Imunologie L. P.

5
Reacţii Ag-Ac cu reactivi marcaţi. Metoda radioimuna RIA. Imunofluorescenţa directă şi
indirectă

Metoda radioimuna (RIA)

RIA (Radio Immuno Assay) este o metodă extrem de sensibilă de evidenţiere calitativă
sau cantitativă a antigenelor ca şi a anticorpilor.
Tehnica este o alternativă a reacţiei ELISA, folosind în locul conjugatului marcat
enzimatic, conjugate marcate cu radioizotopi.
Tehnica permite evidenţierea anticorpilor cu afinitate extrem de scăzută pentru antigen şi
poate fi utilizată când cantităţile de proteină sunt extrem de mici.
Determinările radioimunologice se bazează pe competiţia dintre substanţa de determinat
şi o substanţă marcată cu izotop radioactiv pentru locurile de legare ale anticorpului.
Etapele unei dozări radioimunologice sunt următoarele:
-peste o cantitate fixă de reactiv specific de legare (anticorp) se adaugă o cantitate
variabilă de substanţă de determinat (antigen) şi după o fază de preincubare se adaugă o cantitate
fixă de antigen marcat cu radioizotop aflat în exces faţă de cantitatea de anticorp.
-După incubare, în prezenţa substanţei marcate vor apare 2 compartimente principale:
- compartimentul complexelor formate de reactivul specific de fixare şi cele 2
substanţe, marcată şi nemarcată, constituind fracţiunea legată;
- compartimentul antigenelor marcate şi nemarcate libere, constituind fracţiunea liberă.
Pentru a putea determina cantitatea de substanţă nemarcată cu ajutorul substanţei
marcate, este necesară separarea celor 2 compartimente şi măsurarea radioactivităţii, în una sau
în ambele fracţiuni.
Separarea antigenului marcat liber de cel legat în complexul antigen-anticorp se bazează
pe proprietăţile fizico-chimice şi imunochimice diferite ale acestora.
Metodele de separare utilizate pot fi migrarea diferenţiată prin cromatoelectroforeză sau
electroimunodifuzia în gel de agaroză. Se mai poate folosi adsorbţia selectivă pe adsorbanţi solizi
(cărbune, silicaţi, răşini schimbătoare de ioni), imunoprecipitarea cu dublu anticorp.
Anticorpii specifici sunt fixaţi pe un suport insolubil sau sunt adsorbiţi pe material
plastic.

1
 După separarea antigenului (antigen marcat) liber de complexul antigen-anticorp, se
determină radioactivitatea uneia sau ambelor faze cu ajutorul numărătoarelor electronice. (contor
gamma)
O variantă a RIA este testul radioalergosorbent (RAST), care măsoară cantitatea de IgE
specifică faţă de un anumit alergen, prezent chiar în cantităţi mici. Ca ligant, sunt utilizaţi
anticorpii anti-imunoglobulină E umană, marcaţi cu un izotop radioactiv.

Principiu
Metoda radioimuna (RIA) foloseste pentru vizualizarea reactiilor Ag-Ac reactivi marcati
cu izotopi radioactivi.
Pentru marcarea Ag se pot utiliza izotopi 3H, 125I, 14C.
Se introduc in reactie o cantitate cunoscuta de Ag marcat radioactiv, Ag nemarcat pe
care dorim sa il dozam si Ac cunoscuti cu specificitate fata de Ag.

2
 Se va realiza o competitie pentru cuplarea cu Ac intre Ag marcat si Ag nemarcat
radioactiv.
Dupa respectarea timpilor din protocolul de lucru se masoara radioactivitatea
complexului Ag-Ac si aplicand formule de calcul corespunzatoare se poate afla cantitatea de
Ag nemarcat.

Ag marcat se amesteca cu Ac, la o concentratie care satureaza situsurile de legare ale

moleculelor de Ac.
Se masoara scaderea cantitatii de Ag marcat legat de Ac specifici in prezenta probei test,
pentru determinarea cantitatii de Ag nemarcat din proba test (insulina sau Ag HBs).
Ag marcat este o componenta a amestecului de reactie.

Proba test poate fi serul sau alte fluide care contin Ag nemarcat. Cantitatea de Ag marcat
se alege asfel incit numarul epitopilor sa depaseasca numarul situsurilor de legare ale Ac.
Aceasta garanteaza ca Ag nemarcat adaugat la amestecul de reactie intra in competitie cu
Ag marcat pentru cantitatea limitata de Ac.
Chiar o cantitate mica de Ag nemarcat adaugata la amestec va determina scaderea
cantitatii de Ag marcat. Scaderea va fi proportionala cu cantitatea de Ag nemarcat adaugat.
Pentru a determina cantitatea de Ag marcat legat, complexul Ag-Ac se precipita pentru a-
l separa de Ag liber (nelegat de Ac) si se masoara radioactivitatea precipitatului.
Cu cat concentratia Ag nemarcat este mai mare, cu atit este mai mica concentratia
complexului radioactiv Ag marcat-Ac si cu atit mai mare concentratia Ag marcat liber.
Reactia are loc in solutie si rezulta un amestec de Ag legat si liber.
Reactia are loc in doua etape:
- la o cantitate fixa de reactiv specific de legare (Ac) se aduga o cantitate fixa de Ag marcat
cu izotop radioactiv (Ag marcat), realizind o concentratie in exces fata de Ac fixati pe
suport.
- dupa o perioada de preincubare, se adauga o cantitate oarecare de Ag nemarcat existent in
proba de analizat.

3
RIA este o tehnica obiectiva, cu foarte mare sensibilitate, permite cuantificarea unor cantitati
foarte mici de Ag sau de Ac din proba: hormoni hipofizari, tiroidieni, steroizi, insulina, unele
medicamente, alfa-fetoproteina, Ag carcinoembrionar, IgE, virusuri hepatitice, HIV sau Ac
specifici corespunzatori.
Dezavantaje:
- metoda costisitoare
- utilizeaza material radioactiv
Determinarea cantitativa a Ag HBs prin RIA
Materiale:
- ser de testat
- Ac anti-HBs fixati pe un suport inert (bile de nylon)
Tehnica:
- se adauga proba de ser pozitiva pentru Ag HBs
- se incubeaza si apoi se spala
- se adauga Ac specifici anti-HBs, marcati cu iod
- Ac marcati cu I se vor combina specific cu situsurile expuse ale Ag HBs legat de Ac
131

fixati pe suport
- se masoara nivelul radioactivitatii

Dozarea IgE prin RIA

Se foloseste testul radioalergosorbent (RAST), utilizat pentru determinarea IgE la pacientii
alergici.
Alergenul (extractul de polen) se cupleaza covalent de un imunosorbent (un disc de hirtie).
Ulterior se adauga serul pacientului. Cantitatea de IgE specific fixata pe disc poate sa fie estimata
prin adaugarea IgG de iepure, marcat radioactiv, anti-IgE uman.

Determinarea Ac anti-ADN in LED

Daca serul unui pacient este adaugat in godeurile tapetate cu Ag (in acest caz, ADN), auto-Ac se
fixeaza de godeul de plastic, iar proteinele serice se indeparteaza prin spalare.

4
Ac serici legati de ADN pot fi estimati prin adugarea IgG de iepure anti-IgG uman, marcat cu
I125. Dupa spalarea reactantului in exces, nelegat, radioactivitatea tubului va estima continutul in
auto-Ac al serului analizat.

Imunofluorescenta
. Imunofluorescenţa
Imunofluorescenţa se bazează pe observarea microscopică în lumina ultravioletă a
reacţiilor antigen-anticorp, care devin vizibile atunci când anticorpii sunt marcaţi cu o substanţă
fluorescentă (fluorocrom). Celulele marcate cu anticorpi conjugaţi cu fluorocrom emit o lumină
fluorescentă când revin la starea bazală după excitaţia cu lumină ultravioletă. Cei mai utilizaţi
fluorocromi sunt: izotiocianatul de fluoresceină şi izotiocianatul de rodamină

Imunofluorescenta poate fi utilizata atit in diagnosticul microbiologic direct (pe

produsele patologice recoltate de la bolnav sau pe cultura pura), cit si in diagnosticul serologic.
Unul din reactivi (Ag, Ac sau Ac anti-Ac) este marcat fluorescent.
In 1944, A. Coons a marcat anticorpii cu molecule ce au proprietatea de fluorescenta, fara
alterarea specificitatii Ac.
Moleculele fluorescente sunt substante organice colorate care absorb radiatia excitanta cu o
lungime de unda, se excita si cind revin in starea normala pierd energia acumulata si emit lumina
la alta lungime de unda.

Moleculele excitate cu o sursa de radiatii cu lungimea de unda mica (ultraviolete) emit

radiatii cu o lungime de unda mai mare (a spectrului vizibil), emisie care inceteaza imediat dupa
oprirea radietiei excitante.
Aceasta proprietate se numeste fluorescenta.
Derivatii fluorocromilor contin grupari chimice active care reactioneaza cu gruparile
amino libere ale molecolei anticorp rezultand molecule conjugate.
Fluorocromii se cupleaza cu regiunea Fc a moleculei de Ac si nu interfera cu capacitatea
acesteia de a reactiona cu Ag specific.

5
 Molecula fluorescenta cuplata de Ac devine marker si semnaleaza situsul de legare a Ac
cu un Ag celular sau tisular.
Anticorpii marcati fluorescent pot fi detectati prin emisia luminii colorate.
Cei mai folositi coloranti fluorescenti sunt fluorosceina, rodamina B, auramina O,
acridin-oranj R sau tripaflavina.
Lumina vizibila emisa depinde de fluorocromul utilizat (de exemplu culoarea este
galbena pentru auramina O, galben-portocalie pentru combinatia de auramina O- rodamina B).

Tehnicile de imunofluorescenta pot fi de tip direct sau indirect.

Imunofluorescenta directa
Imunofluorescenţa directă constă în aplicarea conjugatului fluorescent peste preparatul
conţinând antigen. Ca etape, frotiul se acoperă cu ser cunoscut fluorocromat, iar preparatul se
lasă 30 de minute la 370C, se spală cu soluţie tampon şi apoi cu apă distilată pentru îndepărtarea
serului care conţine anticorpii fluorocromaţi necuplaţi cu antigenul. Lama se usucă apoi se
examinează la microscop. Atunci când anticorpii fluorescenţi au reacţionat cu antigenele
specifice rezultatul este un precipitat care poate fi observat ca o arie luminoasă în lumina
ultravioletă.

6
Principiu:
Ag este necunoscut si se poate afla intr-o cultura, etalat pe frotiu ca atare sau parazitind anumite
celule (de exemplu se poate utiliza o proba recoltata prin biopsie).
Produsul care urmeaza a fi analizat este incubat in prezenta Ac marcati fluorescent, cunoscuti.
Complexul Ag-Ac este fluorescent, iar Ag se evidentiaza direct.
Tehnica:
- se realizeaza frotiul din sectiuni de tesut sau produse biologice
- se acopera lama cu conjugatul care contine Ac marcati fluorescent, se incubeaza 30
min la 37ºC
- se spala cu tampon fosfat salin si apoi cu apa distilata (pentru indepartarea Ac care nu au
intrat in complexul Ag-Ac)
- se usuca si se examineaza la microscopul cu fluorescenta.
Dezavantaj: pentru fiecare Ag de cercetat trebuie preparat serul care contine Ac specifici, marcati
fluorescent; dezavantajele sunt evidente cand diferite Ag trebuie identificate intr-un numar mare
de probe.
Metoda se poate aplica pentru:
- frotiuri din produse biologice: singe, LCR, urina
- culturi bacteriene
- sectiuni tisulare (Imunohistochimie)

- Aplicatii:

7
- 1,2,identificarea Ag de Legionella pneumophila, Bordetella pertusis, Mycobacterium
tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Treponema palidum, Cryptococcus neoformans,
Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci

8
- 3. sectiuni tisulare Imunihistochimia e larg utilizata in cercetarea fundamental pentru
evidentierea distributiei si localizarii biomarkerilor si diverselor proteine exprimate pe
tesuturi
-

- Larg utilizat in diagnostsicul neoplaziilor ( evidenteirea celulelor anormale)

-

9
 Alkaline Phosphatase/ALPL in Human
Osteoblasts.

Imunofluorescenta indirecta

10
Imunofluorescenţa indirectă este utilizată în special pentru detectarea anticorpilor faţă de
antigenele tisulare sau celulare.
Reacţia presupune folosirea unui antigen cunoscut (pentru detectarea in serul de cercetat
a prezenţei anticorpilor) şi ser anti-gammaglobulină fluorocromat complementar speciei serului
de cercetat, de obicei anti-imunoglobulină umană. Ca etape, frotiul cu antigenul cunoscut se
acoperă cu ser de cercetat 30 de minute la 370C. Se spală lama cu soluţie tampon, pentru
îndepărtarea serului, în cazul necuplării acestuia cu antigenul. Lama se acoperă cu ser anti-
gammaglobulină umană timp de 30 de minute la 370C. Urmează spălarea cu soluţie tampon
pentru îndepărtarea serului fluorescent în cazul nefixării acestuia pe complexul antigen-anticorp.
În cazul în care complexul antigen-anticorp s-a format anterior, serul anti-
gammaglobulină fluorocromat găseşte suport de fixare pe gammaglobulină din serul de cercetat
şi tot complexul va apare fluorescent la examenul microscopic.
Imunofluorescenţa directă poate detecta antigene ale speciilor: Treponema pallidum, Chlamydia
trachomatis, Cryptococcus neoformans, etc.
Imunofluorescenţa indirectă detectează prezenţa prezenţa anticorpilor specifici ( diagnostic
serologic) în infecţiile produse de :Toxoplasma gondii, Helicobacter pylori, Treponema
pallidum, etc

Principiu:
Metoda presupune realizarea unui frotiu pornind de la Ag cunoscut.

11
 Sectiunile tisulare sau preparatele celulare se trateaza cu serul de cercetat, iar dupa
spalare Ac legati specific de Ag celulare se evidentiaza prin tratarea cu serul imun anti-Ig
marcata cu fluorocromi.
Rezulta un complex format din 3 elemente: Ag celular (tisular) + Ac specific + anti-
Ig conjugata.
In prima etapa are loc reactia dintre Ag si Ac specific nemarcat.
Legarea lor specifica este vizualizata prin intermediul unei Ig conjugate, care are
activitate de Ac fata de Ac specific din serul de cercetat. In aceasta reactie, Ac nemarcat are rolul
unui reactant dublu: este Ac deoarece se combina specific cu Ag, dar are si rolul de Ag in raport
cu cel de-al doilea Ac marcat (conjugat) cu fluoresceina.
Metoda indirecta este avantajoasa fata de metoda directa, deoarece necesita prepararea
unui singur conjugat: Ac anti-Ig umana sau animala, obtinuti pe iepure, se conjuga cu
fluorocromul. Este necesara insa, bateria de seruri imune specifice umane sau animale fata de
Ag agentilor infectiosi.
In scopul marcarii cu fluorocrom, Ac anti-Ig umana trebuie sa aiba un grad cit mai inalt de
puritate.
Prima etapa a purificarii Ac este separarea gamaglobulinelor serice prin metoda precipitarii
chimice.
Tehnica:
- pe sectiunile de tesut obtinute la criotom se aplica, pentru 30 minute, serul imun specific
fata de agentul infectios cautat; serul se dilueaza de 4 ori cu tampon fosfat salin;
- spalare cu tampon fosfat salin, timp de 30 minute;
- colorarea cu conjugatul anti-Ig umana sau animala
- spalare cu tampon fosfat salin 1-2 ore
- montarea si examinarea preparatului la microscopul cu fluorescenta.

Metoda IF indirecte este mai sensibila decit cea directa, dar are dezavantajul ca Ac din serul
nemarcat pot sa dea reactii nespecifice si de aceea se dilueaza.
Metoda IF este sensibila, dar nu este metoda ideala pentru a identifica structurile celulare
sau tisulare, din cauza raportului mic dintre semnal si tinta identificata.

12
 In locul Ac anti-Ig marcati cu substante fluorescente, in IF indirecta se pot folosi alte
molecule cuplate cu fluorocromi sau cu enzime: proteina A de S. aureus, care se leaga cu mare
afinitate de regiunea Fc a IgG. A treia varianta indirecta foloseste avidina conjugata cu
fluorocrom, care se leaga mcu mare afinitate de biotina cu care este marcat Ac secundar anti-
izotip.
Avantaje fata de metoda directa:
- Ac primar nu trebuie conjugat cu fluorocromul
- mareste sensibilitatea colorarii pentru ca mai multe molecule de fluorocrom se leaga prin
intermediul Ac secundar, de Ac primar, marind cantitatea de lumina emisa la situsul de
legare al Ac primar.
Aplicatii:
- diagnosticul serologic al infectiilor produse de Legionella pneumophila, Mycoplasma
pneumoniae, Leptospira spp., Borrelia burgdorferi, Helicobacter pylori, Toxoplasma
gondii, Treponema palidum, Pneumocystis jiroveci
- identificarea unor subpopulatii de limfocite T, in special CD4 si CD8
- detectarea complexelor imune in bolile autoimune
- detectarea componentelor complementului in tesuturi
- determinarea hormonilor si a altor produse de sinteza, in situ
- localizarea Ag in sectiunile de tesut sau in compartimentele subcelulare

Imunofluorescenta indirecta pentru evidentierea anticorpilor antinucleari (AAN)

Anticorpii antinucleari (AAN) sunt specifici fata de componentele nucleului celular
(nucleoproteine si acizi nucleici) si se sintetizeaza in colagenoze (lupus eritematos diseminat,
artrita reumatoida).
Prezenta AAN este de 100% in LED.
Evidentierea AAN este un indicator al diagnosticului, al evolutiei si este utila in
monitorizarea terapiei; metoda cea mai folosita este IFA indirecta cu dilutii succesive de ser.
Serul analizat se pune in contact cu un substrat celular, pentru ca AAN sa se fixeze pe
nuclei.
AAN nu au specificitate de specie si de aceea se pot folosi sectiuni de organe care au
celule cu nuclei mari (ficat de sobolan sau de soarece), pentru a usura examinarea.

13
 Se face incubarea preparatului preparatului cu ser antiglobulina umana marcat cu
izotiocianat de fluoresceina, care, in lumina UV evidentiaza reactia dintre AAN cu Ac anti-Ig
umana.
Tehnica evidentiaza Ac anti-ADN, anti-ARN, anti-componente solubile in solutie salina.

Rezultat negativ: pe un fond usor verzui, se observa mici zone intunecate, ce corespund
nucleilor necolorati.
Rezultat pozitiv: pe fondul usor verzui, apar nuclei cu fluorescenta stralucitoare. In raport
cu intensitatea fluorescentei, rezultatul se noteaza cu +, ++, +++, ++++.

Fluorescenta are diferite aspecte: poate fi omogena (difuza) si nucleul apare intens si
uniform stralucitor, asociata cu deoxiribonucleoproteine; fluorescenta inelara (periferica), cu
intensitatea maxima la periferia nucleului (in formele grave ale LED), asociata cu ADN nativ;
fluorescenta localizata la anumite arii celulare, conferita de nucleoproteine; fluorescenta
nucleolara, localizata la nivelul nucleolului (asociata ARN nucleolar).

14