Enzyme-Linked

Immunosorbent
Assay (ELISA)
A REALIZAT: LISEVICI ELENA
M1905
  Introducere
CUPRINS
 Tipuri de ELISA

 ELISA direct

 ELISA indirect

 ELISA competitiv

 ELISA sandwich
 INTRODUCERE
ELISA(enzyme-linked
immunosorbent assay) este o
metodă utilizată pentru a detecta
cantitativ prezența unui ligand intr-
o probă lichidă folosind anticorpi
îndreptați împotriva proteinei care
trebuie măsurată.

ELISA este utilizată în multe

domenii de cercetare și testare.
• ELISA se efectuează pe plăci de polistiren, de

obicei pe plăci cu 96 de godeuri acoperite pentru

Cum se
a lega proteina foarte puternic.
realizează?
• În funcție de tipul ELISA,testarea necesită un

anticorp de detectare primar șă/sau secundar,

antigen, anticorp, tampon,spălare și substrat.

• Anticorpul de detectare primară este un

anticorp specific care se leagă doar de proteina

de interes, în timp ce un anticorp de detectare

secundar este un al doilea anticorp conjugat cu

enzime care leagă un anticorp primar care nu

este conjugat cu enzima

• Se cunosc 4 pași principali pentru realizarea unui test
imunologic ELISA.Acești pași sunt:
Acoperire (cu antigen sau anticorp)
Blocare (de obicei cu adăugarea de ser albumină bovină BSA)
Detectare(adăugarea unui substrat care poate genera o
culoare,cele mai des utilizate:peroxidaza cu hrean(HRP) și
fosfataza alcalină(ALP).Substratl pentru HRP este peroxidul
de hidrogen și are ca rezultat o schimbare de culoare
albastră. ALP indică culoarea galbenă a nitrofenolului după
perioade de incubație la temperatura camerei, și folosește ca
substrat P-Nictrofenil-fosfat (pNPP)
Citire finală
 Tipuri ELISA
DIRECTE
INDIRECTE
COMPETITIVE
SANDWICH
 • 1. Adăugarea de antigen la plăci, care
este incubat timp de o oră la
temperatura de 37 C
ELISA
• 2.După finalizarea etapei de
incubare,urmează spălarea plăcilor
direct
oricărui anticorp potențial nelegat și
blocarea oricărui situs nelegat pe placa
ELISA, folosind agenți precum aprotinină
sau alte proteine animale.
• 3.După adăugarea tampononului, placa
este spălată și se adaugă un aticorp
selectat de detectare primară conjugat
cu enzime.Placa este incubată din nou.
• În ELISA direct, anticorpul de detectare primară se leagă
direct de proteina de interes.Apoi, placa este spălată pentru a
elimina orice anticorp nelegat și urmată de adăugarea unui
substrat, cum ar fi fosfotaza alcalină(AP) sau peroxidaza de
hrean (HRP) pe placă, ceea ce are ca rezultat o schimbare a
culorii.
• Schimbarea culorii probei are loc fie prin hidroliza grupărilor
fosfat din substrat prin AP, fie prin oxidarea substraturilor de
către HRP.
• Avantajele utilizării ELISA directe includ eliminarea
reactivității încrucișate a anticorpilor secundari și, datorită mai
pușinilor pați, este rapidă în comparație cu ELISA indirectă.
• Dezavantaje: sensibilitatea scăzută în comparație cu celelelalte
tipuri de ELISA și costul ridicat al reacției.
• ELISA indirect necesită doi
anticorpi, un anticorp de detectare
primară care se lipește de proteina
de interes și un aticorp secundar ELISA
Indirect
legat de enzimă complementar
anticorpului primar. Anticorpul primar
este adăugat mai întâi, urma de o
etapă de spălare și apoi anticorpul
secundar conjugat cu enzimă este
adăugat și incubat.
• ELISA indirectă are o sensibiliate mai
mare în comparație cu ELISA directă.

• De asemenea este mai puțin costisitoare și

mai flexibilă datorită numeroșilor
anticorpi primari care pot fi utilizați.

• Singurul dezavataj major al acestui tip

este riscul de reactivotate încrucișată
între anticorpii de detectare secundară
 ELISA
• Testele ELISA competitive utilizează doi
anticorpi specifici, un anticorp conjugat cu o
competitiv enzimă și un alt anticorp pezent în serul
testat. Combinarea celor doi anticorpi în
godeuri va permite o competiție pentru
legarea de antigen. Prezența unei modificări
de culoare înseamnă că testul este negativ
deoarece anticorpul conjugat cu enzime a
legat antigenele. Absența culorii indică un
test pozitov și prezenta anticorpilor în serul
testat.
 • ELISA competitiv are specificitate scăzută și nu poate fi

utilizat în probe diluate. Cu toate acestea,beneficiile constau în

faptul că este necesară mai puțină purificare a probelor,poate

măsura o gamă largă de antigeni într-o probă dată,poate fi

utilizată pentru antigeni mici și are o variabilitate scăzută

 ELISA sandwich
• ELISA sandwich începe cu un anticorp de captură acoperit pe godeurile
plăcii. Se numește sandwich deoarece antigene sunt intercalate între
două straturi de anticorpi(anticorpi de captare și detectare).

• După adăugarea anticorpului este capatre pe plăci, plăcile sunt apoi

acoperite și incubate peste noapte la 4 C. Odată ce etapa de acoperire
este completă, plăcile sunt spălate, apoi tamponate/blocate.Spălările
tampon se efectuează cel puțin 1-2 ore la temperatura camerei. În cele
din urmă, placa este spălată din nou înainte de adăugarea antigenului.
• ELISA sandwich are cea mai mare
sensibilitate dintre toate tipurile
ELISA. Dezavantajele majore ale
acestui tip de ELISA sunt timpul și
cheltuielile și utilizarea necesară a
„perechii potrivite” (antigen
divalent / multivalent) și a
anticorpilor secundari.
 Diagnostic Test
Testele ELISA sunt aplicate în multe teste de
diagnostic. Unele dintre utilizările ELISA pot include
următoarele:

Detectarea și măsurarea prezenței anticorpilor în sânge

Detectarea și estimarea nivelurilor markerilor tumorali

Detectarea și estimarea nivelurilor de hormoni

 Bibliografie
1. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25908411/
2. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19850633/
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2562869/?
report=reader
4. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28315213/
5. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27388394/
6. https://
www.moleculardevices.com/applications/enzyme-linked-immunosorbe
nt-assay-elisa#gref
7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK555922/
8. https://
www.immunology.org/public-information/bitesized-immunology/exper
imental-techniques/enzyme-linked-immunosorbent-assay