FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

UNIVERSITATEA “DUNĂREA DE JOS”, GALAȚI

Reacţia de precipitare în gel

Difuzia radială simplă - Mancini
Dubla imunodifuzie - Ouchterlony
REACȚIILE DE PRECIPITARE

• Reprezintă o tehnică de măsurare calitativă a concentrației de Ac sau

Ag, în proporții de echivalență.
• Prin interacțiunea Ag solubile cu Ac apare un PRECIPITAT VIZIBIL.

Antigenele solubile = soluții de molecule de

natură proteică sau carbohidrați

Anticorpii care agregă Ag solubile se numesc

PRECIPITINE.
- pot fi seruri monoclonale sau policlonale

Proportii echivalente = concentrații optime de Ac și Ag

pentru formarea unei ”matrici”, formată din legături între
1 Ag și ≥2 Ac și
respectiv între 1 Ac și ≥2 Ag
ANTICORPII
REACȚIILE DE PRECIPITARE
Excesul de Ac (efectul prozone) =
probabilitatea de 1 molecula de
anticorpi să aibă ocupată mai mult de
un situs de legare ocupat este mult
mai mică 
formarea unei rețele mari scade.
Excesul de Ag/ Ac în cantitate insuficientă
= chiar dacă Ac leagă la ambele situsuri câte
un epitop, numărul de molecule de Ag legate
este prea mic. Probabilitatea ca Ag să lege
mai mult de o moleculă de Ac este scăzută 
formarea unei rețele mari scade.
REACȚIILE DE PRECIPITARE

MEDIU LICHID
(turbidimetrie, nefelometrie)

MEDIU SOLID
(imunodifuzie radială, imunelectroforeză)
DIFUZIA în GEL

Difuziile în gel se grupează în trei categorii:

Difuzie simplă

Difuzie dublă

Difuzie combinată cu migrarea în câmp electric

U T I L I Z E A Z Ă : agar sau gel de agaroză (0,8 – 1,6 g%)

*Cu cât concentrația de apă este mai mare, cu atât vor migra mai ușor moleculele de
Ac și Ag în gel.
** Se poate adăga câmp electric pentru a accelera difuzia. (contraimunelectroforeza)
DIFUZIA în GEL

În aceste reacţii, Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză.

În zona de concentraţie optimă a acestor două reactive, se produce precipitarea
sub formă de linii albe-cenuşii.
Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte.
Poate fi utilizată în analiza calitativă a unui amestec de Ag într-o soluţie.

Difuzie simplă
 are loc difuzia unuia către celălalt reactant înglobat în faza solidă.
– Într-o zonă îngustă se creează datorită gradientului de concentrație condițiile
optime pentru imunoprecipitare.
– În gelul transparent apar linii/ zone opace = precipitare.
– Nivelul liniilor corespunde numărului minim de
sisteme Ag-Ac.

Difuzie dublă  are loc difuzia ambilor reactanți.

IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
OBIECTIVE:
1. Detectarea complexelor Ag-Ac
2. Descrierea circumstanțelor de precipitare
3. Determinarea concetrației relative a Ag.

PRINCIPII:
O cantitate constantă de Ac este încorporată omogen în gel de
agar înainte de solidificarea gelului
În godeuri făcute în gel se plasează diluții de Ag.
 Pe măsura ce Ag difuzează în gel, reacționează cu Ac și când se
atinge punctul de echivalență ,apare un inel de precipitare.
Diametrul inelului este proporțional cu concentrația de Ag din
soluție.
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
E TA P E :
• Se pune gelul care conține Ac specifici pe placă Petri.
1.

• Se realizează godeuri cu ajutorul unei matrițe pe suprafața plăcii.

2.

• Se introduc în godeurile formate una sau o serie de concentrații standard de Ag, iar în godeurile
3. râmase libere se introduc proba de control, respectiv proba pacientului – necunoscută.

• Ag difuzează radial, formând un inel de precipitare în zona de echivalență.

4.

• Se măsoară și se notează diametrul inelului de precipitare.

5.

• Este utilizată o curbă pe baza diametrelor unor concentrații standard, la care se vor raporta
6. concentrația probei de control și concentrația probei necunoscute.
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
Interpretarea rezultatelor:

1. Prezența inelului de precipitare în

jurul godeului cu Ag arată
interacțiunea specifică Ag-Ac.
2. Absența inelului de precipitare

Precipitat format
sugerează absența reacției Ag-Ac.
3. Cu cât cantitatea de Ag este mai
mare, cu atât inelul de precipitare
va fi mai aproape de godeu.
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
Aplicații
Determinarea cantității sau concetrației de Ag dintr-o probă
Estimarea claselor de Ig prezente în ser
Estimarea Ac IgG, IgM din ser, contra virusurilor gripale

Altele:
Determinarea concentrației relative de Ac în ser
Estimarea transferinei serice și AFP
Compararea proprietăților a 2 Ag
Determinarea purității relative dintr-un preparat antigenic.
Diagnosticul unor patologii
Studiu serologic
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
AVA N TA J E L E
Precipitarea în gel este considerată a oferi rezultate
mai specifice și mai senzitive, în comparație cu alte
metode disponibile.

Prin reacție se formează benzi de precipitare, care

pot fi colorate pentru o mai bună vizualizare, precum
și pentru conservare.

Dacă sunt prezenți mai mulți Ag, fiecare reacție Ag-

Ac va forma o nouă linie de precipitare.

Tehnica indică identitatea, reacțiile încrucișate și

nonidentitatea între diverși Ag.
IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLĂ
MANCINI
LIMITĂRI:

1. • Timpul de reacție crescut (18-48h)

• S-a ridicat problema că rezultatele testului Mancini

2. ar fi influențat de prezența cationilor metalici legați
în probele de testare (proteine).

3. • Este considerată mai costisitoare decât alte

metode.

• Testul a fost înlocuit cu metode mai sensibile și

4. automatizate, precum nefelometria și testele
imunosorbente enzime-linked.
DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY

OBIECTIVE:
1. Detectarea complexelor Ag-Ac
2. Descrierea circumstanțelor de precipitare.
3. Detectarea anticorpilor Ag-specifici.
4. Testarea similarității între Ag.

PRINCIPII:
O soluție de Ag sau un extract de probă este pusă într-un godeu, iar
în godeurile rămase vor fi puse seruri sau Ac purificați.
În general, central se va pune Ac.
Ag vor difuza, iar când Ac recunosc Ag, interacționează și formează
un complex imun vizibil care va precipita în gel sub forma unei linii.
În cazul în care în godeu se găsesc diferiți Ag și Ac, precipitatul se
forma între 2 godeuri care indică perechea specifică Ag-Ac.
DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY

Materiale:
- Placă de sticlă sau Petri
- Agaroză
- Dispozitiv de formare a godeurilor
- Soluție tampon
- Ser cu Ac
- Soluție de Ag
DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY

• Se toarnă în plăci de sticlă un strat de agar 2,5-3% în soluție tamponată și mertiolată 1/10.000
• Plăcile trebuie să fie perfect orizontale.
1. • Agarul va avea o grosime de 1-2 mm.

• După solidificare (~30min), se realizează godeuri cu ajutorul unei matrițe în funcție de Ag și titrul
serului
2. • Agarul din godeuri este scos cu ajutorul unor dispozitive speciale sau cu un ac de seringă.

• Se pune în godeul central serul cu Ac și în jurul acestuia se pun soluții de Ag de concentrații diferite
3.

• Se incubează la 37 C, la o umiditate corespunzătaore peste noapte.

4.

• În cazul în care există Ag corespunzătoare Ac din serurile folosite între godeurile respective la
distanțe variabile se formează linii de precipitare alb-cenușii vizibile.
5.
 DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY
R E Z U LTAT E :
Prezența precipitatului sub forma unei linii opace între godeul cu Ag și cel
cu Ac arată reacția Ag-Ac. Absența precipitatului  absența reacției Ag-Ac

*Atunci când se utilizează mai multe godeuri, apar mai multe posibilități de
rezultate, după cum urmează:
• Apare o linie de precipitare continuă, sub forma unui arc
Identitate • Arată identitatea serologică sau prezența epitopilor comuni între Ag.
completă

• Apar 2 linii complet distincte care se intersectează

• Arată 2 reacții complet separate  Ag comparați sunt diferiți și nu au epitopi comuni.
Neidentitate

• Apare ca o linie continuă, cu un pintene într-un capăt

Identitate • Daca cele doua Ag au un epitop comun si un epitop specific doar uneia dintre antigene,
parțială se va forma un arc de cerc continuu si va aparea atasat un brat secundar epitopului
diferit
DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY

Rezultatele sunt exprimate semicantitativ: +, ++, +++.

DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY

Reacție de neidentitate

Reacție de identitate parțială Reacție de indentitate completă

DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY

APLICAȚII:

Analiza Ag și Ac.
Evidențierea PCR, proteinelor Bence-Jones, β-2-microglobulina,
α-fetoproteina, produsi de degradare a fibrinogenului
Imunodifuziile în gel de agar au fost utilizate ca teste serologice în
trecut pentru identificare Ac pentru organisme atogene precum
Blastomyces.
Identificarea Ac în serodiagnosticul variolei.
Identificarea Ag fungici.
Demonstrarea toxigenității Corynebacterium diphtheriae.
VĂ MULȚUMESC PENTRU ATENȚIE!