Reactii imunologice utilizate in laboratorul clinic 1.

Reactii de precipitare care pot avea loc prin difuzie in gel : -simpla bidimensionala -dubla bidimensionala -combinate cu migrare in camp electric : a.imunoelectroforeza b.imunofixare c.contraimunoelectroforeza d.electroimunodifuzie -difuzie in mediu lichid : a. in inel b.imunonefelometrie 2.Reactii de aglutinare : -directa -indirecta -inhibarea aglutinarii -mediata de anticorpi anti-imunoglobuline (Coombs,Waaler-rose) 3.Reactii de neutralizare: - cu participarea complementului : -R C -determinarea imunohemolitica a C -cu reactivi marcati : -fluorocromi(imunofluorescenta) -enzime(!"#$%) -izotopi (R#%) Reactie de precipitare :difuzia in gel &ifuziile in gel pot fi grupate in ' categorii :difuzii simple ,difuzii duble si difuzii combinate cu migrare in camp electric .%ceste reactii utilizeaza geluri de agar sau agaroza in concentratie de (,)-*,+ , ,continutul mare de apa permitand moleculelor de %g si %c sa migreze liber in gel -migrarea poate fi accelerata (contraimunoelectroforeza ) sau determinate (imunoelectroforeza )de un camp electric . Imunodifuzia simpla bidimensionala sau imunodifuzia radiala simpla (IDRS) ,imaginata de .ancini ,Carbonara si /eremans ,presupune difuzia unui reactant (aflat in faza lichida) intr-un gel in care este inglobat celalalt reactant.#n aceasta tehnica unul dintre reactanti (de obicei %c) trebuie sa fie in stare pura . .arimea haloului de precipitare este direct proportionala cu concentratia antigenului ce difuzeaza ,si invers proportionala cu concentratia anticorpilor si inaltimea stratului de gel in care acestia sunt inglobati ,temperature neinfluentand decat timpul de atingere a ariei finale de precipitare.0aloarea concentratiei antigenului (proteinei) se stabileste in functie de curba etalon trasata cu ' dilutii (concentratii) ale produsului de referinta .Rezultatele se exprima in 1#2ml ,mg,, 3mol2l sau procentual.

%plicatii in laborator:determinarea imunogramei (#g4,#g .,#g %,),C',C5 executata pe imunoplaci livrate de #C.1tilitate diagnostica :imunograma -mieloame,boala Waldenstrom ,hipergamaglobulinemii policlonale ,deficite immune-C' 6in maladii autoimmune (in special in lupus eritematos diseminat),glomerulonefrita acuta poststreptococica ,hepatite cornice -determinarea alfa * antitripsinei in boli pulmonare si unele neoplasme -determinarea siderofilinei in unele tipuri de anemii. Imunodifuzie radiala dubla (IDRD) sau dubla difuzie uchterlon! consta in folosirea a placilor cu 5-7 godeuri rotunde dispuse in 8urul unui godeu central -liniile de precipitare se formeaza la distante constant pt fiecare complex %g-%c .$e utilizeaza in special pt evidentierea unor protein patologice ca :proteina C reactiva ,proteinele 9ence:ones tip ;appa si lambda ,beta < microglobulina ,alfa-fetoproteina ,produsi de degradare ai fibrinogenului. Imunoelectroforeza (I"#) asociaza electroforeza in gel cu dubla difuzie ,reactia %g-%c vizualizandu-se prin linii de precipitare corespunzatoare sistemelor %g-%c din reactie . #! furnizeaza numai informatii calitative ,ilustrand in cazul componentelor monoclonale ale #g ,clasa si eventual tipul imunoglobulinei patologice. =u este indicata pt punerea unui diagnostic, ea fiind folosita in scop didactic 6educativ. $ontraimunoelectroforeza($I"#) reprezinta o dubla difuzie in care deplassarea %g si %c este accelerata deun camp electric .#n gel de agar sau agaroza la p/ ),<-),7 ,%c se deplaseaza la catod (-) ,iar antigenele cu migrare anodica (numai unele proteine ca de ex.%g/9s,% >,produsii & si ! de degradare ai fibrinogenului ) se deplaseaza spre polul pozitiv ).%ceste deplasari se fac in ?@sens contrar ?@,iar difuzia in alte directii este impiedicata .Reactia este mai sensibila si mai rapida decat dubla difuzie (rezultatele se obtin in *+-A( minute),intrucat complexul %g-%c se realizeaza la concentratiile initiale si nu in gradient. C#! furnizeaza informatii calitative si eventual semmicantitative . Imunofi%area (I#&) cuprinde un grup de tehnici imunochimice care au in comun ! probei in gel,pe hartie ,combinata cu imobilizarea (fixarea) unui reactant de catre celalalt ,adica fie imobilizarea %g de catre un %c cunoscut ,fie invers .1rmeaza colorarea respectivelor precipitate .#n laboratorul clinic tehnica se utilizeaza pt stabilirea clasei si tipului de imunoglobulina monoclonala ,pt diagnosticul imunochimic al bolii lanturilor grele si pt diag diferential al hipergamaglobulinemiilor policlonale de cele monoclonale . 'recipitare in mediu lichid : -reactia de precipitare in inel B%g si %c se pun astfel in contact incat sa nu se amestece ,la interfata celor < reactanti aparand un inel de precipitare .Reactia se foloseste in medicina legala pt identificarea originii petelor de sange si in industria alimentara pt stabilirea provenientei unor preparate pe baza de carne. -imunonefelometria Bconsta in faptul ca,in prezenta unei cantitati fixe de %c sau %g ,complexele %g-%c formate intr-o suspensie ,modifica intensitatea si dispersia luminii direct proportional cu concentratia %g sau %c.

%vanta8ele acestor reactii constau in rapiditatea obtinerii rezultatelor ,automatizarea determinarilor ,precum si in faptul ca determinarea cantitativa a unor polimeri se poate realize fara un preparat special de referinta . &ezavanta8ele nefelometriei rezida in costul ridicat al aparaturii si imposibilitatea determinarii directe a proteinelor in probele icterice ,hemolizate ,chiloase,metoda fiind limitata si de deficiente ce pot aparea in sistemele mecanice si electronice ale instalatiei . Reactii de aglutinare %glutinarea reprezinta agregarea de particule prin anticorpi . $aracteristici : -aglutinarea are o sensibilitate mai mare decat precipitarea %g fiind o particula si nu o molecula solubila -concentratiile mari de %c pot inhiba reactia si produce fenomenul dde prozona -excesul de %g nu inhiba reactia >oate fi : -aglutinare directa (simpla (clasica ) este aglutinarea antigenellor naturale ale unor particule de catre anticorpii specifici .!x:determinarea grupelor sanguine ,aglutinerea bacteriana. -aglutinare indirecta (pasi)a) este o reactie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii ,stafilococ-proteina %, latex ,bentonita)incarcate in vitro cu %gsau cu %c -ele sunt agglutinate de catre anticorpul respective antigenul ,omolog din proba .!x .determinarea >roteinei C reactiva cu latex CR>,determinarea %g/9s cu latex /9s ,determinarea grupului streptococic cu a8utorul reactivului $treptic (streptchec;),determinarea nivelului anticorpilor specifici anti 6tetanici prin hemaglutinare. -inhibarea aglutinarii .!x:diagnosticul immunologic de sarcina prin inhibarea aglutinarii hematiilor ,decelarea mioglobinei , -aglutinarea mediate de anticorpi anti imunoglobulina:anticorpii anti-imunoglobuline aglutineaza particule incarcate (natural sau artificial) cu anticorpi .!x.decelarea R prin reactia Waaler-Rose sau "atex 6 R,decelarea anticorpilor incompleti fixati la suprafata hematiilor prin testul Coombs. Reactiile de aglutinare folosite in laborator pot fi calitative de screening (latex R,reactia Coombs,&#$),effectuate pe lama sau in placi cu godeuri ,sau cantitative (reactia WaalerRose ,Coombs-cantitativ )executate in placi cu godeuri sau in tuburi. Reactia de neutralizare #n cazul reactiilor de neutralizare ,%g este reprezentat de un imunogen cu proprietati biologice (toxina ,enzima ,virus), anticorpii specifici determinand (in vivo sau2si in vitro)blocarea acestor proprietati .!x.reactia %$"C

Reactii ce utilizeaza complementul R#$*reactia de fi%are a complementului 6se foloseste complementul (alexina) si un sDstem indicator (sDstem hemolDtic) .Complexul %g-%c fixeaza complementul iar hematiile sensibilizate adaugate ulterior raman intacte (absenta hemolizeiBreactie pozitiva ) -in lipsa complexului %g-%c specific (initial ) complementul se fixeaza pe hematiile sensibilizate (sDstem indicator)producand hemoliza (hemolizaBreactie negativa). Reactii cu reacti)i marcati Imunofluorescenta (I#)Bunul dintre reactanti (antigenul sau anticorpul de cercetat)trebuie sa constituie o parte dintr-o structura biologica ,celula sau tesut ,reactivul marcat cu fluorocrom relevand reactia %g-%c.>oate fi directa si indirecta (tehnica ?@sandEich@@,folosita pt decelarea de antigene si anticorpi in boli transmisibile , autoimmune , maligne. #munofluorescenFa este folositG frecvent pentru detectarea anticorpilor si a autoanticorpilor pentru antigenele tisulare Hi celulare (de exemplu, anticorpi antinucleari, anticorpi antimuHchi netezi, anticorpi anticelule parietale). %utoanticorpii apar In bolile autoimune. Radioimunoanaliza (RI+) utilizeaza marcarea cu radioizotopi (*<+#, *'*#, '/, *5C, '<>)>rincipiul de bazG al radioimunotestGrii este similar celui prezentat la testul !"#$%. &iferenFa esenFialG este aceea cG mar;erul utilizat la !"#$% este o enzimG, iar cel folosit In R#% este un izotop radioactiv (#*<+, >'<). Jehnica ,initiata in cadrul endocrinologiei ,este obiectiva de mare sensibilitate ,in mare parte automatizata ,dar supusa unei legislatii restrictive (datorita radioizotopilor nocivi). R#% se foloseHte pe scarG largG In chimia clinicG, endocrinologia clinicG Hi toxicologie, dar nu reprezintG un test de rutinG In microbiologia clinicG. Kn practica curentG, metodele R#% includ teste pentru hormoni steroizi (cum ar fi aldosteronul, cortizonul, progesteronul) hormoni peptidici (corticotropina, hormonul corticostimulant, vasopresina). Kn unele laboratoare se mai utilizeazL metoda R#% pentru testarea mar;erilor pentru hepatita 9 (%g /9s, %c /9s, %c /9c, %g /be, %c /9e) dar a fost, In genral, InlocuitG de tehnica !"#$%. Jestul R%$J (radioallergosorbent test) este o variantG specializatG a R#%, utilizatG pentru a mGsura cantitatea de anticorpi #g! serici care reacFioneazG cu un alergen cunoscut (antigen). +naliza imunoenzimatica (",IS+ ("I+) Reactiile imunoenzimatice se pot realize in sDstem omogen ,utilizate pt determinarea haptenelor si in sDstem heterogen (metoda !"#$%-enzime-lin;ed-imuno-sorbent-assaD). !nzimele cel mai des folosite sunt peroxidaza din hrean, fosfataza alcalina, betagalactozidaza, glucozoxidaza, ureaza si catalaza. #n functie de substratul clivat enzimatic utilizat se disting:

- EIA colorimetrice: utilizeaza substraturi cromogene, cum ar fi %9J$ (sarea diamoniu a <,<M-azino-di ('-etil-benzotiazolin-7-sulfonat) care formeaza cu /<C< sub actiunea peroxidazei culoarea verde sau p-nitrofenil fosfat care formeaza culoarea galbena sub actiunea fosfatazei alcaline. 1n spectrofotometru masoara densitatea optica a cromogenului rezultat. - EIA cu fluorescenta (FEIA): utilizeaza substraturi fluorescente, in urma reactiei enzimatice fiind generat un fluorofor, care emite lumina de o lungime de unda caracteristica in urma excitatiei sale luminoase optime. #nstrumentul utilizat (fluorometru) necesita o sursa de lumina si un tub fotomultiplicator pentru detectia emisiei fluorescente. #n proba de analizat pot exista substante care emit lumina fluorescenta care pot interfera cu sensibilitatea testului. Comparativ cu !#% colorimetrice testele fluorescente genereaza o intensitate a semnalului mai mare cu cel putin un ordin de marime. #n laborator metoda !#% este folosita pentru determinarea #g! specifice pentru diversi alergeni si a mar;erilor pentru afectiuni reumatismale. - EIA cu chemiluminiscenta (CL-EIA) utilizeaza substraturi chemiluminiscente care reactioneaza cu diferitele enzime folosite pentru marcare- reactia enzimatica chemiluminiscenta genereaza lumina. Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reprezinta o metoda sensibila deoarece fiecare molecula de enzima poate converti multe molecule de substrat servind ca amplificator al reactiei. !nzimele produc produsi colorati care precipita, astfel incat nu difuzeaza de la locul de formare. #n laborator testele !"#$% sunt automatizate (ex: determinarea de testosteron liber, *N-C/ progesteron, %c anti-"O.*, %c anticardiolipinici #g4, %c antispermatozoizi, serologie paraziti, etc.). %vanta8ele analizei imunoenzimatice :tehnica este obiectiva ,poate fi automatizata ,foloseste reactivi cu o valabilitate convenabila -este utilizata pt evidentierea anticorpilor (boli infectioase,boli autoimmune atat pt diagnosticare cat si pt monitorizare )sau a antigenelor (boli infectioas,boli neoplazice,endocrinologice ,farmacologie). Jehnica Western blot este o variantG a metodei !"#$%. Kn aceastG tehnicG, proteinele virale separate prin electroforezG In funcFie de greutatea lor molecularG sau sarcina electricG sunt transferate (blotted) pe o hPrtie de filtru (de exemplu, nitrocelulozG, nDlon). CPnd hPrtia este expusL serului unui pacient, proteinele imobilizate captureazG anticorpul viral specific Hi este vizualizat cu a8utorul unui anticorp antiuman legat enzimatic. Jehnica Western blot este utilizatG pentru a confirma rezultatele obFinute prin !"#$% la pacienFii suspectaFi cG ar fi infectaFi cu /#0, hepatite virale. Teste imunochimice cu detectie prin electrochemiluminiscenta se bazeaza pe utilizarea unui complex al ruteniu cu tripropilamina (J>%) care genereaza lumina electrochimic in legatura cu un ciclu de reactie oxido-reducator. Chemoluminiscenta(emisie de lumina) Bare la baza luminolul ,o ftalihidrazida ciclica care in mediu alcalin ,in prezenta peroxidului de hDdrogen ,reactioneaza exoterm transformandu-se in aminonaftalat dianion in stare excitata si care prin dezexcitare emite o cuanta de lumina cu lungimea de unda maxima de 5'( nm."uminolul este folosit in politia criminalistica (pt deterctarea urmelor de sange sau amprente) ,in domeniul divertismentului dar si medical. -ecesar pt reactii imunochimice

Reacti)ii imunochimici sunt produse biologice (anticorpi, antigene, complement, hematii ) ce se utilizeaza pt determinari calitative sau2si cantitative de antigene sau anticorpi .!x. seruri monospecifice antiproteina folosite in #&R$. ->ersoanele care executa tehnici imunochimice trebuie sa verifice in permanenta instructiunile de utilizare a produselor ,intrucat permanenta optimizarea a acestora se reflecta si in modificarea instructiunilor respective . -.anipularea reactivilor imunochimici trebuie facuta tinand seama de toate normele de protectie in vigoare ,intrucat pt prezervare ,ei contin substante toxice (azida de sodium,mertiolat de sodium),iar prin prelucrarea lor (absorbtii in diferite lichide biologice) sau prin natura lor(amestecuri de seruri umane) ei pot contine %g/9s.

Imunoplacile sunt utilizate pt determinari cantitative a diverselor antigene -ele sunt alcatuite din cutii de plastic transparente in interiorul carora este turnat gel .>t utilizarea lor se tine cont de urmatoarele : -=u vor fi introduse seruri hemolizate sau icterice in lucru -este gresita executarea determinarilor fara dispozitive (micropipette )care sa asigure introducerea unei cantitati de strict + 3l de proba sau ser de referinta in godeurile placilor -in cazul de terminarilor de C' serurile nu vor fi pastrate mai mult de '-5 zile de la recoltare .#n caz contrar ,chiar cu serurile pastrate la Q5R C ,valorile obtinute sunt mai mari decat cele reale ,datorita clivarii componentei C' a sistemului complement . 'roduse de referinta :serul uman de referinta ,care nu reprezinta un ser uman normal ,ci are o anumita concentratie de #g care nu se schimba de la un lot la altul ,prezentat in forma liofilizata (care se dizolva in apa distilata si se pastreaza intr-un recipient inchis etans ,la Q5R C. .ruse :care contin reactivi ,produse de control sau standarde ,diluenti, tuburi, placi, pipete . %cest mod de livrare contribuie la simplificarea executarii tehnicii ,asigurarea unui control de calitate , posibilitatea obtinerii unor rezultate compatibile intre unitati.