Sunteți pe pagina 1din 10

Tehnica ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezintă la ora actuală,


una din cele mai des folosite metode, de indentificare şi apreciere cantitativă
pentru anticorpi, antigene, hormoni, citokine şi o paletă largă de alte
molecule, inclusiv peptide sintetice.
Tehnica ELISA a fost inventată de un grup de cercetători de la Universitatea
din Stokholm condus de Peter Perlmann şi Eva Engval, aceştia publicând
primul articol despre ELISA în 1971. Articolul descria aprecierea cantitativă a
IgG în serul de iepure folosind fosfatază alcalină ca enzimă de indentificare.
Avantaje de siguranţă crescută şi cele economice, faţă de testarea
radioimună(RIA) au făcut din tehnica imunoenzimatica ELISA una
indispensabilă pentru domeniul medicinei clinice, biologiei si al
biotehnologiei.

1. PRINCIPIUL METODEI

Principiul metodei, indiferent de tipul de ELISA ales, este în esenţă


acelaşi şi se bazează pe reacţia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de
captură este fixat pe un suport solid după care este pus în contact cu o
imunoglobulină, un antigen sau respectiv orice moleculă pentru care are
specificitate. O enzimă cuplată fie direct de imunoglobulină sau de un alt
anticorp anti-imunoglobulină degradează un substrat cromogen incolor
producând un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o
lungime de undă corespunzătoare.

2. PUNCTE CRITICE ÎN PROTOCOLUL ELISA

În implementarea oricărei tehnici ELISA înţelegerea proceselor de bază


şi aplicarea corectă a acestora reprezintă un factor esenţial în atingerea
obiectivului propus.
Etapele fundamentale ale tehnicii sunt reprezentate de:
• Prepararea conjugatului
Conjugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate
pentru molecula de determinat, cuplat cu o enzimă. Cuplarea enzimei se
realizează prin cross-linkare sub acţiunea unor agenţi favorizanţi cum ar fi
glutaraldehida, di-iso-cianat toluen, p-benzochinona, etc.
Deşi un grup mai mare de enzime au fost utilizate de-a lungul timpului,
fosfatază alcalină şi peroxidază din hrean(HRP-/7orserac//s/) peroxidase)
rămân cele mai populare datorită randamenului oferit prin prelucrarea rapidă
a substratului şi a gamei vaste de tehnici de developare existente.
Alte enzime folosite în tehnica ELISA sunt (3-galactozidaza, glucozoxidaza,
pirofosfataza, etc.
în cazul în care conjugatul folosit este reprezentat de un grup enzimă-
anticorp, anticorpul respectiv trebuie să fie ales în aşa fel încât să recunoască
alt determinant antigenic al moleculei de determinat cum ar fi fragmentul Fc
al imunoglobulinei sau alt epitop al antigenului.
Există o multitudine de protocoale pentru prepararea conjugatului disponibile
în literatură dar realizarea acestora presupune experienţă în domeniu şi timp
consumat în plus. Mai convenabilă este achiziţionarea conjugatului de la
firme specializate în domeniu.
• Fixarea anticorpului sau antigenului de captură pe placă
Pentru pregătirea unei determinări ELISA, pregătirea plăcii de reacţie este
foarte importantă.
Cu toate că diferite tipuri de plăci gata pregătite pot fi achiziţionate de
la producători, acestea pot fi adesea scumpe aşa că prepararea plăcilor în
laborator reprezintă încă un punct cheie în tehnica ELISA.
În general se folosesc plăci de microtitrare cu 96 de godeuri fabricate din
material plastic.
Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafeţe din plastic datorită
interacţiunilor hidrofobice între structurile proteice nepolare şi structurile
nepolare ale matricei polimerului.
Există mai multe protocoale de fixare, dar cele mai des folosite, implică
incubarea unei diluţii a anticorpului sau antigenului de captură în godeul
plăcii de microtitrare într-un tampon carbonat la pH 9-10.
Incubarea poate fi de câteva ore sau peste noapte şi se face la 37°C sau la
temperatura camerei.
Placa de microtitrare astfel pregătită poate fi păstrată la 4°C până la 6 luni.
Deoarece fixarea anticorpilor de placă nu este una specifică este necesară
blocarea situsurilor de legare nespecifică pentru a preveni fixarea celorlalţi
reactanţi de placă în locul interacţiunii acestora cu anticorpul fixat. Blocarea
se realizează de obicei prin incubarea cu un tampon de blocare, format de
obicei dintr-o proteină inertă şi un detergent neionic.
• Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat în
placă
Adăugarea diluţiei de antigen sau anticorp în placa de reacţie reprezintă
prima etapă efectivă a tehnicii ELISA şi nu un pas pregătitor.
În această etapă molecula de determinat se ataşează prin legături de
hidrogen, ionice, interacţiuni hidrofobice şi forţe de interacţiune van der
Waals, de anticorpul/antigenul completentar, de captură.
Incubarea se realizează de obicei la temperatura camerei timp de 2 ore.
Cu toate că numărul de legări specifice în timp de 2 ore este de obicei
suficient pentru a obţine un semnal puternic în reacţia cromogenă, saturarea
situsurilor de legare(starea de echilibru) este atinsă în aproximatix 5-10 ore,
aşa că o incubare mai lungă poate duce la rezultate mai bune.
• îndepărtarea reactanţilor liberi din placă (Spălarea)
Un pas foarte important în tehnica ELISA îl reprezintă etapele de spălare.
Moleculele nefixate fie în timpul aderării la placă fie în timpul legărilor
specifice cu anticorpii de captură trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu
inhiba legarea reactanţilor ce urmează a fi adăugaţi ceea ce ar conduce la un
rezultat eronat.
O etapă de spălare presupune încărcarea godeurilor cu o anumită cantitate
de tampon de spălare şi îndepărtarea tamponului de spălare după o perioadă
scurtă de timp.
Tamponul de spălare este reprezentat în general de o soluţie de tampon
fosfat salin(TFS) la care se poate adaugă 0,05% azidă de sodiu(NaN3).
Pentru a asigura o spălare bună a plăcii şi implicit o îndepărtare eficientă a
reactanţilor liberi din placă sunt necesare mai multe spălări între etapele
determinării.
La sfârşitul fiecărei etape de spălare, indiferent de numărul de spălări din
respectiva etapă, este bine să se elimine orice urmă de tampon de spălare
din godeuri. Pentru aceasta, placa este întoarsă şi scuturată energic pe un
prosop de hârtie.
Foarte importante rămân spălările după fixarea antigenului pe placă, după
prima incubare şi după incubarea cu soluţia de conjugat.
Numărul de spălări într-o etapă poate fi cuprins între 2 şi 5 dar atât timp cât
spălările nu sunt făcute într-o manieră „brutală" un număr mai mare de
spălări nu poate decât să crească calitatea tehnicii.
Spălarea se poate face manual folosind o pipetă multichannell sau cu un
spălător automat ELISA.
La folosirea spălătorului automat trebuie acordată atenţie deosebită folosirii
unor plăci recunoscute de aparat şi ajustarea setărilor aparatului la tipul de
godeuri - cu fundul plat, conic, rotund.
• Incubarea conjugatului în placă
în funcţie de tipul de ELISA aplicat, adăugarea conjugatului în reacţie
presupune legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul
specific.
Ca şi în etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat
prelungirea timpului de reacţie poate oferii un semnal mai puternic.
După incubare, plăcile sunt spălate şi pot fi păstrate la 4°C câteva luni până
la adăugarea substratului cromogen.
• Adăugarea substratului cromogen
Adăugarea substratului cromogen reprezintă o etapă critică în tehnica ELISA
deoarece este etapa în care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat.
Este de asemenea prima etapă în care putem semnala dacă vreo etapă în
protocol a fost executată greşit sau unul dintre reactivi nu funcţionează.
Substratul cromogen este adăugat în godeuri şi placa este incubată la
întuneric o anumită perioadă de timp, în funcţie de caracteristicile enzimei şi
ale substratului, şi reacţia este oprită prin adăugarea unei soluţii de stopare.
Timpul de incubare al substratului cromogen în proba cu conjugatul fixat se
determină empiric prin observarea modificării culorii amestecului de reacţie
până la o intensitate comparabilă cu cea teoretică a produsului final.
Conjugatul poate fi reprezentat de o enzimă cuplată cu straptavidină, o
proteină tetramerică obţinută din bacteria Streptomyces avidinii, ce are o
afinitate foarte mare pentru biotină(vitamina H). Biotina poate fi cuplată prin
diverse procedee la un aticorp şi astfel, pe baza afinităţii streptavidinei
pentru biotină, conjugatul se poate cupla la anticorpul biotinilat fără a fi
nevoie de un conjugat enzimă-anticorp specific. Această procedură este
deosebit de importantă în cazul tehnicilor ELISA sandviş în care se dispune de
o cantitate mică de anticorpi monoclonali, folosirea complexului stravidină-
biotină amplificând sensibilitatea analizei de 2-5 ori.
Deşi această incursiune presupune adăugarea de paşi la protocolul iniţial,
efortul este unul recompensat printr-o imbunătăţire considerabilă a
sensibilităţii analizei.
• Interpretarea rezultatelor
Constă în aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciază mai întâi
vizual, pentru determinarea virării de culoare după adăugarea substratului şi
stabilirea timpului de menţinere a lui până la stoparea reacţiei.
Densitatea optică a fiecărei probei se apreciază la stectrofotometru, la o
lungime de undă corespunzătoare.
Aprecierea rezultatelor se face prin două metode :
1. Metoda calitativa de apreciere a pozitivităţii probelor, prin
calcularea valorilor prag (cut off) faţă de care se raportează absorbanta
fiecărei probe. Această valoare este determinată corform formulei:
COX+ 2 DS
unde CO este valoarea prag (cutt off), X - media valorilor negative, DS este
deviaţia standard. Probele cu valoarea absorbantei sub limita prag sunt
considerate negative iar cele peste această valoare sunt considerate pozitive.
2. Metoda cantitativa presupune folosirea unor probe standard, de
concentraţii cunoscute, cu ajutorul cărora se trasează o curba standard.
Aceasta se realizează prin introducerea concentraţilor probelor standard pe
axa X a unui grafic, a valorilor densităţilor optice respective pe axa Y şi
stabilirea punctelor de intersecţie. Curba standard se defineşte ca cea mai
apropriată ecuaţie liniară care să intersecteze cât mai multe din punctele de
pe grafic.
Folosindu-ne de valorile cunoscute putem extrapola o funcţie, a relaţiei dintre
densitatea optică şi concentraţia probei, prin regresie liniară. Ecuaţia obţinută
fiind de forma:
DO=C*k + DO0
unde DO este densitatea optică a probei, C - concentraţia probei, k -
constanta, DO0-valoarea absorbantei la o concentraţie a probei egală cu 0.
Valoarea lui DO0 poate fi calculată în orice program de calcul computerizat
printr-o funcţie ce returnează valoarea unei curbe în punctul de intersecţie cu
axa Y. în Microsoft Excel putem folosi funcţia INTERCEPT având ca parametri
pe de-o parte valorile concentraţiilor probelor standard şi pe de altă parte
valorile densităţilor optice respective.
După calcularea lui DO0 putem afla valoare lui k şi de aici prin rezolvarea
ecuaţiei obţinem formula de calcul a concetraţiei probelor în funcţie de
valoarea densităţii optice :
C = (DO - DO0)/k

3. CLASIFICAREA TEHNICILOR ELISA

Datorită multiplelor aplicaţii ale metodei imunoenzimatice ELISA, au


apărut diferite protocoale pentru executarea acesteia în funcţie de
particularităţile moleculei de determinat şi de modul în care procesele
fundamentale ale metodei ELISA se desfăşoară.
O prima clasificare a tehnicilor ELISA se poate face referitor la modul de
fixare al anticorpului la antigenul de captura, astfel facandu-se distincţia intre
fixare competitiva şi necompetitiva.
O altă clasificare se face în funcţie de modul direct sau indirect în care
conjugatul se fixează de antigenul sau anticorpul de captura.
O categorie separată de tehnici ELISA o reprezintă tehnicile sandviş, în care
un antigen este prins intre 2 sau chiar 3 anticorpi, dintre care primul este cel
de captură şi ultimul este cel din conjugat.
Tehnica ELISA celulara, denumită de unii autori şi cELISA reprezintă o
determinare în care antigenul sau anticopul fie el de determinat sau de
captură este o moleculă exprimată la suprafaţa membranei celulare
Tehnici ELISA folosite curent
ELISA INDIRECTĂ
Această tehnică este utilă pentru determinarea concentraţiei
anticorpilor serici sau din supernatantul celulelor de tip hibridoma. Metoda se
pretează situaţilor în care cantităţi de ordinul miligramelor din antigenul
purificat sau semipurificat sunt disponibile.
Protocolul presupune fixarea antigenului pe fundul plăcilor de microtitrare şi
blocarea situsurilor de legare nespecifică, incubarea soluţiilor de testat şi
spălarea anticoprilor necuplati din placă
după incubare. Soluţia de conjugat (conjugat enzimă-anticorp anti-anticorpul
de determinat) se adaugă în reacţie, se incubează şi o noua etapă de spălare
inlatură conjugatul nefixat din placă. Se adaugă substratul cromogen şi după
parcurgerea timpului de incubare reacţia este stopata. Cantitate de substrat
descompus de enzimă este determinată prin citire la spectrofotometru.
Valorile densităţilor optice vor fi direct proporţionale cu cantitatea de
anticorpi din soluţia testata.
ELISA COMPETITIVA DIRECTA
Această tehnică se poate folosii pentru a detectarea calitativa şi
cantitativa a antigenelor solubile şi este indeosebi utilă cand atât antigenul
cât şi anticorpii specifici sunt disponibil în cantităţi de ordinul miligramelor.
Protocolul presupune fixare antigenului de captură pe fundul plăcii şi
adăugarea în acelaşi timp a conjugatului enzimă-anticorp specific şi a soluţiei
de testat care conţine antigene solubile. Cuplarea conjugatului la antigenul
de captură este inhibată de cuplarea la antigenul solubil. După incubarea cu
amestecul de conjugat şi antigen solubil inhibitor, reactanţii nefixati sunt
indepartaţi prin spălare. Se adaugă subtratul cormogen şi după incubare
reacţia este stopata. Cantitatea de antigen din soluţia de testat este direct
proporţională cu gradul de inhibare al transformării substratului şi poate fi
cuantificat prin intrapolare pe o curba de inhibare generată prin realizarea
unor diluţii seriale ale soluţiei standard de antigen.
ELISA SANDVIŞ
Tehnicile care folosesc principiul anticorpi-sandviş ar putea reprezenta unele
din cele mai utile determinări imunoenzimatice pentru determinare
antigenelor deoarece frecvent oferă o sensibilitate de 2-5 ori mai mare decât
alte tehnici de determinare a antigenulei
Protocolul presupune folosirea unor anticorpi specifici de captură fixaţi pe
placa de microtitrare peste care se adaugă soluţiile de antigen de testat.
După incubare antigenul nelegat este inlaturat prin spălare iar în placă se
adaugă soluţia de conjugat(conjugat enzimă-anticorp specific pentru alt
epitop al antigenului), etapă căreia ii urmează o noua incubare. Conjugatul
nelegat este inlaturat prin spălare. Se adaugă substratul cromogen şi după
parcurgerea timpului de incubare reacţia este blocata. Cantitatea de substrat
hidrolizat este direct proporţională cu cantitatea de antigen din soluţia de
testat.
ELISA DUBLU-SANDVIŞ
Tehnică folosită în special pentru detectarea anticorpilor specifici în cazul în
care se dispune de o cantitate mică de anticorp specific şi nu se dispune de
antigen purificat. Tehnica se poate folosi şi pentru investigarea poziţiei
epitopilor diferiţilor anticorpi monoclonali formaţi impotriva unui antigen
comun.
Suportul solid este acoperit cu anticorpi anti-imunoglobulina (imunoglbulina
provenită de la speciile imunizate). Soluţia de anticorpi de testat se
incubează în placă şi la sfârşit anticorpii nelegaţi sunt inlaturaţi prin spălare.
Se adaugă soluţia de antigen şi se incubează. După incă o etapă de spălare
se adaugă conjugat enzimă-antigen specific şi se incubează din nou.
Conjugatul nelegat este indepartat prin spălare şi se adaugă substratul
cromogen.
Probele din godeurile în care apare reacţia de culoare sunt desemnate posibil
pozitive adică ar putea să conţină anticorpi specifici. Verificarea rezultatelor
fals pozitive sau a probelor cu o pozitivitate incertă se poate face prin
retestarea probelor respective. Probele vor fi lucrate în patru exemplare în
godeuri în care s-a fixat anticorpul de captura. în doua dintre godeuri se va
adaugă antigenul iar în celelalte doua doar un tampon de blocare. în toate
cele patru godeuri se continua cu adăugarea conjugatului şi a substratului
cromogen. Plăcile vor fi citite după o ora. Acesta
procedură va elimina rezultatele fals pozitive obţinute pe fondul reacţiei
dintre anticorpii de testat cu anticorpii din conjugat.
Pentru a distinge rezultatele pozitive dar cu o concentraţia mică de anticorpi
specifici plăcile pot fi citite din nou după câteva ore sau zile de la adăugarea
substratului cromogen.
ELISA CELULARĂ DIRECTA
Tehnica este folosită pentru evaluarea prezenţei antigenelor sau a
receptorilor de suprafaţa pe membrana celulelor de testat folosind anticorpi
existenţi sau alţi liganzi specifici antigenelor membranare.
Protocolul presupune determinarea densităţii optime a suspensiei celulare
per godeu prin analiza intersectată a diluţiilor seriale şi obţinerea suspensiei
celulare prin centrifugare şi resuspendare în volumul determinat. Un volum
fix de suspensie celulară este adăugat în godeurile plăcii de microtitrare,
placa este centrifugată şi supernatantul este inlaturat. Etapele următoare
presupun desprinderea butolunul celular şi resuspendarea celuleror în
conjugatul enzimă-anticorp specific anti-molecule membranare. După
incubare plăcile sunt centrifugate şi conjugatul nelegat este inlaturat printr-o
spălare blânda. La acest moment se adaugă substratul cromogen.
In timpul etapelor de incubare în prezenţa conjugatului sau a substratului
cromogen placa va fi agitată uşor la interval de 15 minute pentru a asigură o
buna interacţiune intre reactanţi.
Nivelul de exprimare antigenică la suprafaţa celulară este direct proporţional
cu nivelul de transformare a substratului.
Celulele eucariote secretă cantităţi variabile de fosfatază alcalina cea ar
putea interfera în tehnica ELISA din această cauză o evaluare a cantităţii de
fosfatază alcalina exprimată de celulele de testat va fi efectuată intr-un
experiment preliminar. Dacă celulele secretă fosfatază alcalina la un nivel ce
ar putea interfera cu protocolul de analiza, enzimă din conjugat va fi inlocuită
cu o alta, cum ar fi (3-galactozidaza.
Celulele folosite pot fi fixate inainte de analiză dar numai dacă se poate
demonstra că celulele fixate işi păstrează antigenicitatea membranare.
Fixarea se poate face prin suspendarea celulelor intr-o soluţie de
glutaraldehidă 0,5% timp de 30 de minute şi spălare ulterioare.
Această tehnică poate fi la fel de sensibilă ca şi citometria în flux în
cuantificarea nivelului de exprimare antigenică al unei populaţii celulare dar
spre deosebire de metoda citometrică această metoda nu face distincţia intre
populaţiile celulare şi prin urmare nu poate fi aplicată unei populaţii
heterogene de celule.
ELISA CELULARĂ INDIRECTA
Această tehnică este concepută pentru detectarea anticorpilor specifici
impotriva antigenelor mebranare.
Anticorpii anti-antigene membranare sunt detectaţi prin incubarea celulelor
cu o soluţie de anticorpi primari de testat. După centrifugare şi spălare
pentru inlaturarea anticorpilor nelegaţi, celulele sunt incubate cu o soluţie de
conjugat enzimă-anticorp secundar(anticorp anti-anticorpul primar). Plăcile
sunt centrifugate şi conjugatul nelegat este inlaturat prin spălare. Se adaugă
substratul cromogen.
Cantitatea de anticorpi primari din soluţia de testat este direct proporţională
cu cantitatea de substrat transformat.

4. MATERIALE Şl REACTIVI NECESARI în TEHNICA ELISA

Tehnicile ELISA, indiferent de tipul folosit, necesită în general acelaşi


set de materiale şi reactivi, exceptând evident soluţiile de testat şi anticorpii,
respectiv antigenele, complementare care definesc fiecare protocol în parte.
Lista de materiale şi reactivi necesari pentru executarea unei analize ELISA
de rutina MATERIALE:
- pipete automate de volume diferite(1 -500ul) şi vârfuri
corespunzătoare;
- pipetă multichannel şi vârfuri corespunzătoare;
- placi de microtitrare corespunzătoare modelului experimental;
- pisetă de plastic;
- spectrofotometru;
- cuve plastic pentru pipeta multichannel; REACTIVI:
- soluţie agent de developare (conjugat enzimă-anticorp/antigen);
- soluţie antigen;
- soluţie anticorpi de testat;
- TFS (tampon fosfat salin);
- apă distilată sau deionizata;
- substrat cromogen NPP(p-nitrofenil fosfat) sau
TMB(tetrametilbenzidina);
- tampon de blocare a legărilor nespecifice;
- soluţie de stopare (NaOH, H2S04)
- tampon de spălare;
- tampon de fixare a anticorpilor/antigenelor pe placă;
în cazul tehnicilor ELISA celulare(cELISA) la lista de materiale şi reactivi
se adaugă:
- soluţie de suspensie celulare;
- soluţie de conjugat enzimă-anticorp specific
- tampon de spălare, ţinut pe gheaţa;
- placi de microtitrare cu fundul rotund sau conic;

5. SURSE DE EROARE

Teoretic, orice etapă din protocolul ELISA poate reprezenta o sursa de eroare,
dar studiile au demonstrat că numai o parte din proceduri pot fi considerate
ca surse semnificative de eroare. Aceste proceduri critice sunt pipetarea
soluţiei de testat şi a substratului cromogen şi absorbanta inerentă a plăcilor
de microtitrare. Acestea sunt totuşi probleme de fineţe pe care le pot
intampina pana şi cei cu experienţa în tehnica ELISA.
Urmează o trecere în revistă a condiţiilor de indeplinit şi posibilelor surse de
eroare:
• Toţi reactivii şi plăcile de microtitrare se aduc la temperatura camerei
inainte de utilizare;
• Deşi tehnica ELISA nu impune condiţii de sterilitate, sticlăria şi
consumabilele (vârfuri, cuve, etc.) trebuiesc să fie cât mai curate şi fară urme
de detergenţi;
• Concentraţia reactivului ce urmează a fi adsorbit pe suportul solid trebuie
determinată pentru fiecare cuplu suport-proteina şi pH-ul soluţiei trebuie să
fie unul adecvat.
• Blocarea situsurilor de legare nespecifică este o etapă foarte importantă în
protocol. Tamponul de blocare asigură atât saturarea suprafeţei godeului,
prevenind astfel fixarea anticorpilor de detecţie sau a conjugatului de faza
solida, cât şi inhibarea legării anticorpilor specifici la antigenul/anticorpul de
captura.
• Aranjamentul probelor în placă poate influenţa rezultatul determinării.
Pentru un protocol de mare precizie este bine să lăsam marginile
placii(randurile A şi H) libere pentru a măsura absorbanta plăcii iar probele de
control, pozitiv şi negativ, pot fi distribuite aleatoriu în zone diferite ale plăcii
(Caciagli şi Verderio, 2003).
• Diluţia probei pozitive cercetate trebuie să corespundă unei valori a
absorbantei semnificativ pozitive.
• Enzima utilizată în conjugat trebuie să aibe o specificitate ridicată şi un
randament ridicat în transformarea substratului. Este de asemenea important
ca problele de testat să nu conţină substanţe care ar putea intefera cu
stabilitatea sau activitatea enzimei.
• Concentraţia conjugatului enzimatic trebuie să corespundă celei mai mici
valori care asigură vizualizarea complexului format.
• Pentru rezultate mai bune, probele se lucrează în duplicat sau chiar
triplicat. Media valorilor absorbantei este folosită pentru determinarea
concentraţiei probei.
• Manevrarea bruscă a plăcii sau adăugarea prea rapidă a probelor,
tamponului de spălare în placă poate duce la desprinderea moleculei de
captură de pe suportul solid.
• Dacă folosiţi spălătorul automat, asiguraţi-vă că aparatul este potrivit
pentru tipul de placă folosit şi acordaţi atenţie adâncimii la care coboară acul
de spălare în placă. Setarea neadecvată a aparatului poate duce la aspirarea
anticorpilor de captura, zgarierea fundului plăcii sau chiar la stricarea
aparatului. Este de preferat să folosiţi spălătorul automat doar în cazul
folosirii unor kituri ELISA cumpărate al căror protocol prevede folosirea unui
astfel de aparat. Plăcile pregătire în laborator pot fi mai sensibile la mecanica
spălătorului automat şi astfel rezultatul protocolului are de suferit.
• In cazul folosirii tehnicii cELISA, etapele de spălare necesită o atenţie
deosita. Plăcile vor fi mai intai centrifugate la parametrii specificaţi în
protocol şi supertanatul trebuie inlaturat cu grija pentru a nu desprinde
butonul celular. Adăugarea tamponului de spălare se va face intr-un mod
blând. La finalul unei etape de spălare, placa va fi agitată pentru
desprinderea butonulu celular şi celulele vor fi resuspendate în reactivul
aferent etapei următoare. Tamponul de spălare trebuie să fie ţinut pe gheata.
• Concentraţia soluţiei de captură va fi invers proporţională faţa de
concentraţia teoretica a soluţiei de testat pentru a prevenii legarea
conjugatului sau anticorpilor secundari la molecula de captura.

BIBLIOGRAFIE

1. Bianchi A.T.J., Moonen-Leusen H.W.M, van der Heijden P.J., Bokhout B.A.,
The use of a double antibody sandwich ELISA and monoclonal antibodies for
the assessment of porcine IgM, IgG and IgA concentrations, Veterinary
Immunology and Immunopathology, 44, 309-317, 1995
2. Caciagli P., Verderio A., Experimental layout, data analysis, and thresholds
in ELISA testing of maize for aphid-borne viruses, Journal of Virological
Methods, Volume 110, Issue 2, Pages 143-152, 30 June 2003
3. Clarck M. F., Lister R.M., Bar-Joseph M., ELISA Techniques, Methods in
enzymology, voi 118,742-766, 1986
4. Eva Engval, Enzyme immunoassay ELISA and EMIT, Methods in
enzymology, voi 70, p. 419-439, 1980
5. Heck F. C, Williams J. D., Pruett J. Interpretation of Spectrophotometric
Absorbance Values to Define Results of Enzyme-Linked Immunosorbent
Assays, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 1980, p. 398-401
6. John Wiley and Sons, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Unit
11.2 in Current Protocols in Molecular Biology Supplement 34,1996
7. Kricka L.J., Selected strategies for improving sensitivity and reliability of
immunoassays, Clinical Chemistry, 40, 3, 347-357, 1994
8. Kuby J., Goldsby R., Kindt T., Osborne B., Immunology , 5th edition, 2003
9. Le Goff C, Thiaucourt F., A competitive ELISA for the specific diagnosis of
contagious bovine pleuropneumonia (CBPP), Veterinary Microbiology, Volume
60, Issues 2-4, Pages 179-191,28 February1998
10. Lequin Rudolf M. , Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry 51, No. 12, 2005
11. Michael Steinitz, Lea Baraz, A rapid method for estimating the binding of
ligands to ELISA microwells, Journal of Immunological Methods, 238, 143-150,
2000
12. Mire-Sluis A.R., Gaines-Das R., Thorpe R. Journal of Immunological
Methods, Volume 186, Issue 2, Pages 157-160, 26 October 1995
13. Olinescu A., Dolganiuc A., Imunologia practica în clinica şi experiment,
subcapitolul: Analiza imunoenzimatica ELISA, pg. 153-157, Ed. Viaţa Medicala
Romaneasca, Bucureşti, 2001 '
14. Osuchowski M. F., Remick D. G., The repetitive use of samples to measure
multiple cytokines:The sequential ELISA, Methods 38, 304-311, 2006
15. Plebani A., Avanzinia M. A., Massaa M. and Ugazioa A.G., An avidin-biotin
ELISA for the measurement of serum and secretory IgD, Journal of
Immunological Methods, Volume 71, Issue 2, Pages 133-140, 6 July 1984
16. Qian W., Yao D., et al., Immobilization of Antibodies on Ultraflat
Polystyrene Surfaces, Clinical Chemistry 46: 1456-1463, 2000
17. Satoh A., Kojima K., Koyama T., Ogawa H., Matsumoto I., Immobilization
of Saccharides and Peptides on 96-Well Microtiter Plates Coated with Methyl
Vinyl Ether-Maleic Anhydride Copolymer, Analytical Biochemistry, Volume
260, Issue 1, Pages 96-102, 15 June 1998
18. Sittampalam S., Smith W.C., et al., Application of experimental design
techniques to optimize a competitive ELISA, Journal of Immunological
Methods, 190, 151-161, 1996
19. Voller A., Bartlett A. and Bidwell D.E., Enzyme immunoassays with special
reference to ELISA techniques, Journal of Clinical Pathology,31, 507-520,
1978
20. Wilco de Jager, Ger T. Rijkers, Solid-phase and bead-based cytokine
immunoassay: A comparison, Methods, Volume 38, Issue 4, Pages 294-303,
April 2006
21. Yuzuru Hayashi et al. , An expression of within-plate uncertainty in
sandwich ELISA, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 36, 225-
229, 2004