mare dezavantaj al acestei tehnici a fost necesitatea folosirii
unui microscop cu fluorescenţă, aparat greu de procurat şi utilizat. În
plus, tehnica de imunofluorescenţă nu permitea evidenţierea unor
detalii morfologice ale celulelor marcate cu fluorocromi.
Aceste inconveniente au fost eliminate prin marcarea
enzimatică a anticorpilor (ex. marcarea enzimatică a anticorpilor cu
peroxidază din hrean) ataşată de un amestec cromogen adecvat cum
ar fi diaminobenzidina (DAB)- metodă propusă de Nakane & Pierce
în 1966. Această metodă a permis atât vizualizarea morfologiei
celulelor cât şi demonstrarea antigenului prin cuplarea acestuia cu
anticorpul specific marcat cu peroxidază şi cromogen.
 Din 1966 au fost imaginate mai multe tehnici enzimatice. În
1970 Sternberger a descris tehnica cu peroxidază-
antiperoxidază (PAP). Engvall şi Perlman în 1971 au folosit
marcarea cu fosfatază alcalină, iar Geggeness şi Ash (1977) au
propus folosirea pentru imunofluorescenţă a complexului
avidină-biotină. Cordell şi colab. (1984) a descris sistemul
fosfatază alcalină - anti-fosfatază alcalină (APAAP) folosind
un produs de reacţie roşu. Această metodă a câştigat teren acolo
unde blocarea peroxidazei endogene sau prezenţa pigmentului
maro au făcut dificilă interpretarea histopatologică.
 Prezenta unor antigene în cantitate foarte mică, chiar şi prin
folosirea unei tehnici optimizate, face imposibilă demonstrarea existenţei
acestora. De aceea au fost imaginate diverse tehnici de amplificare a
reacţiei de demascare a antigenelor. Adăugarea imidazolului (Straus
1982) sau a metalelor grele (Hsu & Soban 1982) la substrat a adus în
multe cazuri beneficii.
În1989, Borow a raportat o creştere a sensibilităţii reacțiilor Atg-
Ac prin adăugarea tiraminei (amină rezultată din decarboxilarea
tirozinei) cu peroxidază din hrean. Reacţia se bazează pe depunerea
tiraminei biotinilate (reacţie catalizată de peroxidază) pe situsurile de
imunoreactivitate. Aceasta permite legarea biotinei în cantitate mai mare
de situsurile complexelor antigen-anticorp şi automat mai multă avidin-
peroxidază poate fi ataşată la locurile de desfăşurare a reacţiilor
imunologice. Când substratul cu soluţie DAB este aplicat, este atinsă o
sensibilitate mai mare. Totuşi, toate metodele ce folosesc sistemul
avidină-biotină au dezavantajul existenţei biotinei endogene, în special în
ţesutul hepatic şi cel renal.
 O altă metodă de amplificare, descrisă de Mangham &
Isaacson (1999), consta in folosirea anticorpilor complementari
imagine in oglindă (MICA). Aceasta este de fapt o metodă in cinci
timpi care conferă o sensibilitate asemănătoare aceleia oferite de
tiramină, dar evită dezavantajul falsei marcări datorate biotinei
endogene.

Sistemele de marcare s-au dezvoltat în paralel cu producerea de

anticorpi. În 1975 Kohler & Milstein au descris o metodă
revoluţionară pentru producerea anticorpilor monoclonali. Tehnicile
moleculare moderne au permis sintetizarea unor peptide împotriva
cărora se pot produce atât anticorpi monoclonali cât şi policlonali
(Lagunowich 1990).
 Cu toate progresele făcute în domeniul sistemelor de marcare
şi al anticorpilor, folosirea acestora în cadrul histopatologiei a fost
limitată de tehnicile de fixare în formol şi includere la parafină. La
începuturile imunohistochimiei s-a crezut ca aceste tehnici de
procesare distrug anumiţi epitopi.

Huang în 1976 a descris folosirea tripsinei asupra secţiunilor la

parafină ca un mijloc de evidenţiere a unor antigene care erau mascate
de fixarea în formol şi includerea la parafină.
 Cel mai mare progres în acest sens s-a făcut în 1991 când Shi a
descris pretratamentul cu căldură al preparatelor histologice.
Acesta a implicat la început folosirea microundelor pentru încălzirea
secţiunilor incluse la parafină într-o soluţie de metal greu ca un mijloc
de recuperare (demascare) a antigenelor din ţesuturile procesate prin
fixare în formol.
În 1994 Norton a constatat că oala de gătit sub presiune
confecţionată din inox este mai eficientă decât cuptorul cu microunde
pentru recuperarea unor antigene, fapt confirmat şi de Miller în 1995.
De asemenea, în 1994, Bankfalvi a descris o metodă de recuperare a
antigenelor folosind autoclavul. Au fost propuse şi multe alte metode
pentru pre-tratarea cu căldură cum ar fi încălzirea peste noapte la
temperaturi între 70°C şi 80°C în citrat (Man & Tavossoli 1996), sau în
Tris-EDTA sau acid boric la 60°C (Bidolph & Jones 1998).
 Au fost propuse, de asemenea, alte noi metode. Folosirea
ultrasunetelor ca o metodă de demascare a antigenelor înaintea
includerii a fost descrisă de Gimeno (1998).

Totuşi, folosirea crescută a recuperării antigenelor pentru

imunocitochimie a condus la numeroase modificări aduse metodei, în
special la nivelul soluţiilor de recuperare şi al aparaturii de încălzire.
Toate aceste studii au concluzionat ca există numeroşi factori care
influenţează calitatea recuperării, cum ar fi pH-ul, timpul de expunere
şi temperatura de încălzire.
 Anumite antigene, de exemplu antigenul de proliferare Ki-67
şi antigenele celulelor T-CD5 şi CD8- pot fi evidenţiate numai prin
fixare în formol, includere la parafină şi pre-tratare cu căldură şi
evidentierea numai cu anumiţi anticorpi monoclonali. Anticorpii, cum
ar fi aceia direcţionaţi împotriva antigenului comun leucocitar (CLA)
(clonele PD7/2B11) şi antigenului CD20 (clona L26) produc o
colorare puternică după tamponare cu citrat, încălzire şi,
surprinzător, pre-tratarea cu căldură permite creşterea considerabilă a
factorilor de diluţie. Demonstrarea antigenelor cum ar fi ciclina D1
(clona DCS-6) se realizează preferenţial în soluţii cu pH mai înalt
(Tris-EDTA, pH =10).
Diferitele metode de recuperare pot genera confuzii, în special
datorită faptului că nu există tehnici standardizate.
 Imunohistochimia (IHC) sau imunocitochimia este o tehnică
histologică de identificare a constituenţilor celulari sau tisulari prin
folosirea interacţiunii antigen-anticorp.
Antigenul este moleculă străină care, pătrunsă în organism,
determină apariţia anticorpilor; (gr. anti = împotriva, gennan = a naşte).
Antigenele cele mai cunoscute sunt proteinele cu masă moleculară relativ
mare (peste 10 000 daltoni), dar pot funcţiona ca antigene şi molecule
polipeptidice de mici dimensiuni cu g.m. mai mică de 1000 daltoni,
moleculele polizaharidice, lipidice, lipoproteice, acizii nucleici, proteine
nucleare, etc.
Pentru a avea proprietăţi antigenice molecula respectivă trebuie
să aibă o anumită mărime, o anumită structură care să-i permită
menţinerea unei configuraţii spaţiale tridimesionale necesară pentru
recunoaşterea antigenică. În plus, antigenele trebuie să aibă capacitate
imunogenă (capacitatea de a induce formarea de anticorpi) şi de
reactivitate specifică (capacitatea de a forma complexe imune cu
anticorpul a cărei formare a indus-o). Pentru a obţine anticorpi cu o
specificitate cât mai bună, trebuie ca antigenul obţinut sa fie cât mai pur.
Obţinerea unor antigene de bună calitate este o muncă extrem de
laborioasă, care necesită multiple tehnici biologice şi biochimice de
extracţie şi purificare.
 Trebuie notat că nu toată molecula antigenică se leagă de
anticorpul specific ci numai anumite regiuni topografice, formate
dintr-un număr mai mare sau mai mic de aminoacizi sau unităţi
monozaharidice, regiuni cunoscute sub numele de epitopi sau
determinanţi antigenici.
Există două categorii de epitopi proteici:
- secvenţiali;
- conformaţionali.
Epitopii secvenţiali sunt formaţi dintr-o secvenţă de aminoacizi
prezenţi pe un lanţ polipeptidic; epitopii conformaţionali sunt formaţi
din secvenţe de aminoacizi (de mărimi varibile) situate la distanţă
unele de altele, pe acelaşi lanţ polipeptidic sau pe lanţuri diferite, dar
care, datorită structurii secundare şi terţiare a proteinelor (pliate,
contorsionate), sunt aduse unele lângă altele.
Nu toţi epitopii determină un răspuns imun de aceeaşi
intensitate. În structura unui antigen pot să existe epitopi
imunodominanţi care determină răspunsuri imune mai puternice şi
epitopi care determină răspunsuri imune slabe.
 Anticorpii. Sunt glicoproteine plasmatice aparţinând
imunoglobulinelor, capabile să recunoască specific un anumit antigen. Ei sunt
sintetizaţi în sistemul imunitar de către plasmocite, celulele finale ale
transformării limfocitului B după recunoaşterea unui antigen, dar în cantităţi
mici şi de limfocitele B. Există cinci tipuri de anticorpi (imunoglobuline) în
sânge: IgA, IgD, IgE, IgG şi IgM.
Producerea de anticorpi. La un prim contact al organismului cu un
antigen, limfocitul B se transformă în imunoblast sau limfocit activat.
Această transformare constă în creşterea volumului celular, diametrul celulei
depăşind 10 µm, sporirea citoplasmei prin creşterea cantităţii de hialoplasmă
şi de organite, accentuarea bazofiliei prin creşterea cantităţii de ribozomi şi
reticul endoplasmic rugos, creşterea nucleului şi a cantităţii de eucromatină şi
apariţia a 2-4 nucleoli. Aceste limfocite activate se divid de mai multe ori prin
mitoze, dând naştere la clone celulare, din care unele celule se vor diferenţia
în plasmocite (celule secretoare de imunoglobuline), iar altele vor forma
limfocitele cu memorie (celule capabile la un nou contact cu acelaşi antigen
să-l recunoască mai uşor şi să declanşeze un răspun imun secundar mult mai
rapid).
Plasmocitele sintetizează anticorpii sau imunoglobulinele specifice
care vor fi exocitate în mediul intern, realizând forma de imunitate umorală
sau imediată.
 - IgG formează circa 75% din totalul
imunoglobulinelor serice. Molecula de IgG este formată din
două lanturi similare de aminoacizi, unite prin legături
bisulfidice. Fiecare subunitate conţine două lanţuri
polipeptidice: unul lung, lanţul greu (H) şi unul scurt, lanţul
uşor (L). Lanţul H se uneşte de lanţul L printr-o legătură
bisulfidică. În ansamblu, molecula de IgG prezintă două zone
funcţionale notate Fc, zona care se leagă cu un receptor
specific prezent pe suprafaţa unor celule (limfocite,
macrofage, mastocite) şi respectiv, Fab care se leagă de
antigen. Moleculele de IgG au greutate moleculară de circa
150.000 daltoni.
 - IgM reprezintă aproximativ 10% din imunoglobulinele serice.
Sunt imunoglobulinele dominante în răspunsul imun primar. Ele apar sub
forma unui pentamer (cu greutatea moleculară de 900 000 daltoni). Sunt
prezente în cantitate mare pe suprafaţa limfocitului B.

- IgA se găsesc în cantitate mică în plasma sanguină, dar se

găsesc în cantitate mare în secreţia lacrimală, colostru, salivă, secreţia
nazală, bronşică, intestinală, uterină sau prostatică sub formă de IgA
secretori (la monomerul IgA produs de limfocite şi plasmocite se adaugă
un lanţ polipeptidic numit proteina J, sintetizat de celulele mucoaselor,
care-i sporeşte acţiunea şi îi facilitează transportul prin epiteliile de
acoperire).
 - IgE se prezintă sub forma unui monomer cu greutatea
moleculară de 180 000 daltoni. În sânge se găsesc în cantitate foarte
mică, de 3-5 µg/100 ml. Aceste imunoglobuline au o afinitate crescută
pentru receptorii membranari ai mastocitelor şi polimorfonucleare
bazofile.

- IgD sunt mai puţin cunoscute din punct de vedere al efectelor

biologice. Se prezintă sub forma unui monomer cu greutatea moleculară
de 180 000 daltoni. Ca şi IgE se găsesc în cantitate foarte mică în sânge
(0,2% din totalul imunoglobulinelor). În cantităţi mai mari se găsesc pe
suprafaţa limfocitelor B.
 IgG sunt cel mai frecvent folosite în imunohistochimie.
Specificitatea pentru antigene a IgG se află în partea distală (variabilă)
a lanţurilor H şi L, formând cele două braţe ale Y-ului. Fiecare braţ
este capabil de combinare cu un determinant antigenic şi de aceea se
numeşte “fragment de anticorp” sau Fab. Regiunile terminale ale
fiecărui braţ prezintă variaţii ale secvenţelor de amino-acizi şi sunt
cunoscute sub numele de domenii variabile. Variabilitatea amino-
acizilor produce o specificitate pentru un anumit epitop şi permite
legarea specifică a anticorpului de antigenul împotriva căruia a fost
produs.
 Din punct de vedere imunohistochimic, molecula de IgG are 3
trăsături importante:
- capetele fragmentelor Fab sunt capabile să se lege de cîte un
determinant antigenic (au două locusuri (sit-uri) de legare la antigen);
- fragmentul Fc, comun tuturor anticorpilor speciei de animal nu
este implicat în combinarea cu antigenele;
- imunoglobulinele sunt ele însele macromolecule şi se pot
comporta ca antigene când sunt injectate la specii diferite de animale.
Ca şi antigen, molecula de IgG poate să aibă câteva locuri antigenice şi
poate să lege mai multe molecule de anticorpi. Această proprietate este
folosită în tehnicile de amplificare a reacţiei imunohistochimice.
 Surse de anticorpi pentru IHC

Anticorpii sunt produşi prin imunizarea unui animal de

experienţă cu un antigen. Injectarea antigenului se face de mai multe ori.
Animalul va dezvolta răspuns umoral şi anticorpii astfel produşi pot fi
extraşi din sângele animalului. Este puţin probabil ca animalul să
producă numeroase clone de plasmocite (celule care sintetizează
anicorpii specifici) ca reacţie imună la injectarea antigenului. Fiecare
clonă de plasmocite va produce un anticorp cu o specificitate uşor
diferită faţă de epitopii prezenţi pe imunogen. În plus, animalul poate
avea în mod natural mulţi alţi anticorpi şi proteine prezente în ser, care
pot genera probleme de reactivitate încrucişată sau colorare nespecifică.
 Serul imun conţine aproximativ 10 mg/ml imunoglobiuline,
din care numai 0,1-1 mg reprezintă anticorpul de interes. O parte din
aceşti anticorpi vor reacţiona încrucişat cu alte molecule şi, de aici,
necesitatea de a fi îndepărtaţi din ser prin diverse metode biologice şi
biochimice. Cel mai adesea se utilizează reacţia de precipitatre a
imunoglobulinelor cu sulfat de amoniu, urmată de cromatografie sau
alte tehnici de purificare. Dacă anticorpul de interes este prezent în
concentraţii mari, multe dintre reacţiile nedorite pot fi eliminate prin
diluarea anticorpului obţinut.
Cu toate acestea nu se poate obţine doar un singur tip de
anticorp pentru antigenul injectat animalului, şi din acest motiv,
acestia se numesc anticporpi policlonali. Anticorpii policlonali pot da
reacţii încrucişate cu alte molecule (antigene) din celule sau ţesuturi.
De aceea se consideră că un ser policlonal, oricât de purificat ar fi, nu
poate fi lipsit de reacţii încrucisate nedorite.
 Pentru a creşte acurateţea examenului imunohistochimic, s-a
reuşit obţinerea unor anticorpi monoclonali în culturi de celule, prin
tehnica hibridomului, prin combinarea unor limfocite B cu celule de
mielom. S-a izolat astfel o singură clonă imună de limfocite B sau
plasmocite care produc un singur anticorp, specific pentru un antigen.
Aceşti anticorpi se numesc anticorpi monoclonali.
Reacţiile încrucişate nu sunt în totalitate eliminate nici prin
utilizarea anticorpilor monoclonali deoarece aceşti anticorpi pot
recunoaste si alţi epitopi prezenţi în alte celule sau ţesuturi, normale
sau patologice. Totuşi este o proprietate a tuturor anticorpilor de a
forma complexe numai cu antigenele care le stimulează producţia. În
plus, un antigen mare, format din mai multe macromolecule diferite,
va avea mulţi determinanţi antigenici (mai mulţi epitropi) şi va
determina sinteza mai multor specii diferite de anticorpi, toate
capabile să se combine cu acelaşi antigen.
 Deşi fiecare moleculă de antigen se leagă numai de epitopul său
specific, două proteine aproape similare pot interacţiona cu un anticorp
determinat numai de una din ele. Asemenea reactivitate încrucişată
apare când locul determinantului antigenic este o secvenţă scurtă de
aminoacizi, comună ambelor antigene. Această reactivitatea
încrucişată este uneori o sursă de confuzie în interpretarea
preparatelor colorate imunohistochimic.
La ora actuală există mii de substanţe antigenice şi antiserice
care sunt disponibile în laboratoarele de diagnostic şi cercetare din
întreaga lume, producerea anticorpilor în laborator fiind azi o activitate
de cercetare dar şi comercială.
CD3
Limfocite T
CD3
Limfocite T
CD3
Limfocite T
CD 20
Limfocite B
CD 20
Limfocite B
PCNA
PCNA
CD68
Celule Kupffer- CD68
Limfocite T CD3
Limfocite B CD20
Celule Ito alfa -SMA
Celule Ito alfa -SMA