TEHNICA

IMUNOENZIMATICA

ELISA
Curs
CE ESTE TEHNICA
IMUNOENZIMATICA?
 ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent
Assay
 Tehnica imunologica de detectare a
anticorpilor circulanti si a antigenelor
 Aplicatii: diagnosticul bolilor in medicina
umana si veterinara
 Utilizata in controlul calitatii in diferite
industrii
 Cantitativa sau calitativa
 PLACA PENTRU ELISA
 6,24, 96, 384, 1536 godeuri
 Plastic pe care adera usor proteinele
 DEFINIRE TERMENI
 Faza solida - suportul fix la nivelul caruia are
loc adsorbtia primului reactant.
 placa de microtitrare cu godeuri.

 Adsorbtia adaugarea antigenului sau

anticorpului diluat intr-o solutie tampon in
godeu.
 prima etapa -de imobilizare a primului
reactant pe suprafata interioara a godeului.
 DEFINIRE TERMENI
 Spalarea-umplerea godeurilor cu solutie
tampon si golirea sa.
 Se repeta dupa fiecare etapa de
adaugare a unui reactiv pentru
indepartarea moleculelor nelegate.

 Conjugatul enzimatic enzima atasata

ireversibil la o proteina, la un anticorp.
 Reactia enzimei conjugata determina
schimbarea de culoare ce constituie
semnalul.
 DEFINIRE TERMENI
 Spalarea-umplerea godurilor cu solutie
tampon si golirea sa.
 Se repeta dupa fiecare etapa de
adaugare a unui reactiv pentru
indepartarea moleculelor nelegate.

 Conjugatul enzimatic enzima atasata

ireversibil la o proteina, la un anticorp.
 Reactia enzimei conjugata determina
schimbarea de culoare ce constituie
semnalul.
 DEFINIRE TERMENI
 Cromoforul substanta ce determina
schimbari de culoare in urma reactiei
 catalizate de catre enzima conjugata.

 Citirea in ELISA presupune masurare culorii

produse ln urma reactiei.

 Antigenul o proteina sau un carbohidrat

 introdus in organism declanseaza
producerea de anticorpi specifici.
TIPURI DE ELISA

 ELISA direct

 ELISA indirect

 ELISA sandwich

 ELISA competitiva
 PRINCIPIU ELISA
 recunoastere unui antigen de catre un
anticorp conjugat cu o enzima

 a carei reactie determina o schimbare de

culoare ce poate fi evaluata.

 Cele patru tipuri de ELISA difera prin reactantii

utilizatii si ordinea titrarii acestora
 ELISA DIRECT
 antigenul este adsorbit pe o placă de plastic,
in godeuri
 Urmeaza etapa de incubare.
 se titreaza in godeuri, antigenul diluat in
solutia tampon de ligare (coating buffer).
 Urmeaza etapa de incubare.
 Timpul si temperatura de incubare pot varia
foarte mult.
 De ex se poate incuba la 37 C timp de o ora
sau la 4 C timp de 12 ore.
ELISA DIRECT
 Etapa de spalare este necesara pentru
a elimina din godeu moleculele de
antigen libere.

 Se titreaza anticorpii conjugati cu

enzima diluati ln solutie tampon

 ce lmpiedica adsobtia lor la suprafata

suportului solid

 se incubeaza
ELISA DIRECT
 Se adauga substratul cromogen

 se lasa un timp predeterminat pentru

desfasurarea reactiei catalizate de enzima
conjugata cu anticorpii de recunoastere.

 Se opreste reactia dupa expirarea

timpului si se face citirea.
ELISA DIRECT
ELISA INDIRECT
 ELISA direct - anticorpul primar de
recunoastere a antigenului are legata
enzima de generare a semnalului,

 metoda indirecta unde se titreaza lntai

anticorpul de recunoastere si apoi anti-
anticorpul conjugat cu enzima.
ELISA INDIRECT
 Se spala godeurile pentru lndepartarea
antigenului liber.
 Se titreaza anticorpul,
 se incubeaza si apoi se spala pentru
lndepartarea anticorpilor liberi.
 Se titreaza anti-anticorpii conjuagati cu
enzima.
 Anti-anticorpii recunosc regiunea Fc
(fragment crystallizable) a anticorpilor
primari de care se leaga.
 ELISA INDIRECT
 Se incubeaza pentru a permite legarea
anti-anticorpilor de anticorpi
 se spala pentru indepartarea moleculelor
libere.
 Se adauga substratul cromofor si se initiaza
reactia.
 Conversia substratului cu generarea
semnalului de schimbare a culorii este
catalizata de enzima conjugata cu anti-
anticorpii.
 Se opreste reactia dupa un timp predefinit
si face citirea semnalului.
ELISA “SANDWICH”
 Ag trebuie sa prezinte ≥2 epitopi (identici
sau diferiti)
 Ac primar (Ac1):
 Imobilizat in faza solida in godeurile placii
 Nemarcat enzimatic
 Ac secundar (Ac2):
 Marcat enzimatic
ELISA “SANDWICH”
1. Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu
Ac1 fixat
2. Se incubeaza  complexe Ag-Ac1
3. Se spala excesul de Ag (Ag liber)
4. Se pipeteaza Ac2 (marcat enzimatic)
5. Se incubeaza  complexe Ac1-Ag-Ac2
6. Se spala excesul de Ac2 (Ac2 liber)
7. Se adauga substratul  colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ag din proba
8. Se citeste la spectrofotometru
ELISA COMPETITIVA
 Ac primar (Ac1):
 Specific pentru Ag de determinat
 Nemarcat enzimatic
 Ac secundar (Ac2):
 Specific pentru Fc al Ac1
 Marcat enzimatic
ELISA COMPETITIVA
1. Se amesteca proba (cu Ag) cu o
cantitate cunoscuta de Ac1, in solutie
2. Se pipeteaza amestecul in godeurile cu
Ag fixat
3. 2 situatii:
 Exces de Ag
 Exces de Ac1
ELISA COMPETITIVA
 Exces de Ag:
 Solutie (cu Ag) + Ac1  Ag-Ac1 + Ag libere
 Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag
fixat)  nu se formeaza complexe Ag-Ac1
fixe
 Se spala Ag-Ac1 libere si Ag libere
 Se pipeteaza Ac2 in godeuri  nu se
formeaza complexe Ag-Ac1 - Ac2 fixe
 Se spala Ac2 liber (tot Ac2, de fapt)
 Se adauga substratul  nu apare nicio
reactie  incolor
ELISA COMPETITIVA
 Exces de Ac1 :
 Solutie (cu Ag) + Ac1  Ag-Ac1 + Ac1 liberi
 Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag
fixat)  complexe Ag-Ac1 fixe
 Se spala Ag-Ac1 libere
 Se pipeteaza Ac2 in godeuri  complexe
Ag-Ac1-Ac2 fixe
 Se spala Ac2 liber
 Se adauga substratul  colorarea mediului
de reactie i.p. cantitatea de Ag din proba
 Se citeste la spectrofotometru
ELISA
AVANTAJE
 Sensibila
 Reproductibila
 Cantitati mici de reactivi (ieftina)
 Determina si Ag, si Ac
 Automata (rapida)
 Noniradianta
APLICATII
 Hormoni
 Markeri tumorali
 Droguri, medicamente
 Citokine
 Ag virale (HIV!), bacteriene, parazitare
 Ac (HIV!)
TEST HIV
 ELISA PENTRU DETERMINAREA
AFLATOXINELOR TOTALE
 determinarea cantitativa a aflatoxinelor din
 cereale
 furaje,
 arahide,
 nuci,
 condimente.
 Aflatoxinele sunt metaboliti secundari ai
fungilor din speciile
 Aspergillus flavus,
 parasiticus
 si nomius.
 Aflatoxinele apartin substantelor
cancerigene.
 Aflatoxina B1 care se intalneste
impreuna cu aflatoxina B2, G1 si
G2 are cea mai mare toxicitate.
 Se intalneste in porumb,
 alune,
 nuci,
 semintele de bumbac
 si fistic.
 Principiul testului
 Testul se bazeaza pe reactia antigen-
anticorp.
 Godeurile placii au fost captusite cu
anticorpi anti-aflatoxina.
 Se adauga standardele de aflatoxina sau
probele si conjugatul enzimatic .
 Aflatoxina libera si conjugatul enzimatic intra
in competitie pentru situsurile de legare ale
anticorpilor anti-aflatoxina captusiti
(testimunoenzimatic competititv).
 In acelasi timp,anticorpii anti-aflatoxina sunt
legati de anticorpii captusiti.
 Se adauga in godeuri amestecul substrat-
cromogen;
 conjugatul enzimatic va converti
cromogenul incolor intr-o substanta de
culoare albastra.
 Adaugarea reactivului de stopare va
determina virarea culorii de la albastru la
galben.
 Masurarea se face spectrofotometric la
450 nm (lungime de unda optionala 600
nm).
 Absorbant a este invers proportionala cu
concentratia aflatoxinei din proba.
Componenta kitului
 Placa cu 48 godeuri
 5 solutii standard aflatoxinã,1.0 ml fiecare, avand
concentratiile de :
 0 ppb (standard zero),
 1.7 ppb,
 5 ppb,
 15 ppb,
 45 ppb aflatoxina in apa/metanol;
 1 solutie anticorp anti-aflatoxina
 1 solutie conjugat
 1 solutie substrat/cromogen
 1 solutie reactiv pentru stopare ,acid sulfuric 1M.

Pregatire probe
 Probele se pastreaza la rece si trebuiesc
protejate de lumina.
 O proba reprezentativa (recoltata in conditiile
standard acceptate)se mojareaza si se
amesteca bine inainte de extractie.
 • Se cantaresc 5 g de proba macinata fin si se
introduc într-un flacon impreuna cu 25 ml de
metanol 70 %s
 • Se agita energic timp de 3 minute
 • Se filtreazã extractul prin hartie Whatman nr.1
 • Se dilueaza 1 ml de filtrat in 1 ml apa distilata
sau deionizata.
 • Se folosesc 50 µl pentru testare.
 Godeurile captusite cu anticorpi
 1. Se adaugã 50 µl solutii standard,
 2. respectiv probe în godeuri separate;
 3. Se adauga 50 µl conjugat enzimatic in
fiecare godeu.
 4.Se adauga 50 µl anticorp aflatoxina in
fiecare godeu.
 5. Se agita bine si se incubeaza 10 minute
la temperatura camerei (la intuneric).
 6.Se arunca lichidul la chiuveta printr-o
miscare energica si se bate placa cu fata
in jos, pe hartie de filtru pentru a indeparta
lichidul din godeuri.
 7. Se adauga 250 µl apa distilata in fiecare
godeu si se arunca iar lichidul.
 8. Se repeta acest pas de 2 ori.
 9.Se adauga 2 picaturi de substrat/cromogen
in fiecare godeu.
 10. Se agita bine si se incubeaza 5 minute la
temperatura camerei (la intuneric).
 11.Se adauga 2 picaturi de reactiv de stopare
in fiecare godeu.
 12. Se agita bine si se citeste absorbanta la 450
nm fata de o proba martor de aer.
 13. Citirea trebuie efectuata in decurs cel mult
de 10 de minute de la adaugarea reactivului
de stopare.