CALITATEA MEDICAMENTULUI,

ALIMENTULUI ȘI MEDIULUI
MASTER

Tehnici imunoenzimatice
Enikő Barabás
 ELISA- principiu
• Enzyme-linked immunosorbent assay.
• Avrameas (1969) l- a folosit pentru prima dată
pentru evidențierea virusurilor plantelor.
• Reacție de culoare efectuată pe o fază solidă.
• Reactivi absorbiți pe un suport de plastic
(fundul celulei- godeu).
• Vizualizarea se obține prin anticorpi marcați
cu enzimă care acționează pe un substrat
rezultând o reacție de culoare.
Placă de microtitrare ELISA
 Avantaje
• Foarte sensibil și economic pentru testări în masă.
• A înlocuit testele de precipitare și de imunodifuziune.
• Sunt metode directe și indirecte.
• Directă: metoda sandwich
– enzima este legată de anticorp,
– foarte pecisă, sensibilă, specifică.
– ex. ½ nanograme de antigen viral se poate diagnostica.
• Indirectă: enzima este legată de o moleculă care
recunoaște IgG-ul.
– Nu este așa de specifică, reacționează și cu anticorpii
omologi.
Tehnici ELISA
 Metoda directă
• Antigenul se leagă de fundul godeului.
• Se leagă conjugatul- se adaugă substratul.
• Recția de culoare va fi citită de
spectrofotometru.
ELISA directă
 Sandwich ELISA
• Double antibody sandwich (DAS ELISA) (Clark
și Adams, 1977), metoda dublă sandwich a
anticorpilor.
• Necesar:
– plăci de microtitrare din polistirol cu 8 × 12 = 96
godeuri având volumul de 300 μl.
– Godeurile sunt căptușite cu anticorpi IgG specifici
antigenului care va fi evidențiat.
– Proba are sau nu antigenul căutat, care, dacă este
prezent, se va lega de anticorpul prezent în godeu.
 DAS
• Tehnica:
– Se aplică proba în godeu.
– Se incubează o perioadă de timp, conform protocolului de
urmat.
– Dacă proba conține antigen, acesta se leagă de antigenul
specific.
– Spălarea îndepărtează antigenul nelegat.
– Se adaugă conjugatul/ enzima legată de al doilea anticorp.
– Incubare/ spălare,
– Adăugare de substrat- incubare- stoparea reacției.
– Citire cu spectrofotometrul.
Sandwich ELISA
 ELISA
Directă cu biotină-avidină
• Sistemul biotin-avidină crește sensibilitatea reacției
• Facilitează evidențierea anticorpilor înrudiți.
• Avidina este prezentă în albușul de ou, leagă biotina
(coenzima R, vitamina H), care nu se poate absorbi din
intestin.
• Streptococcus avidinii produce o substanță similară-
streptavidina- mai des utilizată.
• În testul inițial IgG-ul se biotinează iar enzima se leagă
de streptavidină, rezultatul este mai bun decât
folosirea conjugatului obișnuit (anticorp legat de
enzimă).
• Etapele testului:
– Căptușirea celulelor cu IgG specific. Spălare.
– Adăgarea probei (antigenului).
– Adăgarea anticorpilor marcați cu biotină-
incubare. Spălare.
– Adăugarea conjugatului streptavidină- enzimă.
– Incubare- spălare- adăugarea substratului.
– Citirea cu ELISA reader la lungimea de undă
corespunzătoare.
Metoda sandwich cu biotină/avidină
ELISA sandwich cu detectare prin
chemiluminescență
 ELISA competitivă
• Principiu:
– Un proces de competiție are loc între un antigen marcat și unul
nemarcat din proba testată.
• Etapele reacției:
– Anticorpul primar nemarcat este incubat cu antigenul din probă.
– Se adaugă complexe de antigen- anticorp în celulele plăcii
căptușite deja cu același antigen.
– Anticorpii care nu se fixează se spală, deci cu cât mai mult
antigen are proba, cu atât mai puțin anticorp se va lega, de aici
rezultă denumirea de competiție.
– Anticorpul specific față de primul anticorp este conjugat cu
enzimă, este adăugat în celulă.
– Ultimul de adăugat va fi substratul.
– Enzima rămasă va elibera un semnal comogen sau fluorescent.
ELISA competitivă
 ELISA competitivă
• Cu cât concentrația de antigen este mai mare, cu atât
semnalul final este mai redus.
• Marele avantaj- se poate folosi antigen crud,
nepurificat, reacția va fi oricum specifică.
• În multe cazuri se folosesc conjugate de antigen-enzimă
în loc de conjugat enzimă-anticorp.
• Antigenul marcat concurează cu antigenul nemarcat din
probă.
• Cu cât mai mult antigen are proba, cu atât mai puțin
antigen marcat se va lega, deci semnalul final va fi cu
atât mai slab.
• De obicei NU antigenul se aplică în godeu.
 ELISA competitivă avantaje
• Specificitate crescută, folosind două feluri de
anticorpi, antigenul se va lega specific.
• Probe complexe pot fi analizate, antigenul nu
trebuie purificat în prealabil.
• Flexibil și sensibil, se pot aplica și metode
directe și indirecte.
 ELISA indirectă
• Lommel et al., 1982
• Prima etapă este legarea antigenului de
suport, urmată de adăugarea anticorpului
specific IgG.
• A 3-a etapă este adăugarea conjugatului
format din anti-anticorp IgG legat de enzimă.
Acest anticorp este produs într-un alt animal,
față de anticorpul primului animal.
• Urmează adăugarea substratului.
Indirect ELISA
 ELISA indirectă
• Indirect F(ab’)2 ELISA (Barbara și Clark, 1982)
• în prima etapă se leagă de suport doar fragmentul specific IgG F(ab’)2.
• Spălare cu soluție tampon.
• Adăugare de probă/ legare de antigen.
• Introdcerea anticorpului IgG-t complet/ se leagă de antigenul imobilizat (virus).
• IgG-ul nu trebuie marcat cu enzimă pentru că proteina A- din peretele bacteriei
Staphylococcus aureus se leagă de fragmentul constant F(c) al anticorpului IgG.
• Proteina A poate fi marcată cu enzimă, ca și moleculele IgG.
• Dacă folosim proteină A marcată cu enzimă, ea se va fixa doar de IgG complete nu
și de cele doar având fragment specific F(ab’)2.
• Ultimul pas este introducerea substratului enzimei.
• În acest caz conjugatul va fi întotdeauna proteina A și enzima, nu trebuie să
elaborăm IgG specific împotriva fiecărui virus.

Denumirea metodei indirecte se referă la faptul că enzima este legată de proteina-A și

nu direct de IgG-ul specific.
 DAS ELISA indirectă
• van Regenmortel și Burckard, 1980.
• În prima etapă căptușim placa cu anticorpi specifici IgG
antivirali. Anticorpul este produs de organismul unui
animal.
• A doua etapă este adăugarea probei, conținând
antigenul viral.
• După incubare și spălare se adaugă un anticorp specific
IgG produs într-unalt animal față de același virus.
• Urmează adăugarea conjugatului de enzimă legată de
anticorp specific IgG, produs într-un al treilea animal.
• Ultimul este substratul enzimei, care fiind descompus,
va da o reacție de culoare.
 Tehnica F(ab’)2 modificat
sau ELISA cu Proteina A
• Edwards și Cooper, 1985
• Proteina A este introdusă de 2 ori în celulă.
• Prima dată se leagă proteina A de suport.
• De aceasta se leagă anticorpul.
• Se adaugă proba cu antigenul, urmată de adăugarea
celui de-al doilea anticorp.
• După incubare se adaugă proteina A conjugată cu
enzimă- scopul este detectarea celui de-al doilea
anticorp.
• Avantaj: nu este nevoie de un al treile anticorp-
conjugatul fiind alcătuit din proteina-A și enzimă.
 Tehnica ELISA cu proteina A
• 1 µg proteina A se dizolvă într- un ml de soluție puffer/ 200 µl din soluție se
măsoară în celulă, sensibilizarea celulei cu proteina A.
• Incubare 4h la 35 °C.
• Spălare cu apă bidistilată 2x, urmată de spălarea cu soluție puffer PBS–Tween.
• Adăugare de 200–200 μl anticorpi specifici IgG diluată de 500–1000x. 4h incubare
la 35 °C.
• Spălare ca în etapa 2.
• Adăugarea probelor având antigenul viral.
• Măsurarea celui de-al doilea anticorp IgG.
• Adăugarea conjugatului Proteina A-enzimă. Enzima poate fi fosfataza alcalină.
• Incubare 4h la 35°C, spălare.
• Adăugarea substratului 4-nitrofenil-fosfat.
– Dacă enzima este peroxidaza, substratul va fi o-fenilen-diamina.
• Incubare la 35°C. Pobele pozitive se vor colora în potocaliu.
• Stoparea reacției se va realiza cu soluție de NaOH 3N.
• Citirea cu ELISA reader la lungimea de undă 405 nm.
ELISA reader
 RIA
• Radioimmuno-assay, van Regenmortel, 1982.
• Anticorpul în cursul reacției este marcat cu
izotop radioactiv.
Dezavantaj:
- aplică substanțe radioactive,
- sistemul de interpretare, numerotare
costisitor- se folosește rar.
Anticorpii monoclonali pentru aplicații
diagnostice
Anticorpii monoclonali pentru aplicații
diagnostice
• Se produc în animale sensibilizate cu antigen
• Celulele lor B sunt hibridizate cu celule de
mielom multiplu cultivate pe linii celulare.
• Hibridomul care rezultă va produce anticorpii
specifici în cantități crescute.
• Se folosesc linii celulare speciale pentru
cultivarea celulelor hibridizate, de exemplu
mediul HAT= hipoxantină-aminopterină-
timidină.
Conjugarea enzimei cu anticorp
prin gruparea –NH2
Conjugarea prin grupările –SH, -OH
 Enzime utilizate în reacţii
imunologice şi marcajul anticorpilor
 Enzime și substratul lor
• Cerințele unei enzime utile:
– puritate,
– rata conversiei crescută,
– specificitate mare față de substrat,
– stabilitate,
– resurse bogate,
– preț redus,
– să rămână active și după conjugare cu anticorp sau antigen, să se
păstreze capacitatea lor catalitică.
– Trebuie folosit substrat corespunzător cae să fie ușor de produs și
stocat.
– Cele mai des folosite enzime la metoda ELISA:
• peroxidaza, horseradish peroxidase (HRP) și
• fosfataza alcalină (AP).
 Enzime și substratul lor
• Cel mai frecvent utilizăm fosfataza alkalină
– Substratul: para-nitro-fenil-fosfat/ incolor,
– Se produce para-nitro-fenol/ galben,
– Reacția este cantitativă- cât antigen este legat,
atâta conjugat, respectiv substrat se folosesc în
test.
 Prepararea de O-fenilen-diamină OPD
• 1 capsulă OPD se dizolvă în 50 ml puffer fosfat cu acid citric.
• OPD fotosensibil și foarte cancerigen, manipularea se face
cu grijă, înfoliat în alufolie.
• 50 ml apă bidistilată se amestecă cu 1 tabletă de Hyperolt,
rezultă H2O2.
• Se amestecă 500 μl de soluție H2O2 cu 50 ml OPD. Din
amestecul rezultat se adaugă 150 microlitri în celulele plăcii
de micotitrare.

Prepararea pufferului fosfat cu acid citric:

• 5,6 g acid citric; 11,2 g Na2HPO4 se completează până la un
litru cu apă distilată (pH 5).
 Interferenţe în reacţiile
imunoenzimatice
• Interferențe externe, nelegate de proba pacientului:
– Ser lipemic, ser hemolizat,
– efectul anticoagulantului,
– Stocarea incorectă, etc.
• Interferențe interne, legate de proba pacientului:
– Prezența anticorpilor care detemină reacție încrucișată cu
anticorpii cercetați,
– factorul reumatoid, alte proteine,
– anticorpi umani antianimali prezenți în probă.
Rezultat:
– Fals pozitiv sau fals negativ calitativ, respectiv cantitativ.
 Reacţia ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbant
Assay): varianta sandwich şi varianta competitivă
 Reacţia ELISA în controlul
microbiologic
• Se poate evidenția prezența unui antigen
microbian, sau chiar antigenele mai multor
microorganisme
– într-un aliment,
– apă,
– medicament,
– microaerofloră, etc.
 Chemiluminescenţa – principiu şi
aplicaţii
• Producerea unui semnal luminos în urma unei
reacții chimice.
• Două substanțe reacționează, rezulotând
molecule cu energii crescute care își descarcă
energia prin eliberarea de fotoni.
• Nu produc căldură.
 Chemiluminescenţa – principiu şi
aplicaţii
Aplicații:
- Detectarea sângelui la fața crimei, se folosește
luminol.
- Insecte: pentru a găsi partenerul, pentru a se apăra.
- Bacteriile pot comunica prin chemoluminescență.

Moleculele producătoare de lumină se numesc

luciferine. Pentru chemoluminscență folosesc ATP ca
sursă de energie.
 Influenţa factorilor de mediu asupra
reacţiilor imunoenzimatice
• Temperatura optimă este de 37 grade Celsius.
• Prezența sărurilor minerale, soluție salină
fiziologică.
• Timpul necesar variază în fncție de test.
• Se pot desfășura în fază lichidă sau solidă.
 Lactoferina
• Rol în imunitate, în rezistența naturală a
organismului,
• are efect bactericid, fungicid.
• Prezent în cantitatea cea mai mare în colostrul
uman, urmat de laptele matern și de laptele
de vacă.
 Reacţia ELISA pentru dozarea lactoferinei, LF

• Se poate detecta o cantitate de lactoferină mai mică decât

0.125ng/mL.
• Se aplică metoda dublu sandwich.
• Sensibilitate și specificitate înaltă, nu s-au descris reacții încrucișate.
• Tehnica:
– Celulele căptușite cu anticorpi antiLF,
– Se adaugă proba
– Se incubează 1 h la 37°C; Se măsoară conjugatul format din anticorp
cuplat cu biotină, se incubează 1 h la 37°C; se spală,
– Se adaugă avidina cuplată cu peroxidază,
– Sa aplică substratul, TMB, și se incubează la temperatura 30 minute la
37°C;
– Se stopează reacția cu acid sulfuric și se citește rapid la lungimea de
undă 450 nm.
– Extincția se compară cu o curbă standardizată.
 Reacţia ELISA varianta competitivă – dozarea
hormonilor tiroidieni
• TSH- Thyroid stimulating hormone, hormon reglator al
tiroidei, produs de glanda pituitară, lobul anterior.
• T3, T4 hormoni tiroidieni, T4 este cel mai important.
• Metodele cele mai sensibile sunt cele folosind
chemiluminiscența, respectiv fluoroluminescența, prag de
detecție 0.1 mIU/L. Ele au înlocuit testele RIA, folosind Iod-
125 radioactiv, prag de detecție 1.0 mIU/L.
• Avantaj- se pot automatiza, evită reacția încrucișată cu
hormoni glicoproteinice.
• Metoda ELISA competitivă poate fi utilă în determinarea
raportului dintre hormonii tioidieni liberi, respectiv legați
de proteine din proba pacientului.
 Determinarea fragmentul N-terminal
al parathormonului, PTH
• reprezintă aminoacizii 1-34 cei mai activi din molecula
integrală de PTH având 84 de aminoacizi.
• Are efect pozitiv pe creșterea oaselor, previne și tratează
osteoporoza.
• Crește concentrația de calciu, fosfor și colagen al oaselor.
• Celulele bacteriene de E. coli pot fi modificate genetic să
producă această substanță activă.
• Evidențierea ei se poate realiza prin imunofluorescență.
•
Tehnicile imunoenzimatice în fază
omogenă
- De obicei folosesc anticorpi monoclonali
- Pot fi marcați prin diverse metode, cu
enzime, substanțe luminescente,
substanțe radioactive,
- Enzimele aplicate pot fi fosfataza
alcalină, peroxidaza, etc.
- Se folosesc etape de spălări,
- necesită separarea complecșilor legați și
nelegați.
 ELISA
• . Moleculele de marcaj (conjugare) ale
anticorpilor trebuie să posede:
• a. afinitate crescută spre substrat
• b. afinitate crescută spre antigen
• c. raport semnal/zgomot înalt
• d. toxicitate redusă
• e. afinitate crescută pentru anticorp
• Sensibilitatea analitică cea mai înaltă, și
totodată lipsa de toxicitate este caracteristică
următoarelor metode:
• a. determinări chemiluminescente
• b. determinări imunofluorescente
• c. reacții radioimunologice
• d. reacții ELISA competitive
• f. reacții ELISA necompetitive
• 9. Tehnicile imunoenzimatice în fază omogenă:
• a. necesită separarea complecșilor legați și
nelegați
• b. nu necesită separarea complecșilor legați și
nelegați
• c. obligatoriu prezintă etape de spălare
• d. folosesc deseori peroxidază sau fosfatază
• e. folosesc rar peroxidază sau fosfatază
• 8. Hormonii T3 și T4 se pot doza:
• a. cu sensibilitate mai mare prin tehnici cromatografice
• b. cu sensibilitate mai mare prin tehnici
imunoenzimatice sau cu imunomarcaj
• c. cu sensibilitate aproximativ egală prin cromatografie
lichidă de performanță înaltă și tehnici cu imunomarcaj
• d. numai în forma liberă
• e. atât în formă liberă, cât și forma fixată pe proteine
• 7. Fragmentul N-terminal al parathormonului:
• a. reprezintă aminoacizii 1-54 din molecula
integrală
• b. reprezintă aminoacizii 1-34 din molecula
integrală
• c. are acţiune mai intensă decât PTH integral
• d. este mai greu de determinat prin metode
imunologice ca PTH integral
• e. are efect catabolic pe ţesutul osos.
 FRET
• Transfer de energie între două molecule sensibile la lumină,
cromofori,
• Cromoforul donor, inițial este în stare de excitare electronică
transferă energie unui cromofor acceptor prin metodă de cuplare
neradioactivă dipol- dipol.
• Eficiența transferului este invers proporțională la puterea a 6-acu
distanța dintre donor și acceptor, astfelFRET este o metodă foate
sensibilă la detectarea micilor modificări de distanță dintre
molecule.
• Poate evidenția dacă doi fluorofori suntla o anumită distanță nul de
celălalt.
• cromoforulexcitat emite un semnal, n foton virtual absorbit
instantaneu de cromoforul acceptor.
• Metode este neradioactivă.
• poate fi înlocuită prin fosforescență.
 Tehnica FRET
• Förster (fluorescense) emission test:
• a. emisia de lumină de către o moleculă donor
• b. emisia limitată a unei molecule donor
excitate, care excită la rândul ei o moleculă
acceptor și se manifestă prin fluorescență
• c. chemiluminescență
• d. reacție de culoare
• e. specificitate limitată
Principiul FRET
 Aplicații FRET
Biologie moleculară:
– Microscopie fluorescentă,
– microscopie scanning laser confocală fluorescentă.
• Biofizică și biochimie:
- pentru cuantificarea dinamicii moleculare, ca interacțiuni
între proteine, între proteine și ADNmodificări de conformație
a proteinelor
- monitorizarea formării de complexe între molecule, unul
fiind marcat cu substanță donor iar celălalt cu un acceptor.

Eficiența FRET se poate monitoriza prin emiterea de

fluorescență de către donor sau acceptor.
• Förster resonance energy transfer (FRET)
 Fluorofori folosiți în metoda FRET
• Perechea cyan fluorescent protein (CFP) – yellow
fluorescent protein (YFP).
• Ambii sunt variante ale green fluorescent
protein (GFP).
• Labeling with organic fluorescent dyes requires
purification, chemical modification, and intracellular
injection of a host protein. GFP variants can be
attached to a host protein by genetic
engineering which can be more convenient.
Additionally, a fusion of CFP and YFP linked by
a protease cleavage sequence can be used as a
cleavage assay.