CITOMETRIA IN FLUX

Citometria in flux
reprezinta o abordare
tehnica noua, de mare
complexitate, ce permite
determinarea simultana a
mai multor parametri fizici
si chimici caracteristici
unei singure celule aflate Flow ~ celule in miscare
in miscare intr-un curent Cyto ~ celula
Metry ~ masura
lichid.
Masurarea proprietatilor
celulelor intr-un sistem fluid.
 Citometria in flux este o tehnica moderna, complexa si
performanta de analiza celulara, care permite masuratori
rapide, cu rezolutii superioare metodelor clasice, separate
pentru fiecare celula sau constituent celular, incluzand acizii
nucleici, complexele imune, cromozomii sau organitele
celulare, aflate in cadrul unor suspensii. Astfel, pot fi facute
analize multiparametrice simultane, ale unui numar mare
de particule (de la 400 la 3000 particule/secunda), ale caror
caracteristici au coeficienti mici de variatie.
 Citologia vs. Citometria in flux
Citologia
 Localizarea antigenelor celulare
este posibila
 Subtipurile celulare sunt greu de
cuantificat
 Numarul de masuratori
multiparametrice este limitat
Citometria in flux
 Localizarea antigenelor celulare nu
este posibila.
 Numarul de celule analizat intr-un
timp foarte scurt este foarte mare
 Analizele multiparametrice sunt
posibile.
 Ce se intampla in cazul citometriei in flux?

 Celulele in suspensie sunt aliniate, una dupa alta, in Sistemul

vederea prezentarii individuale sistemului de excitare fluidic

 O sursa LASER ilumineaza fiecare celula individual, iar Sistemul

lumina reflectata si fluorescenta emisa sunt colectate optic
de detectori

 Datele colectate sunt convertite intr-un semnal electric, Sistemul

direct proportional cu fluorescenta emisa electronic

 Datele electronice sunt convertite in date digitale si Interpretarea

analizate cu ajutorul unor programe specifice datelor
 Principiul de functionare al unui citometru
 Principiul de operare - celulele (particulele existente în proba) sunt injectate într-un
curent de fluid - curent de transport / curent purtător. Suspensia celulară trece printr-o
zona de detecţie considerată zona de interacţiune a fiecărei particule în parte, cu o sursă de
excitaţie luminoasă.
 Semnalele luminoase sunt detectate simultan de către 4 fotodetectori şi transformate în
semnale electrice echivalente, care sunt, apoi, amplificate şi convertite în semnale digitale.
 Se vor obţine simultan, pentru fiecare particulă în parte, 4 parametri diferiţi: FSC si SSC -
criterii morfologice), iar FL1 şi FL2 (emisia de fluorescenta).
 FSC (Forward Scatter) “împrăştiere înainte” – dimensiunea si forma particulelor.
 SSC (Side Scatter) “împrăştiere laterală” – granularitatea particulelor.
 FL1/2 - Intensitatea fluorescentei este proportionala cu cantitatea colorantului fixat, respectiv
cu cantitatea componentei celulare de interes (acizi nucleici, antigene de suprafata).
 Forward Scatter

Laser Beam
FSC
Detector

Original from Purdue University Cytometry Laboratories

 Side Scatter

Laser Beam
FSC
Detector

Collection
Lens

SSC
Detector
Original from Purdue University Cytometry Laboratories
 Fluorescence Detectors

Laser Beam
FSC
Detector

Collection
Lens

Fluorescence
Detector A, B, C, etc…

Original from Purdue University Cytometry Laboratories, Modified by James Marvin

 Importanta FSC si a SSC

Corelarea datelor despre dimensiunea si structura interna a
celulelor permite diferentierea tipurilor celulare intr-o
populatie heterogena de celule

Granulocytes
Lymphocytes
SSC

Monocytes

RBCs, Debris,
Dead Cells
FSC
Aplicatiile citometriei in flux:

•Dimensiune, structura interna a celulei;

•Continutul de ADN (ciclu celular, ploidie, proliferare);
•Continutul de ARN;
•Analiza si sortarea cromozomilor;
•Expresia si localizarea proteinelor;
•Antigene de supratafa, intracelulare si nucleare;
•Apoptoza;
•Viabilitatea celulara;
Determinarea, prin citometrie in flux, a
continutului de ADN in celulele
meristemului radicular, la radicelele de
ceapa (Allium cepa L.), dupa 72 ore de la
punerea bulbului de ceapa in contact cu
apa.
A. Histograma ADN in cazul proliferarii
asincrone;
B. Histograma ADN dupa un tratament
prealabil al radicelelor, timp de 15 ore, cu
hidroxiuree si eliberarea, pentru 2 ore, de
sub influenta agentului blocant. Dupa 2 ore
de la incetarea tratamentului: 67% dintre
celulele se afla in faza S timpurie; 17%
dintre celulele sunt celule dipoide care au
iesit din ciclul celular, aflandu-se in faza
G0;16% dintre celulele sunt in faza G2-M.