L. P.

2

I. Reacii de precipitare

Reactia Ag-Ac de precipitare consta in unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultind complexe
Ag-Ac, care devin insolubile si stabile decit in cazul formarii unei retele tridimensionale,
conform teoriei retelei care presupune: un Ag cel putin trivalent pentru amplasarea Ac, un Ac
bivalent si conditii fizice favorabile precipitarii.

Reactia de precipitare este sensibila si specifica in evidentierea prezentei Ag (pentru
realizarea retelei Ag-Ac este necesar ca in reactie sa intre o anumita cantitate de Ag si Ac,
care sa se gaseasca intr-un anumit raport/proportie, iar Ag care participa la formarea
agregatelor sunt intr-o cantitate proportional mai mica, in raport cu Ac).

Clasificarea reaciilor de precipitare
Reactia Ag-Ac de precipitare poate avea loc in mediu lichid sau solid.

a. Reactii de precipitare in mediu lichid:
reactii de precipitare in amestec, reactii de floculare:
- titrarea toxinei difterice, determinarea titrului Ac antitoxici
- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), utilizate
in diagnosticul serologic al sifilisului
reactii de precipitare in inel
- reactia Ascoli (in diagnosticul antraxului), determinarea grupului streptococic
reactii de precipitare in tub capilar
- determinarea prezentei proteinei C reactive
- determinarea prezentei tipului M streptococic (streptococi de grup A)
dozajul nefelometric

b. Reactii de precipitare in mediu gelifiat:
imunodifuzia radiala simpla (metoda Mancini)
difuzia dubla:
- metoda Elek
- difuzia dubla radiala (Ouchterlony)
- reactii de precipitare in care difuzia in gel este combinata cu migrarea in cimp
electric:
Electroforeza si imunelectroforeza
Contraimunoelectroforeza
Electroforeza urmata de imunofixare
Electroimunodifuzia

Reacii de precipitare n mediu lichid
Au la baza unirea Ag cu Ac in mediul lichid, formindu-se complexe Ag-Ac, care vor
precipita atunci cind Ag si Ac se gasesc in anumite proportii.
Reacii de precipitare n amestec
Se demonstreaza prezenta sau absenta precipitatului in functie de concentratiile relative de
Ag si Ac. De exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (Ramon) se pun in contact, in amestec
in tuburi, cantitati egale din componenta care trebuie titrata (toxina difterica, Ag) cu cantitati
variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxima de precipitat se gaseste in tubul
unde exista raportul de echivalenta. Pentru sistemul toxina difterica-Ac anti-toxina difterica
(ca si in cazul sistemului toxina tetanica-Ac anti-toxina tetanica), raportul de echivalenta se
suprapune peste proportia optima, astfel incit se poate observa relativ usor tubul in care apare
cantitatea cea mai importanta de precipitat. Cunoscind titrul Ac, se afla imediat titrul toxinei
(1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxina care se combina cu o unitate de antitoxina =
1UA = 1 unitate antitoxica). Daca de exemplu, precipitarea maxima apare in tubul in care
titrul Ac este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.
Asemanator, prin metoda Dean si Web se poate determina titrul Ac anti-toxici, cunoscind
titrul toxinei.
VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) este un test de floculare, netreponemic
(nespecific) utilizat pentru diagnosticul serologic al sifilisului. Testele de floculare se bazeaza
pe faptul ca particulele antigenice ramin dispersate in serul normal, dar formeaza grunji
vizibili atunci cind se combina cu reaginele.
Tehnica:
Serul de cercetat se inactiveaza 30 minute la 56C. Se amesteca intr-o placa cu godeuri o
cantitate de 0,05 ml ser cu suspensie antigenica preparata in prealabil. Se folosesc martori
(seruri cu reactivitate cunoscuta, martor pentru Ag) pentru fiecare test. Se aseaza placa pe un
agitator la 180 turatii/minut 4 minute. Rezultatul se citeste prin transluminare pe fond negru,
cu ajutorul unei lupe.
Rezultatul este negativ daca lichidul nu prezinta flocoane si este asemanator martorului
negativ si martorului Ag. Rezultatul este pozitiv cind se vad flocoane, in lichid clar.
Rezultatul negativ nu elimina diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla in perioada de
incubatie sau in faza de sifilis latent (evidentiabil prin TPHA).
RPR este un alt test de floculare, netreponemic (nespecific) utilizat pentru diagnosticul
serologic al sifilisului.
Tehnica:
Se executa pe carduri de material plastic pe care apar mai multe cercuri de 18 mm. Ag este
preparat dintr-o suspensie antigenica tip VDRL modificata (pentru a elimina etapa de
inactivare prin caldura). Reactivul contine si particule de carbune. Ag RPR este amestecat cu
serul de cercetat in cercul de pe card. Daca Ac anti-T. palidum sunt prezenti, se combina cu
particulele lipidice din Ag si produc aglutinarea lor. Particulele de carbune coaglutineaza cu
Ac si duc la aparitia unor granule negre pe fondul alb al cardului. In absenta Ac rezulta un
aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ si cantitativ (dilutii de ser).

Reacii de precipitare n inel
Reacia de precipitare n inel, consta in punerea in contact a Ag si Ac astfel incit sa nu se
amestece; reactia care apare la interfata dintre Ag si Ac se concretizeaza printr-un inel de
precipitare albicios.
Aplicatii:
- in medicina legala reactia Uhlenhut pentru identificarea originii petelor de singe
- in industria alimentara pentru identificarea provenientei unor preparate pe baza de
carne
- identificarea prezentei Ag carbunos (Ag obtinut de la Bacillus anthracis) reactia
Ascoli
Reactia Ascoli:
Se utilizeaza 3 tuburi, 1 pentru reactie si 2 tuburi martor. In primul tub martor se pipeteaza
0,5 ml ser anticarbunos si 0,5 ml solutie salina fiziologica, iar in al doilea tub martor vom
pipeta 0,5 ml ser normal de cal si 0,5 ml solutie de antigen. In tubul de reactie se pipeteaza
intii 0,5 ml din serul anticarbunos, urmind ca solutia de Ag, 0,5 ml, sa fie pipetata foarte lent,
eventual prin scurgere picatura cu picatura, pe peretele interior al tubului, astfel incit cele
doua solutii sa nu se amestece. In cazul reactiei pozitive (prezenta Ag carbunos in solutia
antigenica), dupa circa 5 minute, la interfata dintre cei doi reactivi apare un inel de
precipitare.

Reacii de precipitare n mediu solid
Reactia Ag-Ac se vizualizeaza utilizindu-se geloza in care pot sa migreze cei doi reactivi,
obtinindu-se un arc/ linie de precipitare.
Imunodifuzia radiala simpla (IDRS Mancini)
Imunodifuzia radiala simpla (IDRS Mancini) se bazeaza pe difuzia spontana si radiala a Ag
din proba de cercetat, intr-un gel care contine o cantitate constanta de Ac, determinind
aparitia unui cerc de precipitare al carui diametru este direct proportional cu concentratia de
Ag din proba. Pentru a obtine un cerc de precipitare de marime convenabila, concentratia Ac
inglobati in gel trebuie sa fie aleasa in functie de titrul acestora si de concentratia Ag care
urmeaza a fi testat.
Aplicatii:
- determinarea cantitativa a Ig (IgG, IgM, IgA), fractiunii C
3
a complementului, 1-
antitripsinei, siderofilinei etc.
Tehnica:
Sunt necesare placute in care se toarna un gel care include Ac fata de structura a carei
concentratie dorim sa o determinam. In gel sunt perforate mici godeuri (3 mm). Sunt necesare
seruri de cercetat si un ser de referinta in care se cunoaste concentratia diferitelor
componente. Serurile se dilueaza in functie de proteina care urmeaza a fi determinata si apoi
se pipeteaza in godeuri. Dupa 10 minute de mentinere a placutei pe masa de lucru, aceasta se
incubeaza la 37C, cu stratul de gel pozitionat in sus, timp de 24-48 ore. Citirea se face cu
ajutorul unei rigle gradate din plastic, speciala pentru aceasta analiza. Se va masura initial
diametrul cercului de precipitare din jurul godeului in care se afla serul de referinta, iar in
functie de acesta se vor masura si cele ale serurilor test. Concentratiile se obtin dupa
inmultirea cu dilutia probei, conform unor tabele.

Imunodifuzia radiala dubla (Ouchterlony)
Imunodifuzia dubla se bazeaza pe difuzia Ag si Ac (unul spre celalalt) intr-un gel. Deoarece
marimea moleculelor de Ag si Ac este mai mica decit diametrul porilor gelului, iar distanta
parcursa de reactant intr-un anumit timp este direct proportionala cu gradientul concentratiei
sale si invers proportionala cu greutatea sa moleculara, migrarea reactantilor unul spre
celalalt determina formarea unor linii de precipitare la locul de intilnire Ag-Ac. In gelul
transparent vor aparea linii opace, numarul lor corespunzind numarului sistemelor Ag-Ac
studiate. Metoda certifica prezenta sau absenta proteinei cercetate.
Aplicatii:
- determinarea -fetoproteinei, proteina C reactiva, -2 microglobulina, proteine Bence-
Jones tip kappa si lambda, produsi de degradare ai fibrinogenului
- in micologie, pentru determinarea exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum,
Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezenta Ac fata de Ag
fungice, in diagnosticul serologic al aspergilozelor invazive
- determinarea specificitatii Ac antinucleari sau a altor Ac
Tehnica:
Sunt necesare lame de microscop pe care se toarna un gel de agar 1%, lama putind fi folosita
pe parcursul unei zile. In gelul de pe lama se perforeaza 3 grupe de godeuri, cite 7 godeuri in
fiecare grup (1 godeu central si 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). De
exemplu, daca se determina prezenta proteinei C reactiva (CRP) in seruri de cercetat, e
nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat si un ser de referinta care contine CRP. Se
numeroteaza godeurile periferice, se pipeteaza Ac anti-CRP in godeul central si un ser de
referinta cu CRP in godeurile 1 si 4. In celelalte godeuri se pipeteaza serurile de cercetat. Se
incubeaza la 37C, timp de 24 ore, in camera umeda. Liniile de precipitare pot deveni vizibile
dupa 2-4 ore dar sunt mult mai clare dupa 24 ore. Pentru citire poate fi necesara o lupa si o
sursa de lumina. Intre godeul central si godeurile 1 si 4 (martori pozitivi) vor aparea linii
(arcuri) de precipitare. In cazul in care de ex., in godeul 2 exista CRP, va aparea un arc de
precipitare si intre godeul central si godeul nr.2. Este certificata prezenta CRP in cazul in care
cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central si godeurile 1 si 2) sunt una in continuarea
celeilalte (imagine de genunchi indoit).

Difuzia dubl Elek
Aplicatii:
- depistarea capacitatii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae daca
tulpina este toxigena, toxina va difuza in mediu, iar dupa unirea cu Ac anti-toxina,
complexele Ag-Ac vor da nastere unor linii de precipitare
Tehnica:
Intr-o cutie Petri se toarna mediul Elek si dupa ce mediul s-a intarit, se decupeaza un sant pe
unul din diametre. In santul respectiv se pipeteaza 0,5 ml ser antidifteric, ser care contine Ac
anti-toxina difterica in concentratie de 1000 UI/ ml. Ac anti-toxina difterica vor difuza in
mediu. Dupa circa 2 ore se insaminteaza pe santul cu Ac anti-toxina, de fiecare parte a
santului, o tulpina de Corynebacterium diphteriae toxigena (martor pozitiv), o tulpina de
Corynebacterium diphteriae ne-toxigena (martor negativ) si tulpini de cercetat, cite un striu
(de fiecare parte a santului) pentru fiecare tulpina. Se incubeaza la 37C pentru 48 ore, dar se
urmareste zilnic aparitia culturii si precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor
de insamintare apare cultura bacteriana. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen,
toxina (Ag) difuzeaza in mediu. Unirea dintre Ag si Ac duce la formarea unor complexe Ag-
Ac care precipita, iar in mediu vor aparea linii de precipitare in unghiurile dintre cultura si
santul cu Ac anti-toxina. In cazul in care apar linii de precipitare in unghiul dintre una dintre
tulpinile de cercetat si santul cu Ac anti-toxina, respectiva tulpina este toxigena. Reactia va fi
negativa pentru martorul negativ si pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.


Reacii de precipitare combinate cu migrarea n cmp electric
Electroforeza proteica in gel
Electroforeza proteinelor este o metoda curent pentru separarea proteinelor serice utilizat n
laboratoarele de biochimie medical.
Electroforeza proteica in gel este folosita pentru decelarea unor proteine patologice.
Deplasarea proteinelor intr-un strat de gel supus actiunii unui cimp electric se va realiza
diferentiat, pentru fiecare structura proteica in parte, in functie de greutatea moleculara si
incarcatura electrica a proteinelor. Pentru vizualizare este necesara fixarea, uscarea si
colorarea liniilor de precipitare care corespund fractiunilor proteice din serul normal sau a
unor eventuale proteine patologice.
Se utilizeaz suporturi solide i pH alcalin, la care toate componentele proteice sunt ncrcate
negativ i migreaz spre polul pozitiv. Pe electroforegram, dup colorare, proteinele apar
sub form de benzi crora li se msoar densitatea optic, fiecare band avnd un maxim de
absorbie. Prin electroforez, n condiiile amintite mai sus, se obin cinci fraciuni: albumina
seric, alfa
1
, alfa
2
, beta, gamma - globuline.
Albumina, alafa
1
i beta apar sub forma unor benzi omogene, bine definite. alfa
2
, i
gamma apar ca benzi difuze, iar fraciunea gamma prezint n partea sa central o zona mai
intens colorat.

Indicatii
- detectarea gamapatiilor monoclonale
- evaluarea proteinelor serice i a statusului nutriional.
Valori de referin - sunt dependente de vrst


Vrst Albumina (%) a
1
(%) a
2
(%) b(%) g(%) A/G
< 1 an 40-65 2-5 6.6-13.5 8.5-14 10-21 1.16-2.23
1 16
ani
50-65 2-5 6-15 8.5-15 10-22 1.06-2.48
> 16 ani 52 68 2-5 6,6-13,5 8,5 -14 11 21 1.39-2.23

Interpretarea rezultatelor

Pentru a facilita interpretarea rezultatelor va fi descris fiecare din cele 5 fraciuni cu
proteinele componente:

Albumina
- Scderea albuminei serice (hipoalbuminemie) survine n stri patologice variate i are
semnificaii diferite (malnutriie, malabsorbie, sindrom nefrotic, neoplazii).
- Creteri ale albuminei apar n urma deshidratrilor. n cazuri speciale, n zona de
migrare a albuminei se constat o band suplimentar, datorat unor variaii genetice
fr relevan clinic (aloalbuminemie i bisalbuminemie).
Zona alfa
1
reflect n special concentraia seric de alfa1-antitripsin
- reducerea acestei fraciuni se intlneste n deficitul de alfa1-antitripsin asociat cu
anumite boli pulmonare (emfizem cu debut precoce) i hepatice (hepatit neonatal).
- creteri se nregistreaz n toate reaciile inflamatorii (reactant de faz acut). n
cazuri rare, obinerea unei benzi suplimentare largi n aceast zon poate sugera
prezena alfa-fetoproteinei.
Zona alfa
2
este constituit din 2 componente proteice: alfa2 macroglobulina i haptoglobina.
- cretere de a
2
apare n infecii acute, reumatism articular acut, arterit, sindrom
nefrotic, diabet zaharat, neoplazii;
- scderea acestei fractiuni se poate ntlni n pancreatite acute severe, leziuni
hepatocelulare, sindroame de coagulare intravascular diseminat, anemii hemolitice,
anemii megaloblastice.
Zona beta este alctuit din 2 benzi distincte: b1 corespunztoare transferinei i b2 care
include fraciunile complementului C
3
i C
4
. Al treilea component al acestei zone este beta-
lipoproteina, a crei band se poate suprapune pe cea a transferinei sau C
3
sau poate fi situat
n zona beta-gamma.
- creteri apar n anemia feripriv i ciroza biliar i
- scaderi n boli autoimune aflate n puseu activ (LES), nefroz, afeciuni hepatice,
neoplazii, infecii acute i cronice. n unele cazuri de mielom multiplu de tip IgA se
poate constata prezena unui component monoclonal n aceasta zon.
Zona gamma include imunoglobulinele (IgG, IgA, IgM, IgD i IgE). Anomaliile suferite de
acestea se traduc fie prin diverse deficite, fie prin hipergamaglobulinemii policlonale sau
monoclonale.
- scaderi n agamaglobulinemie, hipogamaglobulinemii i sindroame nefrotice.
Hipogamaglobulinemia poate fi congenital sau dobndit i poate fi uor detectat la
electroforeza proteinelor serice atunci cnd concentraiile principalelor 3 clase de
imunoglobuline sunt sczute (IgG, IgA i IgM). Prezena hipogamaglobulinemiei la
adult impune continuarea investigaiilor n vederea depistrii unei posibile boli
limfoproliferative (mielom cu lanuri uoare, leucemie limfatic cronic, limfoame).
- creterile policlonale indic un proces imunologic cronic asociat cu afeciuni hepatice
(hepatit cronic activ, ciroz), boli de colagen (LES, poliartrit reumatoid),
neoplazii (ex. boal Hodgkin), leucemie mielo-monocitar cronic. n aceste cazuri,
hipergamaglobulinemia se datoreaz activrii unui numr mare de clone plasmocitare
care elibereaz imunoglobuline. Trebuie menionat aspectul caracteristic cirozei
alcoolice de punte beta-gama, vizualizat pe gel ca o zon intens colorat ntre
zonele beta i gamma.
Uneori, n zona gamma se pot observa cteva benzi mici, nguste, denumite oligoclonale,
ntlnite la pacieni cu hepatit, boli ale complexelor imune, sindromul imunodeficienei
dobndite, limfomul angioimunoblastic.
Gamapatiile monoclonale includ un numr mare de condiii clinice i biologice asociate de
obicei cu afeciuni maligne (mielom multiplu, boal Waldenstrm, amiloidoz, limfoame) dar
i cu unele afeciuni benigne sau chiar cu absena unei modificari patologice (gamapatii
monoclonale cu semnificaie nedeterminat). n aceste cazuri, se depisteaz la electroforeza
proteinelor un component monoclonal (band M), rezultat ca urmare a proliferarrii unei
singure clone plasmocitare. Pe gel, componentele monoclonale apar sub forma unor benzi
inguste, net definite, iar dup scanarea densitometric, se obin vrfuri (peak-uri)
caracteristice, ce pot fi ntlnite oriunde ntre zonele alfa i gamma, datorit mobilitii
electroforetice variabile, cel mai frecvent ins n zona gamma.
Imunoglobulinele monoclonale sunt omogene din punct de vedere structural i biochimic,
fiind alctuite dintr-un singur tip de lan uor (kappa sau lambda). n circulaie pot fi eliberate
imunoglobuline complete sau numai subuniti ale acestora (ex. lanuri uoare monoclonale,
denumite proteine Bence-Jones). Prezena componentului monoclonal va fi precizat pe
buletinul final de analize al pacientului, cu recomandarea de a se efectua electroforeza
proteinelor serice cu imunofixare
1-3
.
n tabelul de mai jos sunt sintetizate informaiile prezentate:

Zone electroforetice
Descriere aspect Albumina
%
Alfa 1
%
Alfa
2
%
Beta
%
Gamma
%
Normal N N N N N
Enteropatie cu pierdere de
proteine
- N+ N+ N- -N+
Sindrom nefrotic - N +++ N N-
Hipogamaglobulinemie N- N N N -
Agamaglobulinemie N- N N N Absent

Legend



Imunoelectroforeza
Se asociaza electroforeza in gel cu imunodifuzia dubla (realizindu-se separarea prin
electroforeza a proteinelor in mediu gelozat, urmata de o imunodifuzie dubla utilizind un
antiser corespunzator). Reactia Ag-Ac se va vizualiza prin aparitia unor arcuri de precipitare.
Este o metoda foarte utila in studierea puritatii unui Ag (sau Ac).
Aplicatii:
- evidentierea prezentei Ag K eliminat in urina in boala pneumococica

Contraimunoelectroforeza
Contraimunoelectroforeza este o dubla difuzie in care deplasarea unul fata de celalalt a Ag si
Ac este accelerata de un cimp electric.
Tehnica:
Pe o lama de microscop se toarna un gel de agar 1% si se perforeaza 3 grupe de perechi de
godeuri, fata in fata. Metoda poate fi folosita pentru acele structuri antigenicecare in cimp
electric migreaza catre anod. In godeurile care vor fi pozitionate spre catod (polul negativ) se
pipeteaza Ag, iar in godeurile care vor fi pozitionate spre anod (polul pozitiv) se pipeteaza Ac
cunoscuti, specifici Ag de identificat. Reactia este mai rapida si mai sensibila decit dubla
difuzie deoarece migrarea celor doi reactanti unul catre celalalt este amplificata de cimpul
electric. Reactia (aparitia unei linii de precipitare intre godeuri, in cazul in care in godeul
catodic se gaseste Ag presupus) poate fi citita dupa numai 30-90 minute in loc de 24 ore asa
cum se intimpla in dubla difuzie Ouchterlony.
Aplicatii:
- identificarea prezentei AgHBs importanta istorica
- identificarea Ag capsulare in LCR la pacientii cu meningita acuta (Haemophilus
influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae).
Gamopatie policlonal N- N N N +
Rspuns inflamator cronic N- N+ + N +
Rspuns inflamator acut N- + + N N-
Rspuns inflamator subacut N- N + N N
Ciroz hepatic - N N- Punte beta-gamma
Hipoalfa-1 globulinemie N - N N N
Gamopatie monoclonal (tip ) N- N N N Band M
Gamopatie monoclonal (tip ) N- N N Banda
M
N-
Gamopatie biclonal N- N N Banda
M
Band M
Benzi oliglonale N- N+ N+ N Benzi
oligl.
Bisalbuminemie Vrf
dublu

Hipoalbuminemie - N N N N
N = nivel normal + =nivel crescut - =nivel sczut
N+=nivel
normal/crescut
N- =nivel
normal/sczut
-N+=nivel
sczut/normal/crescut

Electroimunodifuzia
Electroimunodifuzia are la baza electroforeza probelor care contin proteina-Ag, intr-un strat
de gel, care contine o cantitate constanta de Ac monospecifici (anti proteina-Ag), rezultind
zone de precipitare in forma de racheta sau conuri, a caror arie este direct proportionala cu
concentratia Ag. Metoda are o sensibilitate mai mare decit imunodifuzia radiala simpla.


II. Reacia de aglutinare

Reactia de aglutinare consta in reactia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafata unor
particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol), determinind aglutinarea acestora prin
scaderea fortelor electrostatice de repulsie dintre particule si formarea unor punti de legatura.
Antigenele sunt de natura corpusculara.
Aglutinarea este mai sensibila decit precipitarea, Ag fiind o particula si nu o molecula
solubila. Ac de tip IgM sunt mai aglutinanti decit Ac de tip IgG (pentru ca au mai multe
valente). Exista si Ac neaglutinanti (incompleti / blocanti) sau care aglutineaza numai la rece.

Tipuri de aglutinare:
- aglutinarea directa
- aglutinarea indirecta
- inhibarea aglutinarii
- aglutinarea in coloana
- aglutinarea mediata de Ac anti-imunoglobuline

1. Aglutinarea directa
Aglutinarea directa este aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de catre
Ac specifici.
Aplicatii:
- in diagnosticul bacteriologic: de exemplu pentru identificarea enterobacteriaceelor
(Shigella, Salmonella, E. col, Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae) pe baza
structurii antigenice
- in diagnosticul serologic al unor boli infectioase (febra tifoida, bruceloza,
leptospiroza, rickettsioza)
- determinarea grupelor sanguine (AB0)
Aglutinarea directa pe lama in diagnosticul bacteriologic
Materiale necesare:
- cultura de identificat (colonii de tip S, de 18-24 ore)
- solutie salina fiziologica
- Ac cunoscuti fata de Ag pe care dorim sa le identificam (Ac polivalenti, Ac
monovalenti de grup/ tip
- lame de microscop curate
- pahar Berzelius cu amestec dezinfectant
Tehnica:
- se pune pe o lama o picatura suspensie omogena din colonia de identificat in ser
fiziologic (daca suspensia se limpezeste si apar grunji, tulpina este netipabila, apare
aglutinare nespecifica, fiind probabil dintr-o colonie de tip R)
- se adauga o picatura de ser cu Ac cunoscuti si se realizeaza o suspensie omogena
- in cazul reactiei pozitive (corespondenta intre Ac cunoscuti si Ag de identificat) se
produce aglutinarea
Aglutinarea directa pe lama reactia Huddleson
Aplicatii:
- diagnosticul brucelozei
Materiale:
- lame de microscop
- Ag brucelos inactivat (colorat in violet)
- ser de cercetat
Tehnica:
- se adauga o picatura de de solutie de Ag brucelos si una de ser de cercetat pe o lama
de sticla
- se omogenizeaza
- reactia este pozitiva daca apare aglutinare Ac anti-Brucella spp sunt prezenti in
serul pacientului; reactia pozitiva pe lama trebuie confirmata prin aglutinare in tuburi.


2. Aglutinarea indirecta (pasiva)
Aglutinarea indirecta (pasiva) este o reactie in care particule artificiale (globule rosii
formolate, particule de latex, cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt incarcate
in vitro cu Ag sau Ac si sunt aglutinate de catre Ac sau Ag corespondente din proba de
cercetat.
Aplicatii:
- determinarea factorului reumatoid, CRP
- determinarea grupului streptococic, a pneumococilor, meningococilor
- identificarea E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b
- detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene)
- detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp)
sau virusuri
- identificarea unor exotoxine in filtratul de cultura
- identificarea E. coli O:157, Legionella pneumophilla, Listeria monocytogenes
Hemaglutinarea pasiva - TPHA (Treponema pallidum hemaglutinatinare)
Metoda calitativa:
Se face dilutia serului 1/20 (190l diluent si 10 l ser de analizat);
se pun cite 25 l proba diluata in cite 2 godeuri;
se agita usor reactiv test si reactiv de control;
se adauga 75l de reactiv test in godeul 1 si 75 l reactiv de control in godeul 2;
se incubeaza pentru 45 minute pe o suprafata fara vibratii, la temperatura camerei;
se citesc rezultatele

Metoda cantitativa:
Se face dilutia serului 1/20 (190l diluent si 10 l ser de analizat);
Se lasa primul godeu gol si se adauga cite 25 l TPHA diluent pina la godeul 8;
Se adauga 25 l de proba in godeul 1;
Se adauga 25 l de proba in godeul 2 se agita si se fac dilutii seriale
Se adaua 75 l reacti test in toate godeurile
Se obtin titruri de la 1/80- 1/10240
Se incubeaza la temperatura camerei pe o suprafata fara vibratii timp de 45 de minute
Se citesc rezultatele




DETERMINAREA TPHA :

Dupa terminarea timpilor de reactie se face citirea reactiei, notandu-se cu :


4+ voal neted de celule acoperind in intregime fundul godeului, uneori cu
margini cu falduri.

3+ voal neted de celule acoperind partial fundul godeului.



2+ voal de celule conturat printr-un cerc de celule.


1+ voal de celule conturat printr-un cerc de celule bine evidentiat.



+/- buton de celule cu o mica deschidere centrala.



-- buton de celule cu sau fara o foarte mica deschidere centrala.



POZITIV: de la 4+ la 1+
INCERT: +/-
NEGATIV : --
Aspectul reactivului de control nu trebuie utilizat drept comparatie pentru esantioanele negative.
Reactivul de control va da un buton de celule mai compact decat reactivul antigen.
O aglutinare in godeul de control (3) indica prezenta aglutininelor nespecifice. Totodata, reactiile
nespecifice sunt foarte rare prin utilizarea eritrocitelor de pasare, un esantion cu acest rezultat
neputand fi interpretat.
Un rezultat pozitiv in godeurile cu esantion indica prezenta anticorpilor anti-T.pallidum rezultanti ai
unei infectii trecute sau prezente.
Un rezultat negativ in godeurile cu esantion indica absenta anticorpilor.
Un rezultat la limita in testul calitativ poate corespunde la un titru scazut de anticorpi din stadiile
precoce de sifilis sau un titru rezidual din sifilisul tratat. In acest caz, o proba suplimentara va trebui
testata pentru a demonstra o posibila crestere a titrului de anticorpi.
In metoda cantitativa titrul aproximativ va corespunde ultimei dilutii care va da o reactie pozitiva.
LIMITELE REACTIEI
Tehnica TPHA poate da reactii incrucisate cu alte forme de infectii cu treponeme si reactii fals
pozitive cu probele pacientilor cu mononucleoza infectioasa, lepra sau maladii autoimune.
Reactii fals pozitive pot cauza si serurile lipemice sau icterice.
Ocazional, in unele cazuri de sifilis primar precoce, anticorpii specifici ar putea sa nu fie detectati prin
tehnicile TPHA.
Anticorpii specifici pot persista o lunga perioada de timp, chiar daca tratamentul acestei boli a avut
succes.




3. Inhibarea aglutinarii
Reactia consta in inhibarea aglutinarii particulelor incarcate cu Ag, dupa ce in prealabil Ac
reactioneaza cu Ag corespondent.
Aplicatii:
- decelarea mioglobinei
- diagnosticul imunologic al sarcinii

Aglutinarea in coloana
Metoda permite o mai buna vizualizare a reactiei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente,
partea in care se introduc reactivii (situata superior) si o coloana situata inferior, plina cu
microparticule de sticla. Dupa introducerea hematiilor si a serului de cercetat si incubarea
acestora, dispozitivul este centrifugat. In cazul unei reactii pozitive complexul Ag-Ac se va
vizualiza la nivelul coloanei, in timp ce in cazul unei reactii negative, hematiile se depun in
portiunea inferioara a coloanei

Aglutinarea mediata de Ac anti-imunoglobuline
Ac anti-Ig se vor cupla cu particule incarcate cu Ac si vor duce la aparitia unor aglutinate
(prin aparitia complexului imun).
Aplicatii:
- decelarea factorului reumatoid (tehnica Waaler-Rose).

III. Reacia de fixare a complementului (RFC)

Principiu:
Reacia de fixare a complementului (RFC) se bazeaza pe proprietatea sistemului C de a se
fixa pe complexul imun Ag-Ac. In prima faza a reactiei se introduce serul de cercetat iar daca
acest ser contine Ac specifici fata de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de
fixarea C, care se va activa pe calea clasica si nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe
sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac antihematie). In cazul in care serul de cercetat nu
contine Ac specifici fata de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac in
prima etapa a RFC. Dupa introducerea in reactie a sistemului hemolitic indicator, hematiile si
Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun, iar C liber se va fixa pe acesta.
Dupa fixare va urma activarea C si respectiv liza hematiilor, hemoliza putind fi examinata cu
ochiul liber.
Pentru vizualizarea reactiei este nevoie de utilizarea unui sistem hemolitic indicator; Ag este
sub forma macromoleculara sau corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul
Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber, daca nu se adauga sistemul hemolitic.
Aplicatii:
- diagnosticul serologic al sifilisului reactia Bordet-Wasserman
- diagnosticul serologic al infectiilor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia
spp., Rickettsia spp., Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp, virusuri
Materiale:
- serul de cercetat
- seruri de referinta (martor pozitiv si negativ)
- Ag cunoscut (suspensie corpusculara sau solutie coloidala)
- sistemul C obtinut din ser prospat sau conservat recoltat de la cobai
- sistemul hemolitic indicator format din: hematii de berbec si ser hemolitic anti-
hematii de berbec (obtinut prin injectari repetate de hematii de oaie la iepurele de
laborator)
- baie de apa cu temperatura reglabila
- placi cu godeuri, tuburi de hemoliza, pipete diferite
Tehnica de lucru:
- serul de cercetat se va mentine 30 minute la 56C, in baia de apa, pentru inactivarea
C propriu
- etape:
se pun in reactie C, serul de cercetat si Ag cunoscut; sunt doua posibilitati:
in serul de cercetat exista Ac specifici, rezultind un complex Ag-Ac pe
care se va fixa C;
in serul de cercetat nu exista Ac specifici, nu se formeaza complex
Ag-Ac, C ramine liber
se introduce in reactie sistemul hemolitic indicator (hematii+Ac anti-hematie);
exista 2 posibilitati:
C nu este liber, nu are loc hemoliza
C se fixeaza pe sistemul hemolitic, lizeaza hematiile si apare hemoliza
- se dilueaza conform indicatiilor din protocolul de lucru reactivii utilizati
- se repartizeaza in godeurile corespunzatoare serurile de cercetat, Ag si C
- pe o placa separata se prepara martorii (martor pentru sistemul hemolitic, pentru C,
Ag, serul de referinta si martor sigur negativ)
- placile se tin pina a doua zi la 4 C
- a doua zi, placile se mentin la 37 C timp de 30 min
- se adauga in toate godeurile sistem hemolitic
- placile se mentin la 37 C timp de 30 min
- se pun placile la 4 C, pina la sedimentarea hematiilor
- in RFC Bordet-Wasserman, metoda calitativa, reactia se realizeaza in eprubete, 2
pentru reactia propriu-zisa (una cu ser diluat 1/8, cealalta cu ser diluat 1/16, 2 pentru
martori sigur pozitiv si sigur negativ si cite una pentru fiecare din ceilalti martori,
respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C, martor
pentru serul hemolitic).
- interpretare: se verifica reactia martorilor; in tubul cu serul de cercetat, testul este
negativ (lichidul din tub are un aspect rosu, limpede), inseamna ca nu exista Ac; testul
este pozitiv atunci cind in tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliza, hematiile se
depun formind un buton in partea inferioara a tubului (in serul de cercetat exista Ac)
Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RFC-BW sa fie confirmata prin reactii
specifice.


IV. Reacia de seroneutralizare
Principiu:
Ag are o anumita proprietate biologica (toxica, enzimatica) care poate fi blocata prin
cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar in
cazul in care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatica respectiva
este acelasi cu determinantul antigenic (epitop). RSN are nevoie de un artificiu tehnic
pentru a permite vizualizarea rezultatelor.
Aplicatii:
- diagnosticul microbiologic direct:
identificarea Clostridium perfringens prin metoda placilor
semineutralizate
testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test
de seroprotectie)
toxinotipia in cazul suspicionarii unei toxiinfectii alimentare cu
Clostridium botulinum
- diagnosticul serologic:
reactia ASLO
- prevenirea unor boli infectioase prevenibile prin vaccinare si evaluarea eficacitatii
vaccinale:
vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, ATPA, ADPA)
titrarea prezentei Ac anti-toxine (difterica, tetanica)
testarea prin IDR (intradermoreactie) a susceptibilitatii fata de o
anumita boala infectioasa care are la baza drept mecanism patogenic
efectul unei exotoxine
- tratamentul/ profilaxia unor boli infectioase prin utilizarea de imunoglobuline
specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe

Reactia ASLO
Reactia ASLO determina titrul Ac antistreptolizina O.
Aplicatii:
- diagnosticul retrospectiv al unei infectii streptococice
- confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice
Principiu:
Titrarea Ac anti-SLO se bazeaza pe faptul ca SLO are efect hemolitic asupra hematiilor
de iepure sau de berbec. In cazul in care in serul de cercetat exista Ac anti-SLO, actiunea
hemolitica a SLO este neutralizata. Combinind dilutii din serul de cercetat cu o cantitate
constanta de SLO se poate determina titrul ASLO.
Materiale si reactivi necesari:
- ser de cercetat
- SLO liofilizata
- singe defibrinat de iepure/ berbec
- solutie salina izotona, solutie de rivanol 0,3%
- eprubete, pipete gradate
- baie de apa, centrifuga
Tehnica:
- se omogenizeaza suspensia de hematii
- se indeparteaza inhibitorii SLO din serul de cercetat (se utilizeaza solutie de rivanol si
suspensie de carbune activ, se realizeaza o dilutie de 1/10 a serului care se va mentine
30 minute la 56C)
- se realizeaza dilutiile de ser si se repartizeaza in tuburile de reactie (ser in dilutii
succesive) impreuna cu SLO (in cantitate constanta, cite 0,5 ml/tub); combinarea
serului de cercetat cu SLO reprezinta prima etapa a reactiei;
- se agita tuburile pentru omogenizare si se mentin 15 minute la 37 C
- urmeaza a doua etapa a reactiei ASLO, respectiv adaugarea suspensiei de hematii
(5%), cite 0,5 ml in fiecare tub
- se agita pentru omogenizare si se incubeaza timp de 45 minute la 37 C
- se centrifugheaza tuburile timp de 1 minut (1500 rotatii/ minut) si se mentin pina a
doua zi la 4 C
- interpretare: pornind de la o dilutie initiala a serului de 1/10, dupa adaugarea tuturor
reactivilor titrul (numarul de unitati ASLO) va fi 12, 50 in tubul urmator, 100, 125,
166, 250, 333 etc in tuburile urmatoare. Titrul reactiei ASLO este dat de cea mai mare
dilutie de ser la care lipseste complet hemoliza. Valoarea normala este de 200- 250
unitati ASLO.

Utilizarea RSN in profilaxia si tratamentul unor boli infectioase
Vaccinarea in scopul obtinerii unei protectii prin seroneutralizare
Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) in faza I, combinata
cu anatoxina difterica si tetanica. Primovaccinarea se incepe cu virsta de 2 luni a nou-
nascutului, administrindu-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru
mentinerea imunitatii se practica revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare, iar
revaccinarea a II-a se practica la 36 luni de viata a copilului respectiv.
Evaluarea eficacitatii vaccinurilor
Se recomanda testarea starii de imunitate indusa prin vaccinare; metodele au la baza
titrarea Ac anti-toxina (difterica, tetanica) in seruri prelevate de la copii vaccinati. Se
considera ca un copil este protejat (prezinta rezistenta specifica in cazul unei infectii
difterice) daca titrul Ac-anti toxina difterica este mai mare de 0,03 UAI/ ml (UAI =
unitate anti-toxica internationala)
Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica daca persoana investigata
este sau nu protejata fata de o anumita infectie prin IDR. IDR Dick permite testarea
susceptibilitatii fata de scarlatina (toxina este elaborata de catre streptococul de grup A
lizogenizat). IDR Schick permite testarea susceptibilitatii fata de difterie (toxina este
elaborata de catre bacilul difteric lizogenizat.
Tehnica:
Se injecteaza in treimea medie a antebratului, strict intradermic o cantitate de 0,1 ml
toxina diluata corespunzator. In cazul in care in singele persoanei testate se gaseste o
cantitate de Ac anti-toxina mai mare de 0,03 UAI/ ml, toxina inoculata va fi neutralizata
si nu va aparea nicio modificare la locul inocularii (lipsa eritemului semnifica faptul ca
persoana testata nu este susceptibila sa faca difterie, in cazul in care se infecteaza cu un
bacil difteric toxigen). In cazul in care persoana respectiva nu prezinta Ac anti-toxina
difterica, Ag inoculat va conduce la aparitia unui eritem la locul de inoculare.

Terapia sau profilaxia specifica (imunoterapie pasiva)
administrarea de Ig specifice omologe, obtinute de la persoane imunizate (natural
sau artificial) fata de o anumita boala infectioasa; de exemplu in imunoterapia
infectiei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra im 3-6.000 UAI
administrarea de seruri imune heterologe, obtinute prin hiperimunizarea cailor, in
tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului
Terapia bolilor in care mecanismul patogenic implica exotoxine trebuie instituita cit mai
rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cind se gasesc in circulatie.