Sunteți pe pagina 1din 9

Tehnica ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezintă la ora actuală, una din cele mai
des folosite metode, de indentificare şi apreciere cantitativă pentru anticorpi, antigene, hormoni,
citokine şi o paletă largă de alte molecule, inclusiv peptide sintetice.
Tehnica ELISA a fost inventată de un grup de cercetători de la Universitatea din Stokholm
condus de Peter Perlmann şi Eva Engval, aceştia publicând primul articol despre ELISA în 1971.
Articolul descria aprecierea cantitativă a IgG în serul de iepure folosind fosfatază alcalină ca
enzimă de indentificare. Avantaje de siguranţă crescută şi cele economice, faţă de testarea
radioimună(RIA) au făcut din tehnica imunoenzimatica ELISA una indispensabilă pentru domeniul
medicinei clinice, biologiei si al biotehnologiei.

1. PRINCIPIUL METODEI

Principiul metodei, indiferent de tipul de ELISA ales, este în esentă acelaşi şi se bazează
pe reacţia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captură este fixat pe un suport solid după
care este pus în contact cu o imunoglobulină, un antigen sau respectiv orice moleculă pentru
care are specificitate. O enzimă cuplată fie direct de imunoglobulină sau de un alt anticorp anti-
imunoglobulină degradează un substrat cromogen incolor producând un compus colorat ce poate
fi detectat spectrofotometric la o lungime de undă corespunzatoare.

2. PUNCTE CRITICE ÎN PROTOCOLUL ELISA

În implementarea oricărei tehnici ELISA întelegerea proceselor de bază şi aplicarea


corectă a acestora reprezintă un factor esenţial în atingerea obiectivului propus.
Etapele fundamentale ale tehnicii sunt reprezentate de:
 Prepararea conjugatului
Conjugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate pentru molecula de
determinat, cuplat cu o enzimă. Cuplarea enzimei se realizează prin cross-linkare sub acţiunea
unor agenti favorizanţi cum ar fi glutaraldehida, di-iso-cianat toluen, p-benzochinona, etc.
Deşi un grup mai mare de enzime au fost utilizate de-a lungul timpului, fosfatază alcalină şi
peroxidază din hrean(HRP-horseradish peroxidase) rămân cele mai populare datorită
randamenului oferit prin prelucrarea rapidă a substratului şi a gamei vaste de tehnici de
developare existente.
Alte enzime folosite în tehnica ELISA sunt β-galactozidaza, glucozoxidaza, pirofosfataza, etc.
În cazul în care conjugatul folosit este reprezentat de un grup enzimă-anticorp, anticorpul
respectiv trebuie să fie ales în aşa fel încât să recunoască alt determinant antigenic al moleculei
de determinat cum ar fi fragmentul Fc al imunoglobulinei sau alt epitop al antigenului.
Există o multitudine de protocoale pentru prepararea conjugatului disponibile în literatură dar
realizarea acestora presupune experienţă în domeniu şi timp consumat în plus. Mai convenabilă
este achiziţionarea conjugatului de la firme specializate în domeniu.
 Fixarea anticorpului sau antigenului de captură pe placă
Pentru pregatirea unei determinări ELISA, pregatirea plăcii de reacţie este foarte importantă.

1
Cu toate că diferite tipuri de plăci gata pregătite pot fi achiziţionate de la producători, acestea pot
fi adesea scumpe aşa că prepararea plăcilor în laborator reprezintă încă un punct cheie în
tehnica ELISA.
În general se folosesc plăci de microtitrare cu 96 de godeuri fabricate din material plastic.
Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafeţe din plastic datorită interacţiunilor hidrofobice
între structurile proteice nepolare şi structurile nepolare ale matricei polimerului.
Există mai multe protocoale de fixare, dar cele mai des folosite, implică incubarea unei diluţii a
anticorpului sau antigenului de captură în godeul plăcii de microtitrare într-un tampon carbonat la
pH 9-10.
o
Incubarea poate fi de câteva ore sau peste noapte şi se face la 37 C sau la temperatura camerei.
o
Placa de microtitrare astfel pregătită poate fi pastrată la 4 C până la 6 luni.
Deoarece fixarea anticorpilor de placă nu este una specifică este necesară blocarea situsurilor de
legare nespecifică pentru a preveni fixarea celorlalţi reactanţi de placă în locul interacţiunii
acestora cu anticorpul fixat. Blocarea se realizează de obicei prin incubarea cu un tampon de
blocare, format de obicei dintr-o proteină inertă şi un detergent neionic.
 Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat în placă
Adaugarea diluţiei de antigen sau anticorp în placa de reacţie reprezintă prima etapă efectivă a
tehnicii ELISA şi nu un pas pregătitor.
În această etapă molecula de determinat se ataşează prin legături de hidrogen, ionice,
interacţiuni hidrofobice şi forţe de interacţiune van der Waals, de anticorpul/antigenul
completentar, de captură.
Incubarea se realizează de obicei la temperatura camerei timp de 2 ore.
Cu toate că numărul de legari specifice în timp de 2 ore este de obicei suficient pentru a obţine
un semnal puternic în reacţia cromogenă, saturarea situsurilor de legare(starea de echilibru) este
atinsă în aproximatix 5-10 ore, aşa că o incubare mai lungă poate duce la rezultate mai bune.
 Indepărtarea reactanţilor liberi din placă (Spălarea)
Un pas foarte important în tehnica ELISA îl reprezintă etapele de spălare. Moleculele nefixate fie
în timpul aderării la placă fie în timpul legărilor specifice cu anticorpii de captură trebuiesc
eliminate din godeuri pentru a nu inhiba legarea reactanţilor ce urmează a fi adăugaţi ceea ce ar
conduce la un rezultat eronat.
O etapă de spălare presupune încărcarea godeurilor cu o anumită cantitate de tampon de
spălare şi îndepărtarea tamponului de spălare după o perioadă scurtă de timp.
Tamponul de spălare este reprezentat în general de o soluţie de tampon fosfat salin(TFS) la care
se poate adaugă 0,05% azidă de sodiu(NaN3).
Pentru a asigura o spălare bună a plăcii şi implicit o îndepărtare eficientă a reactanţilor liberi din
placă sunt necesare mai multe spălări între etapele determinării.
La sfârşitul fiecărei etape de spălare, indiferent de numărul de spălări din respectiva etapă, este
bine să se elimine orice urmă de tampon de spălare din godeuri. Pentru aceasta, placa este
întoarsă şi scuturată energic pe un prosop de hartie.
Foarte importante rămân spălările după fixarea antigenului pe placă, după prima incubare şi după
incubarea cu soluţia de conjugat.
Numărul de spălări într-o etapă poate fi cuprins între 2 şi 5 dar atât timp cât spălările nu sunt
făcute într-o manieră „brutală” un număr mai mare de spălări nu poate decât să crească calitatea
tehnicii.

2
Spălarea se poate face manual folosind o pipetă multichannell sau cu un spălător automat
ELISA.
La folosirea spalatorului automat trebuie acordată atenţie deosebită folosirii unor plăci
recunoscute de aparat şi ajustarea setărilor aparatului la tipul de godeuri – cu fundul plat, conic,
rotund.
 Incubarea conjugatului în placă
În funcţie de tipul de ELISA aplicat, adăugarea conjugatului în reacţie presupune legarea
acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific.
Ca şi în etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat prelungirea timpului de
reacţie poate oferii un semnal mai puternic.
o
După incubare, plăcile sunt spălate şi pot fi păstrate la 4 C câteva luni până la adăugarea
substratului cromogen.
 Adăugarea substratului cromogen
Adăugarea substratului cromogen reprezintă o etapă critică în tehnica ELISA deoarece este
etapa în care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este de asemenea prima etapă în
care putem semnala dacă vreo etapă în protocol a fost executată greşit sau unul dintre reactivi nu
funcţionează.
Substratul cromogen este adăugat în godeuri şi placa este incubată la întuneric o anumită
perioadă de timp, în funcţie de caracteristicile enzimei şi ale substratului, şi reactia este oprită
prin adăugarea unei soluţii de stopare.
Timpul de incubare al substratului cromogen în proba cu conjugatul fixat se determină empiric
prin observarea modificării culorii amestecului de reacţie până la o intensitate comparabilă cu cea
teoretică a produsului final.
Conjugatul poate fi reprezentat de o enzimă cuplată cu straptavidină, o proteină tetramerică
obţinută din bacteria Streptomyces avidinii, ce are o afinitate foarte mare pentru biotină(vitamina
H). Biotina poate fi cuplată prin diverse procedee la un aticorp şi astfel, pe baza afinităţii
streptavidinei pentru biotină, conjugatul se poate cupla la anticorpul biotinilat fără a fi nevoie de
un conjugat enzimă-anticorp specific. Această procedură este deosebit de importantă în cazul
tehnicilor ELISA sandviş în care se dispune de o cantitate mică de anticorpi monoclonali,
folosirea complexului stravidină-biotină amplificând sensibilitatea analizei de 2-5 ori.
Deşi această incursiune presupune adăugarea de paşi la protocolul iniţial, efortul este unul
recompensat printr-o imbunătăţire considerabilă a sensibilităţii analizei.

 Interpretarea rezultatelor
Constă în aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciază mai întâi vizual, pentru
determinarea virării de culoare după adăugarea substratului şi stabilirea timpului de menţinere a
lui până la stoparea reacţiei.
Densitatea optică a fiecărei probei se apreciază la stectrofotometru, la o lungime de undă
corespunzatoare.
Aprecierea rezultatelor se face prin două metode :
1. Metoda calitativa de apreciere a pozitivităţii probelor, prin calcularea valorilor prag (cut off)
faţă de care se raportează absorbanţa fiecărei probe. Această valoare este determinată
corform formulei:
CO=X+ 2 DS

3
unde CO este valoarea prag (cutt off), X – media valorilor negative, DS este deviaţia
standard. Probele cu valoarea absorbanţei sub limita prag sunt considerate negative iar cele
peste această valoare sunt considerate pozitive.
2. Metoda cantitativa presupune folosirea unor probe standard, de concentraţii cunoscute,
cu ajutorul cărora se trasează o curba standard. Aceasta se realizează prin introducerea
concentraţilor probelor standard pe axa X a unui grafic, a valorilor densităţilor optice
respective pe axa Y şi stabilirea punctelor de intersecţie. Curba standard se defineşte ca
cea mai apropriată ecuaţie liniară care să intersecteze cât mai multe din punctele de pe
grafic.
Folosindu-ne de valorile cunoscute putem extrapola o funcţie, a relaţiei dintre densitatea
optică şi concentraţia probei, prin regresie liniară. Ecuaţia obtinută fiind de forma:
DO=C*k + DO0
unde DO este densitatea optică a probei, C – concentraţia probei, k – constanta, DO0 –
valoarea absorbanţei la o concentraţie a probei egală cu 0.
Valoarea lui DO0 poate fi calculată în orice program de calcul computerizat printr-o funcţie
ce returnează valoarea unei curbe în punctul de intersecţie cu axa Y. În Microsoft Excel
putem folosi funcţia INTERCEPT având ca parametri pe de-o parte valorile concentraţiilor
probelor standard şi pe de altă parte valorile densităţilor optice respective.
După calcularea lui DO0 putem afla valoare lui k şi de aici prin rezolvarea ecuaţiei obţinem
formula de calcul a concetraţiei probelor în funcţie de valoarea densităţii optice :
C = (DO - DO0)/k

3. CLASIFICAREA TEHNICILOR ELISA

Datorită multiplelor aplicaţii ale metodei imunoenzimatice ELISA, au aparut diferite


protocoale pentru executarea acesteia în funcţie de particularitaţile moleculei de determinat şi
de modul în care procesele fundamentale ale metodei ELISA se desfasoara.
O prima clasificare a tehnicilor ELISA se poate face referitor la modul de fixare al
anticorpului la antigenul de captura, astfel facandu-se distincţia intre fixare competitiva şi
necompetitiva.
O altă clasificare se face în funcţie de modul direct sau indirect în care conjugatul se
fixează de antigenul sau anticorpul de captura.
O categorie separată de tehnici ELISA o reprezintă tehnicile sandviş, în care un antigen
este prins intre 2 sau chiar 3 anticorpi, dintre care primul este cel de captură şi ultimul este
cel din conjugat.
Tehnica ELISA celulara, denumită de unii autori şi cELISA reprezintă o determinare în
care antigenul sau anticopul fie el de determinat sau de captură este o moleculă exprimată la
suprafaţa membranei celulare

Tehnici ELISA folosite curent


ELISA INDIRECTĂ
Această tehnică este utilă pentru determinarea concentraţiei anticorpilor serici sau din
supernatantul celulelor de tip hibridoma. Metoda se pretează situaţilor în care cantitaţi de ordinul
miligramelor din antigenul purificat sau semipurificat sunt disponibile.
Protocolul presupune fixarea antigenului pe fundul placilor de microtitrare şi blocarea situsurilor
de legare nespecifică, incubarea soluţiilor de testat şi spalarea anticoprilor necuplati din placă

4
după incubare. Soluţia de conjugat (conjugat enzimă-anticorp anti-anticorpul de determinat) se
adaugă în reacţie, se incubează şi o noua etapă de spalare inlatură conjugatul nefixat din placă.
Se adaugă substratul cromogen şi după parcurgerea timpului de incubare reacţia este stopata.
Cantitate de substrat descompus de enzimă este determinată prin citire la spectrofotometru.
Valorile densitaţilor optice vor fi direct proporţionale cu cantitatea de anticorpi din soluţia testata.

ELISA COMPETITIVA DIRECTA


Această tehnică se poate folosii pentru a detectarea calitativa şi cantitativa a antigenelor
solubile şi este indeosebi utilă cand atât antigenul cât şi anticorpii specifici sunt disponibil în
cantitaţi de ordinul miligramelor.
Protocolul presupune fixare antigenului de captură pe fundul placii şi adaugarea în acelaşi timp a
conjugatului enzimă-anticorp specific şi a soluţiei de testat care contine antigene solubile.
Cuplarea conjugatului la antigenul de captură este inhibată de cuplarea la antigenul solubil. După
incubarea cu amestecul de conjugat şi antigen solubil inhibitor, reactanţii nefixati sunt indepartaţi
prin spalare. Se adaugă subtratul cormogen şi după incubare reacţia este stopata. Cantitatea de
antigen din soluţia de testat este direct proporţională cu gradul de inhibare al transformarii
substratului şi poate fi cuantificat prin intrapolare pe o curba de inhibare generată prin realizarea
unor diluţii seriale ale soluţiei standard de antigen.

ELISA SANDVIŞ
Tehnicile care folosesc principiul anticorpi-sandviş ar putea reprezentă unele din cele mai utile
determinari imunoenzimatice pentru determinare antigenelor deoarece frecvent oferă o
sensibilitate de 2-5 ori mai mare decat alte tehnici de determinare a antigenulei
Protocolul presupune folosirea unor anticorpi specifici de captură fixaţi pe placa de microtitrare
peste care se adaugă soluţiile de antigen de testat. După incubare antigenul nelegat este
inlaturat prin spalare iar în placă se adaugă soluţia de conjugat(conjugat enzimă-anticorp specific
pentru alt epitop al antigenului), etapă căreia ii urmează o noua incubare. Conjugatul nelegat este
inlaturat prin spalare. Se adaugă substratul cromogen şi după parcurgerea timpului de incubare
reacţia este blocata. Cantitatea de substrat hidrolizat este direct proportională cu cantitatea de
antigen din soluţia de testat.

ELISA DUBLU-SANDVIŞ
Tehnică folosită în special pentru detectarea anticorpilor specifici în cazul în care se dispune de
o cantitate mică de anticorp specific şi nu se dispune de antigen purificat. Tehnica se poate folosi
şi pentru investigarea poziţiei epitopilor diferiţilor anticorpi monoclonali formaţi impotriva unui
antigen comun.
Suportul solid este acoperit cu anticorpi anti-imunoglobulina (imunoglbulina provenită de la
speciile imunizate). Soluţia de anticorpi de testat se incubează în placă şi la sfarsit anticorpii
nelegaţi sunt inlaturaţi prin spalare. Se adaugă soluţia de antigen şi se incubeaza. După incă o
etapă de spalare se adaugă conjugat enzimă-antigen specific şi se incubează din nou.
Conjugatul nelegat este indepartat prin spalare şi se adaugă substratul cromogen.
Probele din godeurile în care apare reacţia de culoare sunt desemnate posibil pozitive adică ar
putea să conţina anticorpi specifici. Verificarea rezultatelor fals pozitive sau a probelor cu o
pozitivitate incertă se poate face prin retestarea probelor respective. Probele vor fi lucrate în patru
exemplare în godeuri în care s-a fixat anticorpul de captura. în doua dintre godeuri se va adaugă
antigenul iar în celelalte doua doar un tampon de blocare. în toate cele patru godeuri se continua
cu adaugarea conjugatului şi a substratului cromogen. Placile vor fi citite după o ora. Acestă

5
procedură va elimina rezultatele fals pozitive obtinute pe fondul reacţiei dintre anticorpii de testat
cu anticorpii din conjugat.
Pentru a distinge rezultatele pozitive dar cu o concentraţia mică de anticorpi specifici placile pot fi
citite din nou după cateva ore sau zile de la adaugarea substratului cromogen.

ELISA CELULARĂ DIRECTA


Tehnica este folosită pentru evaluarea prezenţei antigenelor sau a receptorilor de suprafaţa pe
membrana celulelor de testat folosind anticorpi existenţi sau alţi liganzi specifici antigenelor
membranare.
Protocolul presupune determinarea densitaţii optime a suspensiei celulare per godeu prin analiza
intersectată a diluţiilor seriale şi obţinerea suspensiei celulare prin centrifugare şi resuspendare în
volumul determinat. Un volum fix de suspensie celulară este adaugat în godeurile placii de
microtitrare, placa este centrifugată şi supernatantul este inlaturat. Etapele urmatoare presupun
desprinderea butolunul celular şi resuspendarea celuleror în conjugatul enzimă-anticorp specific
anti-molecule membranare. După incubare placile sunt centrifugate şi conjugatul nelegat este
inlaturat printr-o spalare blanda. La acest moment se adaugă substratul cromogen.
In timpul etapelor de incubare în prezenţa conjugatului sau a substratului cromogen placa va fi
agitată usor la interval de 15 minute pentru a asigură o buna interacţiune intre reactanţi.
Nivelul de exprimare antigenică la suprafaţa celulară este direct proporţional cu nivelul de
transformare a substratului.
Celulele eucariote secretă cantitaţi variabile de fosfatază alcalina cea ar putea interfera în tehnica
ELISA din această cauză o evaluare a cantitaţii de fosfatază alcalina exprimată de celulele de
testat va fi efectuată intr-un experiment preliminar. Dacă celulele secretă fosfatază alcalina la un
nivel ce ar putea interfera cu protocolul de analiza, enzimă din conjugat va fi inlocuită cu o alta,
cum ar fi β-galactozidaza.
Celulele folosite pot fi fixate inainte de analiză dar numai dacă se poate demonstra că celulele
fixate işi pastrează antigenicitatea membranare. Fixarea se poate face prin suspendarea celulelor
intr-o soluţie de glutaraldehidă 0,5% timp de 30 de minute şi spalare ulterioare.
Această tehnică poate fi la fel de sensibilă ca şi citometria în flux în cuantificarea nivelului de
exprimare antigenică al unei populaţii celulare dar spre deosebire de metoda citometrică această
metoda nu face distinctia intre populaţiile celulare şi prin urmare nu poate fi aplicată unei populaţii
heterogene de celule.

ELISA CELULARĂ INDIRECTA


Această tehnică este concepută pentru detectarea anticorpilor specifici impotriva antigenelor
mebranare.
Anticorpii anti-antigene membranare sunt detectaţi prin incubarea celulelor cu o soluţie de
anticorpi primari de testat. După centrifugare şi spalare pentru inlaturarea anticorpilor nelegaţi,
celulele sunt incubate cu o soluţie de conjugat enzimă-anticorp secundar(anticorp anti-anticorpul
primar). Placile sunt centrifugate şi conjugatul nelegat este inlaturat prin spalare. Se adaugă
substratul cromogen.
Cantitatea de anticorpi primari din soluţia de testat este direct proporţională cu cantitatea de
substrat transformat.

6
4. MATERIALE ŞI REACTIVI NECESARI în TEHNICA ELISA

Tehnicile ELISA, indiferent de tipul folosit, necesită în general acelaşi set de materiale şi
reactivi, exceptand evident soluţiile de testat şi anticorpii, respectiv antigenele, complementare
care definesc fiecare protocol în parte.

Lista de materiale şi reactivi necesari pentru executarea unei analize ELISA de rutina
MATERIALE:
- pipete automate de volume diferite(1-500ul) şi varfuri corespunzatoare;
- pipetă multichannel şi varfuri corespunzatoare;
- placi de microtitrare corespunzatoare modelului experimental;
- pisetă de plastic;
- spectrofotometru;
- cuve plastic pentru pipeta multichannel;
REACTIVI:
- soluţie agent de developare (conjugat enzimă-anticorp/antigen);
- soluţie antigen;
- soluţie anticorpi de testat;
- TFS (tampon fosfat salin);
- apă distilată sau deionizata;
- substrat cromogen NPP(p-nitrofenil fosfat) sau TMB(tetrametilbenzidina);
- tampon de blocare a legarilor nespecifice;
- soluţie de stopare (NaOH, H2SO4)
- tampon de spalare;
- tampon de fixare a anticorpilor/antigenelor pe placă;
În cazul tehnicilor ELISA celulare(cELISA) la lista de materiale şi reactivi se adauga:
- soluţie de suspensie celulare;
- soluţie de conjugat enzimă-anticorp specific
- tampon de spalare, ţinut pe gheaţa;
- placi de microtitrare cu fundul rotund sau conic;

5. SURSE DE EROARE

Teoretic, orice etapă din protocolul ELISA poate reprezenta o sursa de eroare, dar
studiile au demonstrat că numai o parte din proceduri pot fi considerate ca surse semnificative de
eroare. Aceste proceduri critice sunt pipetarea soluţiei de testat şi a substratului cromogen şi
absorbanţa inerentă a placilor de microtitrare. Acestea sunt totuşi probleme de fineţe pe care le
pot intampina pana şi cei cu experienţa în tehnica ELISA.

7
Urmează o trecere în revistă a condiţiilor de indeplinit şi posibilelor surse de eroare:
 Toţi reactivii şi placile de microtitrare se aduc la temperatura camerei inainte de utilizare;
 Deşi tehnica ELISA nu impune condiţii de sterilitate, sticlaria şi consumabilele (varfuri, cuve,
etc.) trebuiesc să fie cât mai curate şi fară urme de detergenţi;
 Concentraţia reactivului ce urmează a fi adsorbit pe suportul solid trebuie determinată pentru
fiecare cuplu suport-proteina şi pH-ul soluţiei trebuie să fie unul adecvat.
 Blocarea situsurilor de legare nespecifică este o etapă foarte importantă în protocol.
Tamponul de blocare asigură atât saturarea suprafeţei godeului, prevenind astfel fixarea
anticorpilor de detecţie sau a conjugatului de faza solida, cât şi inhibarea legarii anticorpilor
specifici la antigenul/anticorpul de captura.
 Aranjamentul probelor în placă poate influenţa rezultatul determinarii. Pentru un protocol de
mare precizie este bine să lasam marginile placii(randurile A şi H) libere pentru a masura
absorbanţa placii iar probele de control, pozitiv şi negativ, pot fi distribuite aleatoriu în zone
diferite ale placii (Caciagli şi Verderio, 2003).
 Diluţia probei pozitive cercetate trebuie să corespundă unei valori a absorbanţei semnificativ
pozitive.
 Enzima utilizată în conjugat trebuie să aibe o specificitate ridicată şi un randament ridicat în
transformarea substratului. Este de asemenea important ca problele de testat să nu conţina
substanţe care ar putea intefera cu stabilitatea sau activitatea enzimei.
 Concentraţia conjugatului enzimatic trebuie să corespundă celei mai mici valori care asigură
vizualizarea complexului format.
 Pentru rezultate mai bune, probele se lucrează în duplicat sau chiar triplicat. Media valorilor
absorbanţei este folosită pentru determinarea concentratiei probei.
 Manevrarea bruscă a placii sau adaugarea prea rapidă a probelor, tamponului de spalare în
placă poate duce la desprinderea moleculei de captură de pe suportul solid.
 Dacă folosiţi spalatorul automat, asiguraţi-vă că aparatul este potrivit pentru tipul de placă
folosit şi acordaţi atenţie adancimii la care coboară acul de spalare în placă. Setarea
neadecvată a aparatului poate duce la aspirarea anticorpilor de captura, zgarierea fundului
placii sau chiar la stricarea aparatului. Este de preferat să folosiţi spalatorul automat doar în
cazul folosirii unor kituri ELISA cumparate al căror protocol prevede folosirea unui astfel de
aparat. Placile pregatire în laborator pot fi mai sensibile la mecanica spalatorului automat şi
astfel rezultatul protocolului are de suferit.
 In cazul folosirii tehnicii cELISA, etapele de spalare necesită o atenţie deosita. Placile vor fi
mai intai centrifugate la parametrii specificaţi în protocol şi supertanatul trebuie inlaturat cu
grija pentru a nu desprinde butonul celular. Adaugarea tamponului de spalare se va face
intr-un mod bland. La finalul unei etape de spalare, placa va fi agitată pentru desprinderea
butonulu celular şi celulele vor fi resuspendate în reactivul aferent etapei urmatoare.
Tamponul de spalare trebuie să fie tinut pe gheata.
 Concentratia soluţiei de captură va fi invers proporţională faţa de concentraţia teoretica a
soluţiei de testat pentru a prevenii legarea conjugatului sau anticorpilor secundari la
molecula de captura.

BIBLIOGRAFIE

1. Bianchi A.T.J., Moonen-Leusen H.W.M, van der Heijden P.J., Bokhout B.A., The use of a
double antibody sandwich ELISA and monoclonal antibodies for the assessment of
porcine IgM, IgG and IgA concentrations, Veterinary Immunology and Immunopathology,
44, 309-317, 1995

8
2. Caciagli P., Verderio A., Experimental layout, data analysis, and thresholds in ELISA
testing of maize for aphid-borne viruses, Journal of Virological Methods, Volume 110,
Issue 2, Pages 143-152, 30 June 2003
3. Clarck M. F., Lister R.M., Bar-Joseph M., ELISA Techniques, Methods in enzymology, vol
118, 742-766, 1986
4. Eva Engval , Enzyme immunoassay ELISA and EMIT, Methods in enzymology, vol 70, p.
419-439, 1980
5. Heck F. C., Williams J. D., Pruett J. Interpretation of Spectrophotometric Absorbance
Values to Define Results of Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, JOURNAL OF
CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 1980, p. 398-401
6. John Wiley and Sons, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Unit 11.2 in
Current Protocols in Molecular Biology Supplement 34, 1996
7. Kricka L.J., Selected strategies for improving sensitivity and reliability of immunoassays,
Clinical Chemistry, 40, 3, 347-357, 1994
th
8. Kuby J., Goldsby R., Kindt T., Osborne B., Immunology , 5 edition, 2003
9. Le Goff C., Thiaucourt F., A competitive ELISA for the specific diagnosis of contagious
bovine pleuropneumonia (CBPP), Veterinary Microbiology, Volume 60, Issues 2-4, Pages
179-191, 28 February 1998
10. Lequin Rudolf M. , Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA), Clinical Chemistry 51, No. 12, 2005
11. Michael Steinitz, Lea Baraz, A rapid method for estimating the binding of ligands to
ELISA microwells, Journal of Immunological Methods, 238, 143–150, 2000
12. Mire-Sluis A.R., Gaines-Das R., Thorpe R. Journal of Immunological Methods, Volume
186, Issue 2, Pages 157-160, 26 October 1995
13. Olinescu A., Dolganiuc A., Imunologia practica în clinica şi experiment, subcapitolul:
Analiza imunoenzimatica ELISA, pg. 153-157, Ed. Viaţa Medicala Romaneasca,
Bucureşti, 2001
14. Osuchowski M. F., Remick D. G., The repetitive use of samples to measure multiple
cytokines:The sequential ELISA, Methods 38, 304–311, 2006
15. Plebani A., Avanzinia M. A., Massaa M. and Ugazioa A.G., An avidin-biotin ELISA for the
measurement of serum and secretory IgD, Journal of Immunological Methods, Volume
71, Issue 2, Pages 133-140, 6 July 1984
16. Qian W., Yao D., et al., Immobilization of Antibodies on Ultraflat Polystyrene Surfaces,
Clinical Chemistry 46: 1456-1463, 2000
17. Satoh A., Kojima K., Koyama T., Ogawa H., Matsumoto I., Immobilization of Saccharides
and Peptides on 96-Well Microtiter Plates Coated with Methyl Vinyl Ether–Maleic
Anhydride Copolymer, Analytical Biochemistry, Volume 260, Issue 1, Pages 96-102, 15
June 1998
18. Sittampalam S., Smith W.C., et al., Application of experimental design techniques to
optimize a competitive ELISA, Journal of Immunological Methods, 190, 151- 161, 1996
19. Voller A., Bartlett A. and Bidwell D.E., Enzyme immunoassays with special reference to
ELISA techniques, Journal of Clinical Pathology,31, 507-520, 1978
20. Wilco de Jager, Ger T. Rijkers, Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: A
comparison, Methods, Volume 38, Issue 4, Pages 294-303, April 2006
21. Yuzuru Hayashi et al. , An expression of within-plate uncertainty in sandwich ELISA,
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 36, 225–229, 2004