Analiza

radioimunologica

RIA

Metoda radioimunologica
Radioimunoanaliza se bazeaza pe reactia reversibila imunochimica
dintre antigen(Ag) si anticorp(Ac) din care rezulta un complex solubil
Ag-Ac(complex imun).Cuplarea Ag-Ac este o reactie cu o inalta
specificitate,deoarece un anumit Ac nu poate lega decat Ag fata de
care a fost sintetizat.Complexul imun este stabilizat prin forte de
distente scurte:legaturi de hidrogen,legaturi ionice,legaturi Van der
Waals.
Metoda radioimunologica este denumita o metoda prin competitie
deoarece la reactie participa:molecule de Ac,molecule de
Ag,molecule de Ag marcat cu un izotop radioactiv.
Majoritatea testelor radioimunologice actuale utilizeaza marcarea cu
125I care asigura rapiditatea procesului de conjugare si mentinerea
activitatii biologice a reactantilor. Emisia radioactiva (raze gamma
pentru 125I) poate fi masurata cu ajutorul unui scintilator gamma.
Deoarece antigenii sunt molecule organice ei se mai pot marca si cu
14 C SAU 3H care sunt emitatori de tip si care necesita deci
detectori de scintilatie speciali.

Metoda radioimunologica a luat fiinta nu ca un produs

direct ci mai mult ca o concluzie a cercetarilor,o
cercetare ce ar putea fi considerata un studiu
nerelevant.Dr.I Arthur Mirsky a pornit de la ipoteza ca
maturitatea accelerata a diabeticilor nu ar fi o cauza a
secretiei de insulina ci mai mult o degradare rapida si
anormala a insulinei secretata de glanda hepatica
.Pentru a proba aceasta ipoteza , a fost studiat
metabolismul insulinei artificiale administrata intravenos
subiectilor diabetici si non-diabetici.
S-a observat ca insulina radioactiva disparea mai incet
din plasma pacientilor ce mai primisera insulina pana
atunci ,fie ca tratament pentru diabet sau ca terapie prin
socuri pentru schizofrenie decat din plasma acelora care
nu au mai fost tratati cu insulina anterior .

S-a presupus ca rata scazuta a disparitiei insulinei se

datora interactiunii insulinei artificiale cu anticorpii ce se
dezvolta ca raspuns la administrarea exagerata de
insulina.Totusi tehnicile imunologice clasice nu erau
adecvate in detectarea anticorpilor.
Asadar s-au introdus metode radio-izotopice de o
sensibilitate ridicata in detectarea tipurilor solubile a
complecsilor de anticorpi.Sunt modelele electroforice ale
insulinei artificiale in plasma de control si a pacientilor
tratati cu insulina.In cazul pacientilor tratati cu
insulina,insulina artificiala se uneste si migreaza cu o
inter beta-gamma globulina.Utilizand o varietate de
asemenea sisteme s-a putut demonstra marea
raspandire a insulinei ce se uneste cu anticorpii in cazul
subiectilor tratati cu insulina.

Principiul metodei RIA

Principiul RIA nu se limiteaza doar la
sistemul imunitar ci poate fi extins si
pentru alte sisteme in care an locul
anticorpului specific este un anumit
reactor sau substanta de legatura.Aceata
poate fi o proteina anume din componenta
plasmei,o enzima specifica sau o
pozitionare a unui receptor al tesutului .

Sensibilitatea nemaipomenita,
specificitatea si usurinta in comparare a
RIA,mai ales acum ca instrumentele si
reactivii sunt usor de gasit,au permis
testarea biologica a unor materiale
importante,materiale ce pana acum era
imposibil sau extrem de dificil de analizat.

Alte metode derivate din principiul

metodei radioimunologice
O clasificare generala a metodelor de dozare
derivate din principul RIA este urmatoarea:
Metode prin competitie :
-procese cu atingerea echilibrului RIA
-procese fara atingerea echilibrului RIA automata
Metode fara competitie:
-procese cu atingerea echilibrului-metode
imunoradiometrice
-procese fara atingerea echilibrului-analiza prin
saturare secventiala

Exista doua tehnici RIA principale,

competitive si necompetitive, care includ
etape de spalare pentru separarea
fractiunii legate de faza solida de cea
libera de conjugat radioactiv.
Ca faza solida pot fi utilizate bile de
sefaroza sau peretele interior al unor
tuburi de plastic.

In metoda competitiva, utilizata pentru cuantificarea

unor molecule mici, cum ar fi hormoni (hormonii sunt
prea mici pentru a lega mai mult decat o molecula de Ac,
astfel incat ei nu pot fi detectati printr-un test care
necesita legarea a mai mult decat un Ac), o cantitate
cunoscuta de Ag marcat radioactiv si Ag din proba de
analizat sunt mixate si reactioneaza competitiv cu o
cantitate constanta de Ac legat de o faza solida.
Concentratia de analit este determinata cu ajutorul
unei curbe standard emisii radioactive pe minut versus
logaritmul concentratiei de analit (cu cat cantitatea de Ag
neradioactiv din proba este mai mare, cu atat
radioactivitatea legata este mai mica).
Pentru determinarea de Ac, Ac marcati radioactiv si Ac
din proba reactioneaza competitiv cu Ag fixat de faza
solida.

Metodele competitive necesita cantitati mai mici de Ac si

Ag decat metodele tip sandwich.
Testele sandwich/radioimunometrice utilizeaza o mare
cantitate de Ac (exces stoichiometric) legat de faza solida,
fiind mai sensibile decat metodele competitive. Ac legat de
faza solida captureaza Ag (analitul) din solutie; dupa
spalare conjugatul reactioneaza cu Ag legat de faza solida
si semnalul este masurat dupa indepartarea prin spalare a
conjugatului liber, semnalul generat fiind proportional cu
concentratia de analit. Aceste teste necesita Ag cu mai
mult de doua situsuri antigenice. Daca se utilizeaza doi Ac
diferiti (care recunosc situsuri antigenice diferite),
protocolul poate fi simplificat (one step sandwich), astfel
faza solida este mixata simultan cu Ag din proba si
conjugatul.
Metoda poate fi aplicata pentru detectia de Ac utilizand
Ag ca faza solida si Ag marcat radioactiv.

Avantaje:
Avantajele metodei radioimunologice sunt: deoarece
reactia decurge in doua secvente succesive si nu prin
atingerea echilibrului, o crestere mica de antigen
nemarcat va duce la o scadere mai importanta a
radioactivitatii complexului imun,aceasta duce la
cresterea sensibilitatii metodei (~5 pg/mL).
usurinta in conjugarea izotopului
detectia semnalului fara optimizare
stabilitate fata de interferente
Avantajul major consta in faptul ca metoda poate fi
aplicata si pentru sistemele in care afinitatile antigenului
marcat si nemarcat pentru anticorp sunt diferite.

Dezavantaje:
stabilitatea scurta a reactivului
necesitatea protectiei antiradioactive.

Aplicatii medicale:
Descoperirea principului RIA si al metodelor
derivate a avut o importanta deosebita
pentru medicina si biologie,deoarece ele se
bazeaza pe reactii extrem de specifice si de
aceea pot fi dozate cu precizie substante
care se gasesc in cantitati foarte mici in
organismele vii.Exemple de astfel de
substante ar fi:hormoni hipotalamohipofizari(TSH,STH,ACTH),hormoni
tiroidieni,insulina,proteine tumorale,proteine
virale,medicamente etc.

In realitate lista substantelor de interes medical care pot

fi dozate prin tehnici radioimunologice este cu mult mai
mare.Acest lucru a fost posibil datorita unei metode prin
care se pot obtine anticorpi nu numai fata de substantele
capabile sa induca un raspuns imun(proteinele), ci fata
de orice alta substanta (medicamente, hormoni
steroizi):in acest scop se leaga substantele pentru care
dorim sa obtinem anticorpi de o proteina (haptena care
va stimula un raspuns imun si apoi se separa numai acei
anticorpi care interactioneaza cu regiunea ce ontine
substanta de dozat.
Principiul acestor metode de dozare a fost extins si la
determinarea numarului de receptori ai unui tesut cu
ajutorul ligandului specific marcat,determinare utila nu
numai in cercetarea medicali ci si investigarea clinica a
activitatii unor tesuturi tumorale de exemplu.