REACȚII Ag-Ac CE UTILIZEAZĂ

REACTIVI MARCAȚI

Reacţia Imunoenzimatică (ELISA)

Reacţia de imunofluorescență (IF)
Radioimunotestarea (RIA)
CE ESTE TEHNICA IMUNOENZIMATICĂ?

➢ ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent Assay;

➢ Metodă de detectare a unor molecule (proteine,
carbohidraţi, etc.) cu ajutorul complexelor
antigen-anticorp conjugate cu o enzimă;
➢ Foarte sensibilă (pg/ml);
➢ Cantitativă sau calitativă;
➢ Utilizează anticorpi monoclonali şi enzyme.
ELISA
PRINCIPIUL
➢ Antigenul (Ag) sau anticorpul (Ac) se cuplează cu enzime cu o mare
activitate (peroxidaza din hrean, fosfataza alcalină) rezultând complexe
care rețin atât activitatea imunologică cât și cea enzimatică.
➢ Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activității enzimei față de
un substrat specific.
PRODUCEREA ANTICORPILOR
MONOCLONALI

Antigen

Fuzionarea
celulelor →
HIBRIDOM Mielom

Plasmocite
producatoare de Ac Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor Clonele
Hibridoamele se separa dorite se
si se cultiva cultiva sau
se
congeleaza

Mentinerea
hibridoamelor in Anticorpii monoclonali
soareci sunt purificati
ENZIMELE

➢ Enzime = catalizatori biochimici, compuşi care măresc

viteza reacţiilor chimice ce se desfaşoară în sistemele
biologice, fară să se consume în cursul lor;
➢ Intensitatea reacţiei ~ cantitatea de enzimă;
➢ Enzime utilizate:
▪ Peroxidază;
▪ Fosfataza alcalină;
▪ Glucozoxidază;
▪ G6PH (glucoza-6-fosfat-dehidrogenază).
ENZIMELE

➢ Substraturi: substanţe cromogene, care

formează produşi de reacţie coloraţi
(cromofore);

➢ Enzimă + substrat → cromofor (reacţie de

culoara)→ citire la spectrofotometru.
PROBE BIOLOGICE

➢ Ser;
➢ Plasmă;
➢ Urină;
➢ Scaun;
➢ Lichid sinovial;
➢ LCR (lichid cefalorahidian);
➢ Lichid de lavaj bronşic.
ELISA
PLACĂ PENTRU ELISA

➢ 96 godeuri;
➢ plastic pe care aderă uşor proteinele.
TIPURI DE ELISA

➢ ELISA necompetitivă ,,sandwich”;

➢ ELISA competititivă;

➢ ELISA indirectă (dozarea Ac).

ELISA ,,SANDWICH”
➢ Ag trebuie sa prezinte ≥2 epitopi (identici sau diferiţi)
➢ Ac primar (Ac1):
• imobilizat în faza solidă în godeurile plăcii
• nemarcat enzymatic
• specific pentru unul din epitopii antigenului
➢ Ac secundar sau conjugat (Ac2):
• marcat enzimatic
• specific pentru acelasi epitop sau pentru un
epitop diferit
ELISA ,,SANDWICH”
1. Se pipetează proba (cu Ag) în godeurile cu Ac1 fixat;
2. Se incubează → complexe Ag-Ac1;
3. Se spală excesul de Ag (Ag liber);
4. Se pipetează Ac2 (marcat enzimatic);
5. Se incubează → complexe Ac1-Ag-Ac2;
6. Se spală excesul de Ac2 (Ac2 liber);
7. Se adaugă substratul cromogen → colorarea mediului
de reacţie ~ cantitatea de Ag din probă;
8. Se citeşte la spectrofotometru;
9. Măsurarea culorii – spectrophotometric - intensitatea
culorii este direct proporţională cu concentraţia
antigenului din proba pacientului.
ELISA ,,SANDWICH”
Analizatorul de determinare ELISA –
părţi componente:
➢ Agitator - realizează o omogenizare a probelor (500-
1000 rpm);

➢ Termostat - realizează o incubare a probelor (25-37°C);

➢ Spalator - realizează spălarea surplusului de anticorpi

rămaşi nelegaţi;

➢ Spectrofotometru - citirea intensităţii reacţiei de

culoare (intensitatea culorii este direct proporţională cu
concentraţia antigenului din proba pacientului).
ELISA COMPETITIVĂ
➢ Ac primar (Ac1):
• specific pentru Ag de determinat
• nemarcat enzimatic
➢ Ac secundar (Ac2):
• specific pentru Fc al Ac1
• marcat enzimatic
ELISA COMPETITIVĂ

➢ Se amestecă proba (cu Ag) cu o cantitate

cunoscută de Ac1, în soluţie;
➢ Se pipetează amestecul în godeurile cu Ag
fixat;
➢ 2 situaţii:
• exces de Ag
• exces de Ac1.
ELISA COMPETITIVĂ

➢ Exces de Ag:
➢ Soluţie (cu Ag) + Ac1 → Ag-Ac1 + Ag libere;
➢ Se pipetează amestecul în godeuri (cu Ag
fixat) → nu se formează complexe Ag-Ac1
fixe;
➢ Se spală Ag-Ac1 libere şi Ag libere;
➢ Se pipetează Ac2 în godeuri → nu se
formează complexe Ag-Ac1 - Ac2 fixe;
➢ Se spală Ac2 liber (tot Ac2, de fapt);
➢ Seadaugă substratul → nu apare nicio reacţie
→ incolor.
ELISA COMPETITIVĂ
➢ Exces de Ac1 :
➢ Soluţie (cu Ag) + Ac1 → Ag-Ac1 + Ac1 liberi;
➢ Se pipetează amestecul în godeuri (cu Ag
fixat) → complexe Ag-Ac1 fixe;
➢ Se spală Ag-Ac1 libere;
➢ Sepipetează Ac2 în godeuri → complexe Ag-
Ac1-Ac2 fixe;
➢ Se spală Ac2 liber;
➢ Se adaugă substratul → colorarea mediului
de reacţie implicit cantitatea de Ag din proba;
➢ Se citeste la spectrofotometru.
ELISA COMPETITIVĂ
ELISA INDIRECTĂ

➢ Dozarea Ac
➢ Ag fixat în godeuri, specific Ac de
determinat
➢ Ac primar (Ac1):
➢Ac de determinat
➢nemarcat enzimatic
➢ Ac secundar (Ac2):
➢specific pentru Fc al Ac1
➢marcat enzimatic
ELISA INDIRECTĂ
➢ Se pipetează proba (cu Ac1) în godeurile cu
Ag fixat;
➢ Se incubează → complexe Ag-Ac1 fixe;
➢ Se spală Ac1 liber;
➢ Se pipetează Ac2;
➢ Se incubează → complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe;
➢ Se spală Ac2 liber;
➢ Se adaugă substratul → colorarea mediului de
reacţie ~ cantitatea de Ac1 din probă;
➢ Se citeste la spectrofotometru.
ELISA INDIRECTĂ
ELISA
AVANTAJE

➢ Sensibilă;
➢ Reproductibilă;
➢ Cantitaţi mici de reactivi (ieftină);
➢ Determină si Ag, si Ac;
➢ Automată (rapidă);
➢ Noniradiantă.
APLICAŢII

➢ Markeri tumorali (alfa fetoproteina,

antigenul carcinoembrionar);
➢ Hormoni (estrogeni, progesteron, tiroglobuliă,
tirotropină, cortisol);
➢ Droguri, medicamente (morfină, amfetamin, digoxin,
fenobarbital);
➢ Citokine;
➢ Ag virale (HIV!), bacteriene, parazitare;
➢ Ac (HIV!);
TEST HIV
TEST DE SARCINĂ
IMUNOFLUORESCENȚA

FLUORESCENȚA= proprietatea de a absorbi raze de

lumină cu o anumită lungime de undă și a emite raze cu
o lungime de undă diferită.

SUBSTANȚE UTILIZATE
- fluoresceină (verde);
- phycoerythrin (roșu);
- rodamina (portocalie).
REACȚIA DE IMUNOFLUORESCENȚĂ
PRINCIPIUL
Prin cuplarea unei substanțe fluorescente cu anticorpii se
obțin anticorpi fluorescenți, care fixându-se pe antigenul
omolog, induc fluorescenţe observabile prin examinarea
la microscopul în lumina UV.
 Reacţia de imunofluorescenţă (RIF)
Fluorocromii: se leagă covalent de proteine (imunoglobuline) = conjugat → emit
fluorescenţă dacă se expun la raze UV → izotiocianatul de fluoresceină (galben-verzui),
rodamina (portocalie) → nu sunt stabili în timp.

Metoda directă
Preparatul de examinat se montează pe lamă. Se adaugă conjugatele → agenele
corespunzătoare anticorpilor marcaţi, se formează complexele imune. Prin spălare se
îndepărtează conjugatele nelegate. Preparatul se examinează la microscopul cu
fluorescenţă. Puncte fluorescente pe fond întunecat – rezultat ,,+’’.

Metoda indirectă
La preparatul montat pe lamă se adaugă anticorpi specifici nemarcaţi. Daca există
antigene corespunzatoare se formează complexele imune. Prin spălare se îndepărtează
anticorpii nelegaţi. Se adaugă anticorpi antiglobulinici marcaţi cu fluorocrom. Dacă
există în preparat complexe imune, conjugatele se vor lega de imunoglobuline.
Examinarea: la fel ca la metoda directă.
 Radioimunoanaliza - RIA
(Radioimmunoassay)
➢ Antigenele sunt marcate cu izotopi radioactivi (3H, '^3I, 4C);
➢ Pentru un Ac dat este o competiţie specifică între o cantitate
cunoscută de Ag marcat radioactiv şi Ag nemarcat (în
cantitate necunoscută);
➢ Se măsoară radioactivitatea complexului Ag-Ac astfel: fie Ac
este în prealabil fixat pe un suport insolubil, fie complexul
este precipitat cu un ser anti-globulină;
➢ Concentraţia Ag nemarcat se află comparând radioactivitatea
complexului Ag- Ac cu o curbă standard;
➢ Ȋn practică RIA este utilizată pentru dozarea hormonilor,
medicamentelor, Ag HBs.
VĂ MULȚUMESC!