IMUNOLOGIE II Reactiile de precipitare

Reactiile de precipitare se folosesc pentru a masura concentratii de Ac sau Ag. Precipitarea implica interactiunea antigenelor solubile cu anticorpii in proportie corecta, rezultatul fiind obtinerea unui precipitat vizibil. Antigenele solubile utilizate in reactiile de precipitare sunt solutii de molecule de natura proteica sau carbohidrati.Anticorpii care agrega Ag solubile se numesc precipitine, pot sa fie monoclonali sau policlonali. Cea mai simpla reactie de precipitare consta in adaugarea unei solutii de antigen intr-un volum mic de antiser, la interfata dintre cei doi reactivi se formeaza un inel. Fenomenul are la baza faptul ca anticorpii au mai mult de o valenta si ca atare se pot lega in retea la antigenele prezente. Reactiile de precipitare se pot desfasura in mediu lichid (turbidimetrie, nefelometrie) sau solid (imunodifuzie radiala, imunoelectroforeza). ehnici calitative! "ubla difuzie #uchterlon$ %lectroforeza proteica in gel Contraimunoelectroforeza &munoelectroforeza &munofi'area este cantitative! &munodifuzia radiala %lectroimunodifuzia (aurell Reactii de precipitare in solutie

)i'area Ac si Ag in forma solubila in eprubeta poate evolua in doua directii! Raman in forma solubila Formeaza precipitat

Prin adaugarea de cantitati crescande de Ag la o cantitate fi'a de Ac se construieste curba de precipitare *eidelberger care poate fi impartita in trei zone! +. ,ona de e'ces Ac - dupa centrifugare comple'e Ag-Ac raman Ac in solutie- aici se formeaza comple'e solubile Ac-Ag, raportul Ag.Ac este scazut. /. ,ona de echivalenta 0 formare eficienta comple'e Ac-Ag, nu raman in solutie Ag sau Ac, se formeaza comple'e insolubile Ag-Ac care se vad sub forma de precipitat 1. ,ona de e'ces Ag 0 Ag liber in solutie dupa centrifugare comple'e Ag-Ac- in aceasta zona se formeaza din nou incomple'e solubile de Ac-Ag si mimeaza zona de concentratie scazuta de Ag. Pentru verificarea titrului de Ag se fac dilutii ce aduc in proportie optima concentratia de Ac si Ag si permite formarea de comple'e insolubile (precipitat).

&n cadrul reactiilor de precipitare comple'ele Ag-Ac sunt rezultatul interactiunii unui Ac cu un Ag molecular, Ag difuzeaza intr-o proba cu concentratie cunoscuta de Ac si se formeaza precipitate in zona de echivalenta.

Testul inelului 0 metoda simpla de evidentiere a reactiei Ag-Ac intr-un tub, prin punerea in contact a unei solutii de Ag cu imunoserul corespunzator. (a interfata apare in cateva minute un inel sau un disc albicios ce corespunde precipitatului Ag-Ac. Reactia Heidelberger si Kendall 0 posibilitate de cuantificare a reactiei Ag-Ac prin interactiunea in mai multe tuburi de reactie a unei cantitati constante de Ac cu concentratii crescute de Ag intr-un volum dat. Apare precipitat, posibil inca din primele tuburi, creste cantitatea de precipitat in tuburile urmatoare pt ca apoi sa se reduca in conditiile e'cesului de Ag (zone Ag-Ac). Turbidimetria- 2n Ag este plasat intr-o cuva si interactioneaza cu Ac corespunzator aflat in e'ces. 3e formeaza comple'e solubile ce tulbura proba de cercetat. 3e masoara fotometric formarea de comple'e Nefelometria 0 are acelasi principiu ca si turbidimetria, ca metoda de cuantificare a rezultatului se foloseste insa o lumina laser ce va fi reflectata de comple'ele Ag-Ac si preluata. focusata de niste lentile speciale intr-un fotometru . Concentratia de Ag din proba studiata este determinate cu a4utorul unor curbe standard. 5ecesita aparatura mai complicate, este insa de folos in determinarea in medii biologice a moleculelor de imunoglobuline (&g6, &gA, &g), &g%), fractiuni de complement C+7, C1, C8, etc. Precipitarea in fa a solida
1.

Imunodifu ia radiala Mancini 0 o cantitate constanta de Ac este incorporata omogen in gel de agar inainte de solidificarea gelului si in godeuri facute in gel se plaseaza dilutii de Ag. Pe masura ce Ag difuzeaza in gel, reactioneaza cu Ac si cand se atinge punctul de echivalenta apare un inel de precipitare (vezi figura alaturata).

"iametrul inelului este proportional cu logaritmul concentratiei de Ag din moment ce concentratia de Ac este constanta. Astfel daca se lucreaza cu un Ag standard se poate genera o curba standard pe seama careia se poate masura e'act cantitatea de Ag dintr-o proba necunoscuta 0 deci acesta este un test cantitativ. "aca apare mai mult de un inel inseamna ca au aparut mai multe reactii Ag-Ac. Acest lucru se intampla cand se lucreaza cu o mi'tura de Ac si de Ag. 3e

foloseste de obicei in laboratorul clinic pt a determina nivelul de imunoglobuline in serul pacientilor. %ste de folos in determinarea &g6, &gA, &g), fractiuni de complement C1, alfa-+-antitripsina, etc.
2.

Imunodifu ia radiala dubla Ouc!terlon" 0 in cadrul acestei metode Ag este plasat intrun godeu, Ac monospecific in alt godeu, difuzeaza unul catre celalalt in gel de agar si apar arce de precipitare vizibile la locul de intalnire. Aceasta metoda calitativa permite analizarea sistemului Ag-Ac gratie reactiei de identitate.

Pot fi observate mai multe aspecte ale precipitarii! a# Reactia de identitate $ daca doua Ag sunt identice sau au epitopi asemanatori, liniile lro de precipitare cu Ac vor avea continuitate. b# Reactia de nonidentitate $ / Ag diferite ce se combina cu / Ac, arcele de precipitare se intersecteaza c# Reactia de identitate partiala $ daca cele doua Ag au un epitop comun si un epitop specific doar uneia dintre antigene, se va forma un arc de cerc continuu si va aparea atasat un brat secundar epitopului diferit.

3e foloseste pentru evidentierea proteinei C reactive, proteinelor 9ence-:ones, beta-/microglobulina, alfa-fetoproteina, produsi de degradare a fibrinogenului, rezultatele sunt e'primate semicantitativ! ;, ;;, ;;;. d# Imunoelectrofore a 0 o mi'tura comple'a de Ag este plasata in godeuri in gel de agar si prin electroforeza Ag sunt separate pe seama incarcaturii lor electrice. "upa electroforeza sunt efectuate santuri in gel si se adauga Ac. Pe masura ce Ac difuzeaza in gel, apar arce de precipitare la zona de echivalenta. Acest test este folosit pentru analiza cantitativa a mi'turilor comple'e de Ag, pentru analiza componentelor din serul pacientului. Comparand serul pacientului cu serul normal, se poate identifica deficienta uneia sau mai multor componente serice in proba de cercetat. 3e folosesc imunoseruri de origine animala specific pentru protein din serul uman. Acceasi tehnica permite analizarea proteinelor urinare sau a lichidului cefalorahidian. %ste o metoda calitativa, se poate constata aparitia sau nu a precipitarii in raport cu un martor.

e# Electrofore a contracurent %elctroimunodifu ia& 0 Ag este plasat in godeuri de agar, sunt supuse electroforezei atat Ag cat si Ac si apare linie de precipitare ca in figura de mai 4os. Acest test poate fi utilizat numai daca Ac si Ag au incarcatura electrica opusa. %ste un test calitativ desi se poate aprecia si cantitatea prin aprecierea grosimii benzii de precipitare. Avanta4ul sau ma4or este rapiditatea testului.

f# Imunoelectrofore a in rac!eta 0 electroforeza in gel ce contine anticorpi 0 Ag migreaza electroforetic catre anod prin gelul continator de Ac si apare precipitare sub forma de racheta ce poate fi vizualizata prin colorare. Aceasta metoda permite cuantificarea unui Ag prin comparatia cu o proba standard.

g# Radioimmunoassa" %RI'&(En "me Lin)ed Immunosorbent 'ssa" %ELI*'& $ R&A sunt metode bazate pe masurarea radioactivitatii generate de comple'ele Ag-Ac. )arcarea se face fie la nivelul Ag fie la Ac. estele %(&3A sunt cele bazate pe masurarea unei reactii enzimatice asociate cu formarea comple'elor Ag-Ac. # reactie pozitiva duce la aparitia unui produs colorat ce poate fi masurat spectrofotometric. 3e folosesc doua alternative de reactie! directa si indirecta. &n metoda directa, proba de cercetat este adaugata peste placa in care sunt fi'ati Ac monoclonali in faza solida, se spala dupa incubare si este inlaturat materialul nelegat. &n metoda directa un Ac secundar marcat reactioneaza cu Ag-ul legat de primul Ac. &n metoda indirecta se adauga un Ac anti-Ag de cercetat si un al treilea Ac marcat enzimatic interactioneaza cu Ac secundar (3and<ich %(&3A). (a final se adauga substratul enzimei, atat in metoda directa cat si in cazul celei indirecte. Cantitatea de produs colorat final reprezinta echivalentul cantitatii de Ag prezent in proba clinica.

RI'(ELI*' competiti+e pt depistarea 'g,

Prin utilizarea unei cantitati cunoscute de Ag standard se construiesc curbele standar de radioactivitate pe seama carora poate fi analoizata ulterior cantitatea de Ag din probele de cercetat. %tapa cheie in desfasurarea metodei o reprezinta separarea comple'elor Ag-Ac de restul componentelor. Aceasta se poate realize in mai multe feluri!

o Precipitare cu sulfat de amoniu $ precipita imunoglobulinele dar nu si Ag astfel ca metoda poate fi folosita pt separarea comple'elor immune de Ag liber - este cunoscuta sub numele de tehnica Farr o 'c anti imunoglobulina $ adaugarea unui al doilea Ac directionat impotriva primului Ac poate duce la precipitarea comple'elor immune si astfel la separarea acestora de Ag liber. o Imobili area anticorpilor $ Ac pot fi imobilizati pe suprafete de plastic si astfel comple'ele imune pot fi usor separate de alte componente prin simpla spalare. Aceasta este cea mai frecvent folosita metoda astazi si este cunoscuta ca %(&3A sau R&A in faza solida. 3e olosesc pt dozarea cantitativa a unor protein serice, hormoni, metaboliti de medicamente. RI' (ELI*' necompetiti+e pt antigene sau anticorpi $ R&A si %(&3A necompetitive sunt de asemenea folosite pt masurarea de Ag sau Ac. Ag fi'at in faza solida este folosit pentru determinarea prezentei de Ac in serul de cercetat. Cantitatea de Ac secundar marcat enzimatic sau radioactiv este concordant cu cantitatea de Ac din proba cercetata. Aceasta metoda este de obicei folosita pentru depistarea Ac de tip &g% anti-alergene cunoscute si este cunoscuta sub numele de metoda RA3 (radioallergosorbent test).

"esfasurarea testului prin fi'area Ac in faza solida permite masurarea cantitatii de Ag din serul de cercetat. Cantitatea de Ac secundar marcat enzimatic sau radioactive este proportional cu cantitatea de Ag. !# Immunoblotting -estern .lot $ separare fractiuni proteice conform greutatii lor molecular prin electroforeza in sistem sodium dodecil sulfat 0 gel poliacrilamida (3"PA6%). Proteinele sunt apoi transferate si imobilizate pe o membrane de nitroceluloza unde pot sa fie identificate prin folosirea unui Ac specific. 2nul din avanta4ele metodei este acela de a identifica un Ac specific dupa separarea proteinelor.