TESTELE IMUNOHISTOCHIMICE IN PATOLOGIA TUMORALA

1.Notiuni introductive :
-Imunohistochimia (IHC) reprezinta combinatia dintre 2 stiinte : imunologia si
histochimia, avind ca scop evidentierea proprietatilor antigenice ale unor substante intrun tesut, utilizind anticorpi monoclonali sau seruri polireactive.
-Vizualizarea substantelor antigenice se poate face atit la nivel tisular, cit si la nivel
celular si subcelular, pe preparate la gheata sau parafina.
-Imunohistochimia sau IHC se refera la procesul de detectare al antigenilor (de exemplu
al proteinelor), dintr-o sectiune a tesutului celulelor, prin exploatarea principiului legaturii
dintre anticorpi, in mod special in cazul anticorpilor prezenti in tesuturile biologice.
-Etimologia cuvantului provine de la imunologie - cu referire la anticorpii analizati in
cadrul procedurii si histo, care inseamna tesut. Colorarea imunohistochimica este utilizata
pe scara laga in diagnosticul si depistarea celulelor anormale, cum ar fi cele specifice
tumorilor canceroase. Markerii moleculari specifici sunt caracteristici anumitor procese
celulalre cum ar fi proliferarea sau moartea celulara (apoptoza).
-IHC este utilizata si in cercetarile fundamentale realizate pentru intelegerea distributiei si
localizarii biomarkerilor si a diferentierii proteinelor din diferite parti ale tesutului
biologic. vizualizarea unei interactiuni anticorp-antigen poate fi realizata in diverse
moduri. Deseori, un anticorp este conjugat cu o enzima, ca in procesul peroxidazei,
pentru a avea lor catalizarea unei reactii in urma careia se obtine o anumita coloratie (de
exemplu, imunoperioxiaza de coloratie).
2.Principalele aplicatii ale tehnicilor IHC in practica de rutina
1) Clasificarea histogenetica a tumorilor slab diferentiate sau anaplazice
2) Diagnosticul pozitiv al bolilor leucocitare
3) Tipizarea tumorilor neleucocitare
4) Detectia antigenelor virale si microbiene
5) Evidentierea markerilor de prognostic in cancer
6) Stabilirea susceptibilitatii de raspuns la tratament a unor tumori
Teste imunohistochimice (IHC) ofera :
- Confirmarea sau infirmarea diagnosticului histopatologic clasic de leziune
- Stabilirea histogenezei tumorilor maligne nediferentiate
- Distinctia intre leziuni neoplazice in situ, leziuni neoplazice invazive si leziuni
pseudotumorale
- Aprecierea factorilor moleculari de prognostic in tumori
- Evaluarea factorilor moleculari predictivi in tumori maligne, pentru modularea
terapiilor specifice
- Identificarea micrometastazelor tumorale, dificil de identificat cu certitudine pe
preparate histopatologice standard (coloratie H&E)
- Caracterizarea moleculara a tumorilor cu punct de plecare nedeterminat
- Identificarea unor agenti infectiosi in leziuni dsiplazice: HPV si Helicobacter pylori
3.Impactul IHC in diagnosticul anatomo-patologic
-Diagnosticul pozitiv si diferential in tumori solide si nesolide

-Deteminarea factorilor de prognostic in cancer :

-Microinvazia si pseudoinfiltratia
-Micrometastazele oculte
-Factori de proliferare
-Proto-oncogene si anti-oncogene
-Factori de crestere
4.Tehnica examenul imuno-histochimic este o metod adjuvant pentru examenul
histopatologic care poate preciza o serie de caracteristici intrinseci ale tumorii (prezena
unor receptori, a unor anomalii celulare specifice) utilizate pentru individualizarea
tratamentelor oncologice (adic fiecare pacient s primeasc un anumit tip de tratament,
ct mai adecvat tumorii pe care o are, cu toate caracteristicile ei).
- Prin acest examen se poate stabili mai exact tipul de cancer precum i modalitatea
terapeutic cea mai eficient.
-In anumite cazuri, coloratiile imunohistochimice sunt esentiale pentru a confirma
prezenta unor antigene fara de care nu se poate preciza un diagnostic exact. In acest caz,
vi se va cere acordul prealabil, avand in vedere costurile suplimentare pe care le implica.
-In alte cazuri, anatomopatologul va preciza un diagnostic dar va recomanda completarea
lui cu teste imunohistochimice. Aceste detalii sunt foarte importante pentru conduita
terapeutica ulterioara, putand sa faca chiar diferenta in succesul tratamentului. Tehnicile
imunohistochimice dau adesea informatii mult mai pretioase chiar decat alte analize
performante, cum este RMN-ul.
Tehnica Imunohistochimica (IHC)
-Biopsia de dimensiuni mici permite o fixarea rapida. Fixarea optima dureaz 24 de ore
dup care pot fi inactivai epitopii (locul in care se fixeaz anticorpii). Fixarea care
depaseste 48 de ore inactiveaz majoritatea epitopilor, determinnd posibile reacii
negative sau reacia pozitiva paradoxala.
-Fixatorul optim este formolul tamponat sau paraformaldehida. Includerea se face in
parafina histologica purificata
-Secionarea presupune efectuarea de sectiuni subtiri de 5 microni care vor fi intinse pe
lame degresate.
-Prelucrarea histologica obisnuita pentru deparafinare.
-Reaciile IHC se bazeaz pe legtura Ag-Ac, situsul legrii cu Ac fiind identificat fie
prin marcarea directa a Aglui, fie printr-o metoda secundara de legare, prin intermediul
unui lan de alte legturi, cu Ac marcai prin reacie indirecta cu 2 sau mai multe faze.
-Se lucreaza cu anticorpi monoclonali, de care sunt legate una sau mai multe molecule
enzimatice, ce catalizeaza transformarea unui substrat incolor intr-un produs de reactie
colorat. Enzima este cuplata covalent cu portiunea Fc a anticorpului; pe ea se plaseaza
substratul cromogenic.
-Enzimele utilizate sunt :
a.peroxidaza
b.fosfataza alcalina
-Substratele folosite sunt :

a.DAB (brun) sau AEC (rosu) pentru peroxidaza

b.fast red si fast blue pentru fosfataza alcalina
Antigenele (Ag)
Antigenele sunt substane care determin din partea organismului un rspuns imun, cu
producerea de anticorpi (Ac). Antigenele trebuie sa aib 2 proprieti principale:
-imunogenitate capacitatea de a induce formarea Ac i
- reactivitate specific cu anticorpul a crui formare a indus-o antigenul nsui.
Pot fi :
antigene de difereniere care pot fi prezente in celule embriofetale
(HCG, AFP, CEA), in celule adulte normale si in celulele corespondente tumorale
(filamente intermediare ale citoscheletului sau molecule de adeziune intercelulara);
antigene de citotip molecule de tip secretor (alfalactalbumina, caseina), molecule de tip
neuroendocrin (cromogranin, neuronspecific enolaza), hormoni;
oncogene si produsele lor implicate in oncogeneza (p53, cerb2),
cu implicaii in tratamentul genetic al tumorilor;
factori de proliferare evideniabili cu IMH (Ki67, PCNA), utili intro
Monitorizare mai atenta a terapiei din unele tumori, terapie altfel foarte agresiva;
antigene virale si microbiene (HPV, CMV, Pneumocistis carinii)
Anticorpii (Ac)
Anticorpii sunt imunoglobuline produse de plasmocite, dup recunoaterea unui Ag
strin.
Dintre cele 5 clase de imunglobuline, Ig G sunt cele mai frecvent utilizate in IMH.
Anticorpii policlonali se produc prin imunizarea unui animal cu o molecula purificata
specifica (imunogen) care conine antigenul de cercetat.
Ac monoclonal este caracterizat printr-o specificitate mare si cunoscuta pentru un
antigen.
Reactia dintre un Ag (sau un epitop al sau) si un Ac este nu numai foarte specifica ci si
foarte stabila; formarea acestor complexe imune sta la baza identificarii componentelor
antigenice celulare
5.Metode IMH (imunohistochimica)
metoda directa se folosete un substrat cromogen ataat la Ac primar, direct mpotriva
Ag pe care vrem s-l evideniem tehnica este simpl, dar sensibilitatea ei este redus si nu
permite o diluare excesiva a anticorpului primar
metoda indirecta are 2 sau mai multe faze, folosete un substrat cromogen care este
ataat la Ac II; Ac I nemarcat, este legat in poriunea sa Ag, de un Ac II marcat cu
peroxidaza de care este legat un sistem de relevare aceasta tehnica este mai sensibila
permite vizualizarea Ag existente in concentraii mici. Pe de alta parte Ac I anti specie
(antisoarece,antiiepure, anticapra ) sunt puin numeroi si de aceea mai uor de obinut.
Marcajul vizual
Existenta mai multor cromogeni, diferit colorati, pentru o anumita enzima permite
colorarea succesiva cu diferiti Ac si pentru localizarea mai multor Ag pe aceeasi sectiune.

In toate cazurile in care se utilizeaza un sistem oarecare de imunperoxidaza, cromogenul

preferabil este 3,3 diaminobenzidina (DAB) ce determina o coloraie maro.
Alt cromogen este aminoetilcarbazolul (AEC), ce determina un precipitat rou.
-Metoda ABC:
(dupa Hsu et al., 1981, modificata de G. Bussolatti & P. Gugliotta, 1983)
In prima etapa, Ac primar se cupleaza cu Ag dorit; in a doua etapa de Ac primar se leaga
un Ac secundar, marcat cu biotina
In a treia etapa, se introduce un reactiv cu mai multe molecule de avidina marcata cu
peroxidaza
La locusul antigenic se leaga un complex cu multe molecule de peroxidaza, intensitatea
reactiei cromogene va fi accentuata si sensibilitatea metodei mare
-Metoda dextranului (DAKO EnVisionTM Systems, 1996)
Permite cuplarea unui mare numar de molecule enzimatice pe un schelet polimeric de
dextran hidrosolubil; cu acest complex se pot cupla Ac secundari
Se obtine astfel un reactiv care poate fi utilizat in cadrul unei tehnici in 2 timpi, care
aduce o mare cantitate de enzime la locul reactiei si va creste foarte mult sensi-bilitatea
detectarii Ag dorit
6.Tipuri de anticorpi si antigene decelati prin metoda imunohistochimica
Anticorpii anti-melanom utilizati n laborator sunt: HMB45, Melan-A, S-100, Nestin,
MAGE, vimentina, citokeratin,NSE, p-53, ki-67, PCNA.
S-100: este anticorpul cel mai vechi si intens utilizat avnd sensibilitate crescut dar fiind
putin specific; marcheaz leziunile melanocitare att benigne ct si maligne, nuclear si
citoplasmatic.Sunt foarte rare cazurile cnd ntr-o tumor melanocitar S-100 este
complet negativ(ex. unii nevi albastri celulari).
MelanA: este un anticorp monoclonal ce marcheaz 80-90% din melanoame; marcajul
este citoplasmatic. De subliniat c melanocitele normale ct si unele celule nevice
epidermice sau dermice sunt pozitive la imunomarcaj. MelanAeste negativ n cazul
diferentierii neuroide(neuronevus) si n melanomul cu celule fuziforme sau n cel
desmoplastic.
Citokeratina: este negativ n celulele melanoamelor. Au fost raportate cazuri de
melanoame maligne ce au prezentat pozitivitate focal pentru acest marker.
NSE (Enolaza Neuron Specific): este pozitiv n melanoame; marcajul este
citoplasmatic. Afost propus ca marker al diferenierii neurale si neuroendocrine n
tumori.
n practic, n marea majoritate a cazurilor, diagnosticul unei tumori melanocitare
(pigmentat sau acromic) nu necesit dect o bun coloratie standard (HE), dac exist
activitate de jonctiune. Imunohistochimia este util n cazul tumorilor melanocitare
acromice pentru a putea fi etichetat corect histogeneza; dac exist discordant ntre

imunomarcaj si morfologie,aceasta din urm va fi privilegiat prin lumina diagnosticului

clinic.
Markeri imunohistochimici in tumorile epiteliale benigne
CITOKERATINE - proteine ale citoscheletului epitelial dupa catalogul lui MOLL sunt
descrise 20 de tipuri de CK:
-CK acide (I) (9-20) / bazice (II) (1-8)
-CK cu GM mare (1, 2, 3, 9, 34-beta/E12) (celule bazale din epitelii stratificate)
-CK cu GM mica (8, 18, 19, 20): epitelii simple cubo-cilindrice
ANTIGENE de membrana epiteliala (EMA, HMFG2, BerEP4, B72.3): epitelii glandulare
Tumorile stromale gastrointestinale, n literatura anglo-saxon GIST, constituie un
grup relativ nou de neoplasme ale tractului digestiv, studiului crora i se atribuie o
importan major, deoarece problemele legate de diagnosticul, evoluia i tratamentul lor
rmn a fi actuale pn n prezent.
-Pentru a le delimita, n 1983 a fost propus termenul de GIST gastrointestinal stromal
tumors, de ctre Mazur i Clark , care era incert i nu presupunea markeri tumorali
specifici. Ulterior studiile imunohistochimice au determinat antigenul membranar CD34
drept marker important al GIST, dei existau numeroase tumori similare cu CD34
negativ. Avnd o localizare divers, GIST prezint un tablou clinic nespecific, deseori
fiind descoperite accidental imagistic sau intraoperator. Toate tumorile stromale
gastrointestinale, indiferent de localizare (esofagiana,stomacala,retroperitoneala), se pot
complica prin sindrom subocluziv, ocluziv, perforaie cu hemoragie, care nece-sit
intervenii chirurgicale de urgen.
-La examenul imunohistochimic sunt relevante urmtoarele date: CD117 este pozitiv n
peste 95% cazuri din GIST. El nu poate fi privit ca unicul marker al lor, din cauza
expresiei sale n alte tumori de tipul limfomului anaplastic cu celule mari, fibromatozei,
mastocitozei, sarcomului sinovial, rabdomiosarcomului, angiosarcomului, gliomului,
germinomului, sarcomului Ewing, dar nu se ntlnete n veritabilele tumori ale
musculaturii netede sau esutului nervos. Astfel nu toate tumorile care exprim KIT sunt
GIST, acest antigen fiind util n diferenierea lor fa de alte tumori mezenchimale .
Recent a fost determinat alt marker al GIST - DOG1.1, care este pozitiv n toate
tumorile stromale, chiar i n acele KIT-negative sau cu mutaii. Multe din GIST exprim
i nestin (90%), CD34 (60-70%). Ali markeri imunohistochimici care se pot depista n
GIST sunt: SMA (smooth muscle actin - 20-40%), h-caldesmon, CD44, vimentin,
proteina S-100 (<5%), desmin (<2%) [10, 13-15]. Prezena antigenului CD34 este
considerat un factor de pronostic nefavorabil, comparativ cu cea a CD44 .
Markeri utilizai pentru tumorile mamare:
- Markeri ai celulelor mioepiteliale: actina specifica muschiului neted (SMA),
calponina, proteina p63;
- Markeri epiteliali: citokeratinele (CK): CK 5/6, CK 7, CK8, CK 19, 34E12, MNF
116;
- Markeri pentru angiogeneza tumorala: CD105, VEGFR 1, VEGFR 2;
- Alti markeri: caderina E, proteina S 100, vimentina, CD34, CD10, CD31, CD117,
Mucina 1 (MUC 1); Ciclina D1;

- Factori prognostic: receptori estrogenici, receptori progesteronici, proteina de

crestere tumorala c-erbB2, proteina
BRCA 1, proteina p53;
Factori de proliferare: Ki 67, PCNA.
TUMORI DE TESUTURI MOI (MEZENCHIMALE):
a. DIAGNOSTICUL POZITIV i DIFERENIAL (stabilirea fenotipului tumoral al
diferitelor tipuri de tumori stromale: fibrosarcom, angiosarcom, neurofibrom, tumora de
teaca de nervi periferici, sarcom stromal; a tipului tumoral benign vs. malign) se
efectueaz urmtorii markeri, pe lng o parte din cei enumerai mai sus:
- pentru tumorile stromale: Vimentina, S 100, CD 34, CD 117,
- pentru tumorile neuroendocrine: Cromogranina, Sinaptofizina,
- pentru tumorile musculare: Actina Muschiului Neted (SMA), Desmina, Calponina,
- pentru tumorile vasculare: CD31, CD34, Factorul VIII,
- pentru tumorile de nervi periferici: Proteina Gliala Fibrilara Acida (GFAP),
Neurofilamente, Enolaza Neuronal Specifica (NSE),
- pentru tumorile mezoteliale: Calretinina, Antigenul de Membrana Epiteliala
(EMA), Citokeratina 5/6.
b. FACTORI DE PROLIFERARE SI PROGNOSTIC: Ki 67, PCNA, p53.
TUMORI PULMONARE:
a. DIAGNOSTICUL POZITIV i DIFERENIAL - se efectueaz
urmtorii markeri IHC:
- Citokeratinele (CK): 7, 20, AE1/AE3, 5/6, 34E12,
- Antigenul de Membrana Epiteliala (EMA),
- Antigenul Carcinoembrionar (CEA),
- Proteina p63, proteina S 100, Factorul de transcriptie tiroidian (TTF 1), Mucina 2
(MUC 2).
b. FACTORI DE PROLIFERARE SI PROGNOSTIC: Ki 67, PCNA, p53.
c. FACTORI PREDICTIVI: Factorul de crestere al endoteliului vascular (VEGF).
Pentru diagnosticul pozitiv i diferenial al METASTAZELOR CU PUNCT DE
PLECARE NEPRECIZAT:
a. Identificarea TIPULUI HISTOLOGIC:
- Citokeratina 7, 20, MNF 116, 5/6, 19 pentru adenocarcinom,
- Citokeratinele AE1/AE3, citokeratina 34E12 pentru carcinom scuamos,
- Markeri mezenchimali pentru tumori mezenchimale (vezi mai sus),
- Markeri melanocitari (melanom malign vs. nev Spitz): HMB 45, Melan A, CD 44,
- Markeri pentru limfoame.
b. Identificarea PUNCTULUI DE ORIGINE AL CELULELOR TUMORALE:
- CA 125 - tumori de col uterin, tumori ovariene,
- CK 7, CK 20 tumori gastrointestinale,
- CK 7 + Receptori estrogenici, Receptori progesteronici tumori mamare, tumori
endometriale,
- TTF 1, Tiroglobulina tumori pulmonare, tumori tiroidiene,

- -Fetoproteina (-FP), Gonadotropina Corionica Umana (GCH) tumori de

cordoane sexuale,
- CA 19 -9 tumori pancreatice.
Pentru unele tipuri de LIMFOAME se efectueaz:
- pentru limfoame maligne non-Hodgkiniene: antigenul comun leucocitar (CLA),
CD45RO (marker pentru limfocitele T), CD20 (marker pentru limfocitele B), CD57,
CD4, CD8, proteina bcl-2 (antiapoptotica),
- pentru limfomul Hodgkin: CD15 si CD30.
7.Rezultatele examenului imunohistochimic au fost utile n determinarea
prognosticului, n selecia pacienilor cu risc crescut, n alegerea terapiei specifice
dependente de caracteristicile tumorale i individuale ale pacienilor ca i n
dezvoltarea de noi metode terapeutice direcionate pe inte moleculare.
-Din studiile efectuate rezult c examenul imunohistochimic tinde s devin cu
mult succes un examen de rutin, absolut indispensabil pentru monitorizarea cazurilor
de carcinom mamar.
-Ceea ce n trecut reprezenta doar un domeniu de cercetare, aplicat sporadic
din cauza dificultilor tehnice i a costurilor mari, astzi face parte din arsenalul
investigaiilor morfologice cu implicaii clinice importante.