RIA, RAST, RIST, ELISA

RIA (Radio Immuno Assay)

• tehnică de fază solidă bazată pe reacția Ag-Ac,
în care se folosesc izotopi radioactivi

https://www.youtube.com/watch?v=hJ8AYS5rpyU
 Izotopi

= atomi ai aceluiași
element care au un
nr diferit de neutroni
în nucleu
• același nr atomic
• nr de masă diferit
 Izotopi radioactivi

• Izotopii instabili emit particule sau energie pentru a ajunge la o formă

stabilă
• Izotopii radioactivi = izotopi care pentru a ajunge la o formă stabilă emit
radiații alfa, beta sau gama
 RIA (Radio Immuno Assay)
• tehnică de fază solidă, bazată pe reacția Ag-Ac, în care se
folosesc izotopi radioactivi (radioizotopi)
• Radioizotopii se pot lega covalent de proteine.
• Radiațiile emise pot fi măsurate folosind gamma countere.
• Cel mai folosit radioizotop este 125I (T1/2 ≈ 60 zile)
• Tehnica se bazează pe:
– legarea competitivă a Ag din ser și a Ag radiomarcat la Ac specifici fixați pe
suportul solid
– legarea competitivă a Ac din ser și a Ac radiomarcați la Ag fixate pe suportul solid

https://www.youtube.com/watch?v=hJ8AYS5rpyU
https://www.youtube.com/watch?v=hJ8AYS5rpyU
• Antigenul este incubat pe o suprafata solida (plastic) si
adsorbit la aceasta.
• Antigenele nelegate sunt indepartate prin spalare.
• Suprafata solida este tratata cu o proteina irelevanta
(blocata) pentru a preveni legarea ulterioara
nespecifica.
• Se adauga anticorpi specifici pentru Ag respectiv
• Excesul de anticorp este indepartat prin spalare.
• Anticorpul legat este identificat cu ajutorul unui ligand
radioactiv. Ligandul ar putea fi o molecula precum
proteina A a stafilococului, care se leaga la fragmentul
Fc al IgG, sau un anticorp secundar.
• Excesul de ligand este indepartat prin spalare.
• Radioactivitatea placii este masurata cu ajutorul unui
contor (gamma counter).
• Prin utilizarea unei cantitati crescande de ligand
radiomarcat se obtine o curba de titrare, cu valori
incepand de la „zgomotul de fond” (background) pana
la un maximum (platou liniar). In mod obisnuit, platoul
are valori de 20-100 de ori mai mari decat
background-ul.
• Curba de titrare poate fi utilizata pentru determinari
cantitative doar in portiunea ei liniara!
• O anumita cantitate de antigen liber (in solutie) va
lega anticorpii si ii va impiedica sa se lege la suprafata
solida. Astfel, radioactivitatea placii va fi proportional
mai mica.
• Sensibilitatea metodei este de cca 1-50 ng/ml
 Radioimmunosorbent test (RIST)

= tehnică de fază solidă bazată pe reacția Ag-Ac

prin care sunt cuantificate IgE totale din ser
folosindu-se izotopi radioactivi
• cantitatea de IgE totale se determină prin compararea
radioactivității cu cea a standardelor cunoscute de IgE
RIST
 RAST(radio-allergo-sorbent test)
= tehnică de fază solidă bazată pe reacția Ag-Ac prin care sunt determinate
IgE specifice pentru un anumit alergen, folosindu-se Ac anti-ε marcați cu
radioizotopi
 ELISA

Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay
• Cost redus
• Nr mare de probe
• Screening-ul sangelui
donatorilor pentru
evidentierea contaminarii
virale
– HIV-1 si HIV-2 (prezenta
anticorpilor anti-HIV)
– Hepatita C (prezenta Ac)
– Hepatitra B (Ac si Ag)
• Diagnosticul bolilor
autoimune:
– Artrita reumatoida (FR, Ac anti-
CCP cyclic citrulinate peptide)
– Boala celiaca (Ac anti-gliadina
deamidata)
– Vasculita (Ac ANCA anti-
citoplasma neutrofilelor)
– Lupus (Ac anti-histone, Ac anti-
ADNdc)
• Cuantificarea nivelului
hormonilor
– HCG (test pentru sarcina)
– LH (determinarea momentului
ovulatiei
– TSH, T3, T4 (evaluarea
functiei tiroidiene)
• Detectarea infectiilor
– Patogeni cu transmitere
sexuala (HIV, Treponema
pallidum, Chlamydia)
– Hepatita
• Detectia substantelor ilicite
– Cocaina, opiacee
• Industria alimentara:
– Dectectia alergenilor in
mancare si praful de casa
– Masurarea toxinelor din
mancarea contaminata
ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay

substrat
enzimă

= tehnică de fază solidă bazată pe

reacția Ag-Ac, în care se folosesc
enzime care, acționând asupra unui
substrat cromogen (incolor), vor
genera un produs colorat

• intensitatea reacției de culoare

este estimată spectrofotometric

https://www.youtube.com/watch?v=Svoipyl6IRc
 ELISA
HRP (horseradish peroxidase)

 OPD (o-phenylendiamine) galben portocaliu

 TMB (tetrametilen benzidina) albastru

 ABTS verde
2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt

Fosfatază alcalină

 PNPP (p-nitrophenyl phosphate) galben

ELISA directă

substrat
 ELISA directă
A.
• Ag atașat la suportul solid
• Ac cuplați cu enzima

B.
• Ac atașați la suportul solid
• Ag cuplat cu enzima
ELISA indirectă
 ELISA indirectă

- Se lucrează în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat

- Godeurile sunt tapetate cu antigen

http://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100
 ELISA indirectă
- Se adaugă serul pacientului care conține diverși Ac
- Ac specifici se leagă la Ag; cei nespecifici, ne-legați, sunt îndepărtați prin
spălarea godeurilor

http://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100
 ELISA indirectă
- Se adaugă Ac anti-Ac umani, legați covalent de o enzimă
- excesul de enzimă nelegată se îndepărtează prin spălare
- se adaugă un substrat colorat pentru enzimă
ELISA indirectă

- Intensitatea culorii e proportională cu cantitatea de Ac legat în placă

 Cu cât e mai mare cantitatea Ag (sau Ac) din proba
examinată, cu atât e mai intensă culoarea din godeu
 ELISA cantitativă

https://www.youtube.com/watch?v=849HN1ueUhs
ELISA sandwich
ELISA sandwich
ELISA competitivă