Sunteți pe pagina 1din 114

TEHNICI UTILIZATE IN IMUNOLOGIE

PETRU CIANGA

TEHNICI UTILIZATE IN IMUNOLOGIE

NOTIUNI INTRODUCTIVE

PETRU CIANGA

ISBN 606-520-214-2

9 786065 202146
PETRU CIANGA

TEHNICI UTILIZATE IN IMUNOLOGIE


NOTIUNI INTRODUCTIVE

Editura Pim
2008
PETRU CIANGA

TEHNICI UTILIZATE IN IMUNOLOGIE


NOTIUNI INTRODUCTIVE

Editura Pim
2008
EDITURA PIM
Soseaua Stefan cel Mare nr. 11 Iasi -700498
Tel. / fax: 0232-212740
e-mail:editurapim@pimcopy.ro
www.pimcopy.ro
EDITURĂ ACREDITATĂ CNCSIS BUCUREŞTI
66/01.05.2006

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României


CIANGA, PETRU
Tehnici utilizate în imunologie : noţiuni introductive /
Petru Cianga. - Iaşi : PIM, 2008
Bibliogr.
ISBN 978-606-520-214-6

612.017
Cuprins

Reacţia Antigen-Anticorp................................................................1
1. Legături implicate în formarea complexului antigen-anticorp.......2
2. Factori care influenţează interacţiunea dintre antigen şi anticorp..8
2.1 Caracteristici structurale...............................................................9
2.1.1 Specificitatea situsurilor de legare a antigenului.......................9
2.1.2 Reactivitatea încrucişată............................................................9
2.1.3 Accesibilitatea antigenică........................................................10
2.1.4 Structura imunoglobulinelor....................................................10
2.1.5 Valenţa antigenelor..................................................................10
2.1.6 Concentraţia de antigene şi anticorpi.......................................11
2.2 Factori fizico-chimici care afectează legarea dintre antigen şi
anticorp..............................................................................................12
2.2.1 Factori de mediu.......................................................................12
2.2.2 Concentraţia în săruri (forţa ionică).........................................12
2.2.3 Potenţialul zeta.........................................................................13

Anticorpi monoclonali....................................................................14

Reacţia de precipitare.....................................................................24
1. Precipitarea în soluţie....................................................................24
2. Precipitarea în gel..........................................................................27
2.1 Dubla imunodifuzie (Oucthterlony)............................................27
2.2 Imunodifuzia radială simplă (Mancini).......................................30
3. Imunelectroforeza.........................................................................32
3.1 Imunelectroforeza.......................................................................35
3.2 Electroforeza de imunofixare (immunofixation electrophoresis -
IFE)...................................................................................................36
3.3 Electroforeza contracurent (countercurrent electrophoresis)......37
3.4 Electroforeza în rachetă (rocket electrophoresis)........................37
3.5 Focusarea isoelectrică (isolectric focusing)................................38

Reacţia de aglutinare......................................................................40
1. Aglutinarea directă........................................................................44
2. Aglutinarea indirectă.....................................................................46
3. Aglutinarea pasivă.........................................................................47
4. Testele de inhibiţie a aglutinării....................................................48
5. Testul anti-imunoglobulinic (testul Coombs)...............................50

Teste de fază solidă - Solid phase assay.........................................52


1. RIA - Radio Immuno Assay..........................................................52
2. RIST – Radioimmunosorbent test.................................................53
3. RAST – Radioallergosorbent test.................................................54
4. ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay.........................56
4.1 ELISA indirectă..........................................................................57
4.2 ELISA sandwich.........................................................................59
4.3 ELISA competitivă.....................................................................60
4.4 ELISPOT.....................................................................................61
5. Chemiluminiscenţa........................................................................62

Imunohistochimia (Corina Cianga, Petru Cianga)..........................65


1. Noţiuni de enzimologie.................................................................67
2. Metode de colorare........................................................................70
2.1 Metoda directă.............................................................................70
2.2 Metoda indirectă în doi paşi........................................................71
2.3 Metoda indirectă în trei paşi........................................................72
3. Controale.......................................................................................73
4. Colorarea de fond (nespecifică sau background)..........................74
5. Contracolorarea.............................................................................77
6. Imunocitochimia...........................................................................77
7. Dubla/tripla coloraţie....................................................................78

Imunofluorescenţa..........................................................................80
1. Imunofluorescenţa directă............................................................82
2. Imunofluorescenţa indirectă.........................................................84

Microscopia confocală....................................................................85

Tissue FAXS....................................................................................86

Citometrie în flux (Flow cytometry)..............................................87


1. Principiu........................................................................................87
2. Sortarea particulelor......................................................................94
Aplicaţii ale citometriei în flux......................................................95
1. Imunofenotiparea.........................................................................95
2. Analiza conţinutului ADN (Ploidia ADN)...................................97
3. Investigarea unor molecule solubile............................................99
4. Medicina reproducerii.................................................................100
5. Cross-match................................................................................100
6. Biologia celulară.........................................................................101
7. Analiza proliferării celulare........................................................101
8. Analiza morţii celulare prin apoptoză.........................................104
9. Analiza citotoxicităţii celulare....................................................104
10. Microbiologie............................................................................105
11. Botanică....................................................................................106
12. Farmacologie.............................................................................106

Histocompatibilitatea în transplant............................................107
Tiparea tisulară (tiparea HLA I şi II)........................................110
1. Citometria în flux.......................................................................110
2. Microlimfocitotoxicitatea sau citotoxicitatea
dependentă de complement (CDC).................................................110
3. Metode de biologie moleculară...................................................112
3.1 Metoda SSP - sequence-specific priming.................................113
3.2 Metoda SSOP - sequence-specific oligonucleotide probing.....114
3.3 SBT – sequence-based typing...................................................116
4. Cultura limfocitară mixtă............................................................116
Cross-match (X-match)................................................................117

Evaluarea funcţionalităţii componentelor sistemului imun......120


1. Limfocitele B..............................................................................120
1.1 Teste in vivo..............................................................................120
1.2 Teste in vitro.............................................................................122
2. Limfocitele T..............................................................................122
2.1 Teste in vivo..............................................................................122
2.2 Teste in vitro.............................................................................124
3. Celulele NK (natural killer)........................................................126
4. Fagocite.......................................................................................127
5. Bazofile.......................................................................................130
6. Sistemul complement (SC).........................................................131

Modele experimentale animale....................................................134


1. Animale inbred (singenice).........................................................135
2. Animale congenice......................................................................136
3. Animale chimerice (chimeras)....................................................138
4. Şoareci SCID (severe combined immunodeficiency–
imunodeficienţa severă combinată)...............................................140
5. Şoareci nuzi.................................................................................141
6. Şoareci transgenici......................................................................143
7. Şoareci knock out (KO)..............................................................145
8. Şoareci knock-in.........................................................................146

Tehnici de biologie moleculară (manipulare a acizilor nucleici şi


producţie de proteine)
Metode de manipulare a genelor.................................................149
1. Extragerea ADN din ţesuturi şi culturi de celule........................149
2. Extragerea ARN-ului din ţesuturi sau culturi de celule..............151
3. Electroforeza ADN în gel...........................................................152
3.1 Electroforeza în gel de agaroză.................................................153
3.2 Electroforeza în gel de poliacrilamidă......................................156
3.3 Electroforeza în câmp electric pulsatil .....................................157
4. Southern blot...............................................................................157
5. Northern blot...............................................................................161

Metode de evidenţiere a secvenţelor nucleotidice în celule şi


ţesuturi...........................................................................................161
1. Hibridizarea in situ......................................................................161
2. FISH – Fluorescence in situ hybridization..................................168
3. CISH – Chromogenic in situ hybridization.................................169

Manipularea enzimatică a ADN-ului..........................................170


1. Digestia cu enzime de restricţie..................................................170
2. Utilizarea ligazelor în ingineria genetică....................................171
3. Amplificarea prin PCR................................................................172
4. RT-PCR (reverse transcription-PCR).........................................177
5. Real time PCR – PCR în timp real..............................................178
6. Secvenţierea ADN.......................................................................179

Metode de introducere a ADN-ului recombinant în bacterii şi


celule eucariote
1. Vectori.........................................................................................182
1.1 Plasmide....................................................................................182
1.2 Virusuri.....................................................................................186
Dacă în serul primitorului există anticorpi față de
moleculeprezente pe suprafața limfocitelor donatorului,
atunci aceștia se vor lega și prezența lor va putea fi
identificatăprin analiza flow-citometrică a celulelor, pe
baza fluorescenței emise de anticorpul secundar
fluorocromat.În plus, pe baza unor markeri caracteristici,
această procedură oferă avantajul de a putea identifica
simultan dacă limfocitele care fixează anticorpii
primitoruluisunt limfocite T sau B.

de 6. Biologia celulară
două Prin citometrie în flux, poate fi evaluată producția
robei
de radicali liberi ai oxigenului de către o singură celulă,
ceea ce reprezintă o manieră foarte eficientă de
investigarea funcției de fagocitoză a neutrofilului. Mai
mult decât atât, pot fi studiate nu doar celulele ci și
este
organitele celulare. Odată cu dezvoltarea de probe
pot fluorescente corespunzătoare, citometria în flux oferă
este posibilitatea investigării pH-ului intracelular, a
cu concentrației thiolului, a unor proteine.
tea
ice 7. Analiza proliferării celulare
Proliferarea reprezintă evenimentul major ce se
produce după stimularea și activarea celulelor, iar
investigareafenomenului poate aduce informații extrem
rul de importante despre funcționalitatea acestora. În
să principiu, identificarea celulelor proliferante se bazează
pe capacitatealor de a sintetiza ADN și de a încorpora la
ai nivelul acestuia analogi de nucleozide marcate, ce vor
ea puteafi vizualizate.
te Principiul folosirii CFSE este diferit, molecula nu
ui este inclusă în ADN-ul nou sintetizat de celula
i.

101
diviziune celulara
proliferantă, ci dimpotrivă, fiecare
împarte cantitatea de CFSE conținută de 0 celulă
între
cele două celule fiice.
Carboxy-fluorescein-diacetate-succinimidyl-ester
de
(CFSE - C29H19N011)constă dintr-o moleculă
fluoresceină care conține un grup funcțional de
succinimidyl ester și două grupări acetat. CFSE difuzează
liber în celulă, iar esterazele intracelulare clivează
grupările acetat, convertindu-le într-un colorant
fluorescent, care nu mai poate traversa membrana, este
reținut în celulă, nu poate fi pierdut și nici transferat
celulelor vecine și nu afectează în vreun fel funcțiile
celulare. În timpul fiecărei runde de diviziune,
intensitatea relativă a colorantului se reduce cu jumătate,
dat fiind faptul că se distribuie într-un număr de două ori
mai mare de celule, permițând identificareade generații
celulare succesive. CFSE este detectat cu ajutorul unor
filtre standard pentru fluoresceină (excitație = 492 nm,
emisie = 517 nm).
Aplicațiile utilizării CFSE includ
analiza
proliferării specifice și nespecifice a limfocitelor T.
Limfocitele sunt mai întâi incubate cu CFSE,
eveniment
ce permite moleculei să difuzeze liber în interiorul
celulei, străbătând membrana celulară. Excesul de
colorant este îndepărtat prin spălare și celulele
în
sunt stimulate să prolifereze in vitro cu ajutorulrepaus
mitogeni sau prin stimulare antigenică. La unor
perioadei de incubare, celulele sunt analizate sfârșitul
prin flow
citometrie în flux. Kitul CFSE furnizează o
simplă și sensibilă de analizare multiparametrică, metodă
permite studierea de populații celulare aflate în ce
proces de

102
proliferare și identificarea a 7-10 generații celulare
succesive (figura 9).

1 2 3 4
10 10 10 IO
FL I-CFSE

Fig. 9 Celule SKBR-3 permeabilizate cu saponină. Analiza


monoparametrică comparativă a fluorescenȚeloremise de CFSE
în zilele 1, 2, 3, 4, 7 și 8 ale culturii demonstreazăscăderea
progresivă a intensității FL2, ceea ce atestă proliferarea celulară.

Utilizarea concomitentă a iodurii de propidiu și a


unor anticorpi fluorescenți cu specificitate pentru
anumitemolecule (markeri celulari), facilitează estimarea
viabilității celulare și determinarea fenotipului acestora.
Analiza proliferării celulare cu ajutorul CFSE
furnizeazăcâteva avantaje importante față de metodele
tradiționale.Utilizarea timidinei tritiate (3H thymidine)
pentru studiile de proliferare celulară este grevată, pe de
o parte, de riscul manevrării de substanțe radioactive iar,
Pe de altă parte, de faptul că metoda nu permite
identificareapopulațiilor proliferative. Analiza capacității
Proliferative care se bazează pe încorporarea de
bromodeoxyuridină(BrdU) nu permite diferențierea între

103
diviziuni ale
o singură diviziune celulară și mai multe cu
realizată
aceleiași celule. Mai mult, detecția BrdU este
elimină
ajutorul unui anticorp, pe când utilizarea CFSE
bazată pe BrdU
această etapă suplimentară. Metoda
ceea ce
necesită permeabilizarea membranei celulare,
de propidiu, în scopul
face imposibilă utilizarea iodurii
deosebire de aceste
identificării celulelor vii. Spre
celulelor
metode, marcarea cu CFSE permite recuperarea
vii în scopul unei eventuale noi utilizări.

8. Analiza morții celulare prin apoptoză


O aplicație oarecum particulară se adresează
evidențierii procesului apoptotic. Unul dintre
evenimentele precoce ale apoptozei este reprezentat de
translocarea fosfatidil-serinei (PS), un fosfolipid
membranar, din interiorul celulei la exteriorul
membranei. Acest eveniment poate fi exploatat în
citometria de flux, datorită faptului că PS va putea fi
evidențiată prin legare de către Annexina V cuplată, la
rândul ei, cu o substanță fluorescentă. Annexina V este o
2+
proteină de aproximativ 35 kDa, Ca -dependentă, care
se leagă la fosfolipideși în special la PS, cu o afinitate
crescută. Incubarea celulelor cu complexul Annexină V-
fluorocrom și analiza lor flow-citometrică permit, pe
baza analizei fluorescenței, detecția acelor celule intrate
în apoptoză,în special a celor aflate în stadiile precoce
ale procesului.

9. Analiza citotoxicității celulare


Evidențierea capacității citotoxice a celulelor NK
sau a limfocitelor T citotoxice se poate realiza prin teste
funcționale, bazate pe evaluarea și măsurarea eliberării

104
de 5Icr din țintele ucise de efectori (vezi Teste de
evaluare a funcționalității componentelor sistemului
imun). Există și metode care utilizează citometria în flux
pentru analiza uciderii țintelor celulare de către efectori.
Una dintre ele presupune o incubare prealabilă a țintelor
celulare cu CFSE, apoi co-cultivarea celor două tipuri
celulare, efectori/ținte, în diferite rapoarte. După o
0
anumită perioadă de incubare la 37 C, în atmosferă
5%C02, mediului de cultură i se adaugă un colorant vital
fluorescent, care va pătrunde numai în celulele moarte.
Analiza flow-citometrică a amestecului de celule face
distincția, pe de o parte, între celulele efector și ținte,
pentru că acestea din urmă sunt marcate cu CFSE, și, pe
de altă parte, între țintele vii și cele moarte, pentru că
acestea din urmă au înglobat colorantul vital fluorescent.

10. Microbiologie
Chiar dacă investigarea bacteriilor (identificarea
patogenului sau sensibilitatea la antibiotice) este perfect
posibilă prin citometrieîn flux, metoda este considerată
prea scumpă pentru a fi utilizată de rutină în acest
domeniu. Studiile efectuate până în prezent aparțin
domeniului cercetării și au permis caracterizarea kineticii
bacteriene, incluzând curbe de creștere, studii de
reproducere sau studiul necesităților metabolice ale unor
microorganisme.
O direcție particulară se referă la utilizarea flow
citometriei în controlul eficienței metodelor de transfecție
genică. De exemplu, flow-citometria permite măsurarea
expresiei intracelulare a genei ce codează P-galactozidaza
bacterieiE. coli (LacZ), inserată în celule de mamifere,
prin hidroliza unui substrat numit fluorescein

105
digalactozid.În funcție și de constructul folosit, gena
poate fi utilizată ca un marker în studii de dezvoltare și
migrare,sau ca o genă reporter aflată sub controlul unor
elemente reglatoare definite.

11. Botanică
Chiar dacă imensa majoritate a aplicațiilor
citometrieiîn flux se adresează omului și animalelor,
există câteva aplicații ale acestei tehnici și în lumea
plantelor, care vizează investigarea ciclului celular sau a
cromosomilor celulelor vegetale, chiar dacă aceștia sunt
mai greu de obținut.

12. Farmacologie
Acest domeniu a devenit interesat de citometria în
flux dată fiind posibilitatea screening-ului unui număr
foarte mare de evenimente dintr-o singură probă,
într-un
timp scurt. Astfel, în anumite condiții, pot fi
investigate
și 100000 de probe pe zi. În plus, citometria
în flux oferă
avantajul unic al analizării unui număr
parametri pentru fiecare probă.
record de