CURS 2

GENETICA

UMANĂ
 U.M.F IAŞI

B. STRUCTURA GENOMULUI
UMAN

 Genomul uman (GU) =

– conţinutul ADN celular sau
– ansamblul integrat al celor 25 de molecule diferite de ADN (24 în
nucleu: 22 autosomi+X+Y şi 1 în mitocondrii), = 3,2 miliarde de pb
 GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + un
genom mitocondrial (simplu şi mic, 0,5%).
U.M.F IAŞI

2. STRUCTURA GENOMULUI UMAN

GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) +

un genom mitocondrial (simplu şi mic, 0,5%).

25.000 gene
U.M.F IAŞI

2.1. GENOMUL NUCLEAR

 Enorm (3,2 miliarde pb),

 Fragmentat: (22A+X+Y) molecule de ADN + proteine
→ cromozomi
 Complex, heterogen:
• ADN nerepetitiv
• ADN moderat repetitiv
• ADN înalt repetitiv
 ADN genic (25%) + ADN extragenic (75%)
 U.M.F IAŞI
2.1. Genomul nuclear
a) ADN GENIC (25%)

 Gena = unitatea de
informaţie genetică →

codifică un produs
primar specific 25.000 gene

(proteine sau ARN)

 Structura genelor este

foarte complexă - ADN
genic:
 ADN codant = exoni
(10%)
 ADN necodant (90%) =
introni, secvenţe reglare,
gene nefuncţionale - Gene ce codifică proteine (1,5%),
(pseudogene) sau
- Gene ce codifică ARN
fragmente de gene
 U.M.F IAŞI

b) ADN EXTRAGENIC (75%)

 Secvenţe netrasncrise
(necodante);

 Funcţii puţin cunoscute:

- rol “tampon” a mutaţiilor;
- împerecherea corectă a
cromozomilor omologi în meioză şi
schimbul egal (CO) de segmente
cromozomiale → recombinare
genică – sursă de variabilitate !!!.
 Alcătuit din:
 ADN nerepetitiv = secvenţe
unice sau un nr mic de copii
(60%)
 ADN repetitiv (40%).
 U.M.F IAŞI

(1) ADN EXTRAGENIC NEREPETITIV (60%)

 SECVENŢELE UNICE sau
SECVENŢE ÎNTR-UN NR MIC
DE COPII

 DUPLICAŢII
SEGMENTALE (5% GU) – Duplicaţie genică
blocuri (~10Kb) ce
flanchează genele (pe
acelaşi cromozom) ;
genă Deleţie genică
rol în sinapsa corectă a
omologilor in meioză * . CO
 Importanţă: inegal
fiind identice - pot genera HMSN = neuropatie ereditară motorie şi
erori de împerechere a senzorială
cromozomilor omologi → HLPP = neuropatie ereditară cu
CO inegal → mutaţii: predispoziţie la pareze presionale
duplicaţii /deleţii genice →
BOLI GENOMICE
 U.M.F IAŞI

(2) ADN EXTRAGENIC REPETITIV (40%)

 ADN moderat repetitiv (~30%):

secvenţe scurte repetate de sute
de mii de ori, dispersate în genom
 (ex SINEs şi LINEs)

 ADN înalt repetitiv (~10%):

secvenţe foarte scurte, repetate în
tandem →→→, de milioane de ori;
3 tipuri:
 ADN satelit
(blocuri HCRT la centromer,
telomere, CS) = rol structural;
 ADN minisatelit
(minisateliţi hipervariabili),
dispersat în toţi cromozomii =
markeri genetici individuali =
folosiţi în “amprenta genetică”
 ADN microsatelit AMPRENTA GENETICĂ
(DNA fingerprint)
 U.M.F IAŞI

3. GENOMUL MITOCONDRIAL

 ADNmt – câteva mii de copii

per celulă = 0,5%
 Genomul mitocondrial diferă
de genomul nuclear:
• mic (16.569 pb);
• circular;
• neasociat cu proteine;
• fără ADN repetitiv;
• compact: 97%=secvenţe
codante
• 37 de gene:
• contigue,
• fără introni.
• Codul genetic mitocondrial
diferă puţin de cel nuclear
 U.M.F IAŞI

GENOMUL MITOCONDRIAL

 Genomul mitocondrial al
zigotului provine, prin ovul,
exclusiv de la mamă.
 ADNmt poate suferi mutaţii
germinale sau somatice
 Mutaţiile germinale produc o
serie de boli degenerative în
SNC, SNP, muşchi, etc,
care se transmit maternal:
• de la mamă la toţi descendenţii;
• bărbaţii bolnavi nu transmit boala
 U.M.F IAŞI

 ADNmt poate suferi mutaţii somatice, după

naştere:
 produse de radicalii liberi de O2
(generaţi în mitocondrii);
 favorizate de structura ADNmit
(absenţa histonelor; densitate mare de gene; etc)
 Mutaţiile se acumulează rapid datorită absenţei
mecanismelor de reparare
 Determină scăderea producţiei de energie → boli
degenerative, cancer şi senescenţă
 U.M.F IAŞI

1. APARATUL GENETIC AL CELULEI

(v. LP 1)

APARATUL GENETIC:
structurile celulare care conţin ADN:
nucleul + mitocondriile

(1). NUCLEUL → 99,5% ADN

ADN + proteine → (fibre) CROMATINĂ

↓↑
CROMOZOMI.
Cromatina şi cromozomii = două modalităţi diferite de
organizare morfo - funcţionlă a materialului genetic
în inetrfază şi diviziune.

(2). MITOCONDRIILE → 0.5% ADN,

origine exclusiv maternă.
 U.M.F IAŞI

2. CROMATINA (v. LP )
2.1. EUCROMATINA ŞI
HETEROCROMATINA

• CROMATINA = ADN + proteine

Caracteristici EUCROMATINA HETEROCROMATINA
•Exclusiv în nucleu! Condensare Fin dispersată Puternic condensată
(cromocentri)
• Două tipuri morfo-funcţionale Colorare Slabă Intensă
distincte: Replicare în faza Precoce Tardivă
S
- EUCROMATINA Activitate Activă Inactivă 
genetică
activă genetic
Compoziţie Predomină p.b. C - G; Predomină p.b. A - T; ADN
dispersată chimică ADN nerepetitiv; proteine repetitiv;
nehistonice proteine histonice
- HETEROCROMATINA Rol morfologic Alcătuieşte benzile Alcătuieşte benzile
R pozitive (sau G R negative (sau G pozitive)
inactivă genetic negative)

condensată
(cromocentri)
U.M.F IAŞI

EUCROMATINA ŞI HETEROCROMATINA (v. LP )

 HETEROCROMATINA:

 constitutivă – constantă în structura cromozomilor:

benzi G, benzi C (cen, Yq, p A, CS)

 facultativă – diferită în celule / organisme diferite

(hetrocromatinizarea o formă de reglaj genic)
ex., cromatina sexuală
 U.M.F IAŞI

2.2. CROMATINA SEXUALĂ (v. LP )

 CROMATINA SEXUALĂ - definiţie:

un corpuscul de HCRT, = cromocentru poziţie, mărime,
formă ≠ alţi
cu particularităţi morfologice bine definite, cromocentri
care permite identificare NR cromozomilor sexuali→
- determinarea sexului genetic (XX sau XY);
- anomaliile cromozomilor sexuali (XO, XXX, XXY).
 La femeie: cromatina X (corpusculul Barr)
Morfologie – v.LP
 La bărbat: cromatina Y (corpusculul F)
 U.M.F IAŞI

ORIGINEA CROMATINEI SEXUALE

 CROMATINA X:
rezultă prin inactivarea unui cromozom X (la femeile XX) → va forma
(prin heterocromatinizare) corpusculul Barr

Ipoteza Lyon (1961):

(1) inactivarea cromozomului X este totală; ambele sexe
→ un singur X activ.
(corect = parţială* →regiuni/gene active în ambii cromozomi X)
(2) se produce precoce (i.u) şi este definitivă;
(posibil = uneori reversibilă)
(3) are loc la întâmplare (XM sau XP) şi independent în fiecare celulă
(posibil = uneori ne întâmplătoare)
 U.M.F IAŞI
Inactivarea întâmplătoare (XM sau XP) şi
independentă
în fiecare celulă → femeile sunt un MOZAIC
celular*
Femeile
heterozigote

XN Xa
sănătoase?

a = displazie ectodermală anhidrotică

U.M.F IAŞI

Numărul c. Barr = suma cromozomilor X inactivi

(numărul cromozomilor X = nr. c. Barr + 1)

DIAGNOSTIC Femeie Bărbat

Nr. C. Barr 0 1 2 0 1 2

Sex genetic XX XY
(în stări intersex)
Anomalii de număr XO XXX XXY XXXY
cromozomi sexuali XXYY

în obs. clinice de
disgenezii gonadice
 U.M.F IAŞI

CROMATINA SEXUALĂ

 CROMATINA Y:
reprezintă heterocromatina de pe 2/3 distale braţ lung
cromozom Y
(colorată cu flurocromi – ex., quinacrină – şi vizibilă
la microscop UV ca un corpuscul fluorescent )
corpuscul F)
exclusiv la barbati
Nr. corpusculi F = nr. cromozomi Y
ex., bărbaţii XYY au 2 corpusculi F
 U.M.F IAŞI

2.3. STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A

CROMATINEI

 Analiza cromatinei la
microscopul electronic
evidenţiază un sistem
ierarhizat de
compactare a
moleculei de ADN →
fibre de cromatină,
 de dimensiuni diferite,
 alcătuite din ADN,
histone şi proteine
nehistonice.
 U.M.F IAŞI

1) Filamentul cu nucleozomi (10nm)

 Un segment de ADN (146 pb)

- se înfăşoară (1 tur şi 3/4)
- în jurul unui "miez" histonic,
cilindric (8 mol.) → un
NUCLEOZOM.
 Nucleosomii → legaţi printr-un
segment de ADN liniar (60
p.b.) → FILAMENTUL CU
NUCLEOZOMI
(~ "şirag de mărgele").
 FN - menţinut împachetat de
către histona H1, ce leagă doi
nucleozomi vecini.
 Rată de "compactare" a ADN
nativ este de circa 10:1
 U.M.F IAŞI

2) Fibra de cromatină (30nm)

 Filamentul cu nucleozomi se spiralizează în
solenoid → fibra de cromatină (FC) (30 nm)
Rată de "compactare" a filamentului cu nucleozomi
este de circa 5:1
 3)
U.M.FFibra
IAŞI pliată în bucle laterale (300
nm)
 FC (30 nm) se pliază în
bucle laterale ataşate la
un “schelet” de proteine
nonhistoince → FPBL =
300nm
 O buclă (domeniu crs) –
de ~75Kb – câteva gene =
unitate funcţională (de
transcripţie şi replicare).
 Rată de "compactare" este
de circa 10:1
 U.M.F IAŞI

4) Cromozomul metafazic (300 nm)

 În profază fibra de
cromatină se
condensează (20:1) →
cromatida (700 nm)
unui cromozom
 Cromozomii – grad
maxim de condensare
în metafaza diviziunii
 U.M.F IAŞI

STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI

sinteză

ADN  FILAMENT  F I B R A  FIBRA  CROMATIDA

CU DE PLIATĂ ← UNUI
NUCLEOSOMI CROMATINĂ ÎN BUCLE CROMOZOM

INTERFAZA DIVIZIUNE

 Fiecare cromatidă are o singură moleculă de ADN

 organizată în mai multe structuri succesive şi ierarhizate,
 compactată de ~ 10.000 ori, pentru a face posibilă:
• localizarea în nucleu
• distribuţia corectă a materialului genetic în diviziune
 U.M.F IAŞI

STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI

Sinteză

 Buclele fibrei de 300 nm se

fixează neregulat de scheletul
proteic:
 zone cu mici aglomerări =
cromomere
 zone mai laxe

 Prin condensarea cromatidei în

profază,
cromomerele se unesc şi
formează benzi intens
condensate şi colorate (benzi
G + = heterocromatină)
care alternează cu benzi mai
puţin condensate şi mai clare
(benzi R + = eucromatină).
 U.M.F IAŞI

STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI

Sinteză

 Fiecare cromozom are o

structură internă
eterogenă
caracteristică
(permite identificarea
lui
precisă)
 U.M.F IAŞI

3. CROMOZOMII UMANI

 CROMOZOMI = organite
nucleare care fixează
intens coloranţi bazici
(“chroma” + “soma”)

 Funcţii:
 Transportă + distribuie
materialul genetic în cursul
diviziunii → stabilitatea
proceselor ereditare.
 Asigură recombinarea
genetică în meioză
 U.M.F IAŞI

3.1. MORFOLOGIA CROMOZOMILOR UMANI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor: Cromatidele
Centromerul
(1) COMATIDELE Telomerele

- Crz = bicromatidian← după

replicare;
- Cromatidele surori ≡ 1 moleculă
de ADN + Pr
 U.M.F IAŞI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor

(2) CENTROMERUL

 locul de ataşare a cromatidele p

surori (prin proteina ISS)
 unic → constricţie primară
 împarte cromatidele în braţele q
“p” şi “q”
 poziţie fixă – determinată de o
secvenţă ADN repetitiv (ADN
satelit) identică la toţi
cromozomii) + ADN specific
fiecărui cromozom;
 cromozomi M, SM, A
 U.M.F IAŞI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor

(2) CENTROMERUL

 Rol esenţial pentru

SEGREGAREA
cromozomilor din
cursul diviziunii
celulare:

 La ADN cen se fixează

proteine CENP =
kinetocorii → locul de
fixare a filamentelor
fus de diviziune → ce
vor tracta cromatidele
la poli (în anafază)
M A T
 U.M.F IAŞI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor

(3) TELOMERELE = structuri

specializate, formate din ADN
repetitiv + proteine asociate, care
“acoperă” şi protejează capetele
cromozomilor.

Funcţii:
 menţinerea integrităţii structurale;
 asigurarea replicării complete;
 poziţionare cromozomilor omologi în
nucleu
 U.M.F IAŞI
S
b). Elemente caracteristice unor cromozomi

(1) SATELIŢII = mase mici de

heterocromatină ataşate pe braţele scurte
ale cromozomilor acrocentrici (exceptând
Y) = variante normale

(2) CONSTRICŢIILE SECUNDARE= blocuri de

heterocromatină situate pe 1q, 9q, 16q –
lângă centromer = variante normale
CS

(3) SITUSURILE FRAGILE = lacune necolorate

pe cromatidele unor cromozomi.
Majoritatea = variante normale; excepţie
fra Xq27 asociat cu retard mintal
= Sdr. X fragil (RMLX-1:4000 nn)

SF X X SF X Y
 U.M.F IAŞI

c). Elemente specifice fiecărui cromozom: BENZILE

 Prin diferite tratament –

se observă pe
cromozomii metafazici o
serie continuă de benzi
longitudinale,
- unele intens colorate
(benzi G)
- ce alternează cu benzi
slab colorate (benzi R)
 U.M.F IAŞI

c). Elemente specifice fiecărui cromozom: BENZILE

 Benzile reflectă
structura
internă,
heterogenă, a
cromozomilor.
 Fiecare
cromozom – are
un model
caracteristic de
benzi →
identificarea sa
precisă.
 U.M.F IAŞI

3.2. TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ

(v LP)

a). Principiile metodelor (!!!)

(1) Obţinerea de celule în diviziune:
 Culturi celulare: limfocite, fibroblaste, celule fetale (←
amniocenteză);
- 0,5 ml sânge periferic (recoltat steril, pe heparină) → mediu
cultură cu PHA (stimulează diviziunile) → 72 ore
 Ţesuturi care se divid activ: măduvă osoasă (← punvţie
medulară), trofoblast (← placentocenteză);
(2) Obţinerea de celule în metafază: blocare cu colchicină
(3) Obţinerea preparatelor: hipotonizare, fixare, etalare
pe lame, colorare, ± tehici de marcaj în benzi.
(4) Analiza preparatelor* → cariotip
 U.M.F IAŞI

EVOLUŢIA
TEHNICILOR DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ
(v LP)
(1) TEHNICI DE GENERAŢIA I
(1956)
- cromozomi uniform
coloraţi;
- identificare imprecisă*

(2) TEHNICI DE GENERAŢIA II

(1970)
- marcaj în benzi G sau R
cromozomi metafazici
(400 benzi);
- identificare precisă
GI

G II

Identificarea
precisă a
cromozomilor
 U.M.F IAŞI

TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ (v LP)

(3) TEHNICI DE
GENERAŢIA III (1977)
- Înaltă rezoluţie:
cromozomi M PM P

pro-matafazici
(550 benzi) sau
profazici
(850 benzi)
- o bandă = 3-5 Mb
 U.M.F IAŞI
TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ
(v LP)

(4) TEHNICI DE GENERAŢIA IV

(1991)
- citogenetică moleculară
- FISH metafazic t(1q;2q)

- se pot identifica f. precis

remanierile cromozomiale şi
microdeleţiile
- FISH interfazic

Trisomie 21 Del 15q

Ce este FISH ?
tehnică de analiză
cromosomică
F fluorescence
I in Hibridare fluorescentă
S situ in situ
H hybridization

Tehnică moleculară Tehnică moleculară

pentru detecţia pentru localizarea
anomaliilor secvenţelor genice
 PRINCIPIUL TEHNICII FISH

•Hibridare (formare de legături de hidrogen) între o sondă specifică

de ADN (marcată fluorescent sau imunohistochimic) şi secvenţa
complementară prezentă într-un anumit segment cromosomic

•hibridizarea se bazează pe legea complementarităţii bazelor

azotate, conform căreia în moleculele de ADN se formează
următoarele perechi:
• A-T
•C-G
 a. Proba şi ADN ţintă

b. Marcarea probei –
indirectă (stg.) şi directă
(dr.)

c. Denaturarea probei şi a
ADN-ului ţintă

d. Hibridarea între probă

şi ADN-ul ţintă

e. Fixarea fluoroforului
la haptenă (marcaj
indirect)

PRINCIPIUL TEHNICII FISH

 Microscop cu fluorescenţă

Lampă cu arc

Iluminare EPI Diafragm de excitare

Filtru de excitare

Ocular

Filtru dicroic

Obiectiv
Filtru de emisie
 TIPURI DE SONDE FISH

Sondă specifică Sondă Sonde Sondă

de locus centromerică telomerice pancromosomică

Sonde din ADN repetitiv

Exemple de sonde

Sondă centromerică
(celulă interfazică)
Exemple de sonde

Sonde telomerice
(celulă metafazică)
Exemple de sonde

Sonde specifice de locus

(preparat prometafazic)
Exemple de sonde

Sondă pancromosomică
(preparat prometafazic)
 AVANTAJELE TEHNICII FISH

 SENSIBILITATE ŞI SPECIFICITATE CRESCUTE

 TIMPUL SCURT DE OBŢINERE A REZULTATELOR DEFINITIVE;
 POSIBILITATEA ANALIZEI DE CELULE ÎN DIVIZIUNE SAU
INTERFAZĂ
 REZOLUŢIE MARE (sonde de până la 40 kb)

DEZAVANTAJELE TEHNICII FISH

 COSTUL RIDICAT AL SONDELOR ŞI REACTIVILOR;

 COSTUL RIDICAT AL APARATELOR FOLOSITE
 GRADUL ÎNALT DE TEHNICITATE
 Sindromul DiGiorge

Cromosom 22 anormal

Cromosom 22
normal