2.3.

ELISA competitive Ac primar (Ac1): Specific pentru Ag de determinat Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):-Specific pentru Fc al Ac1 -Conjugat cu o enzima - 1. Se amesteca proba (ce contine Ag) cu o cantitate cunoscuta de Ac1 - 2. Se pipeteaza amestecul in godeurile pe care a fost adsorbit in prealabil antigen (Ag) - 2 situatii: Exces de Ag Exces de Ac1

Exces de Ac1:
Proba (cu Ag) + Ac1 (in exces) Ag-Ac1 + Ac1 liberi Se pipeteaza amestecul in godeuri a caror suprafata inferioara contine antigen (Ag) adsorbit Ac1 liberi se vor lega specific de Ag fixate de suprafata godeului complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ag-Ac1 libere Se adauga anticorpul secundar conjugat cu o enzima (Ac2-E) in godeuri fixe Se spala Ac2-E liberi Se adauga substratul (S) colorarea mediului de reactie este proportionala cu cantitatea de Ag din proba Se citeste la spectrofotometru complexe Ag-Ac1-Ac2-E

Exces de Ag:
Proba (cu Ag in exces) + Ac1 Ag-Ac1 + Ag libere Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat) nu se formeaza complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ag-Ac1 libere si Ag libere Se pipeteaza anticorpul secundar conjugat cu o enzma (Ac2-E) in godeuri nu se formeaza complexe Ag-Ac1-Ac2-E fixe Se spala Ac2-E liber (tot Ac2-E) 1

Se adauga substratul (S) nu are loc nicio reactie incolor

Metode imunologice de investigare a proteinelor 3. Western blotting (Imunoblotting

metoda foarte sensibila de identificare a proteinelor: 10-12 g proteina 1. Un amestec de proteine care contine si proteina de interes este separat cu ajutorul SDSPAGE 2. Transferul proteinelor de pe gel pe o membrana, prin presare, pentru a face proteinele mai accesibile identificarii. Membrana: polifluorura de viniliden (PVDF) sau nitroceluloza Tipuri de transfer: - Capilaritate - Electroblotting: metoda frecvent utilizata, care foloseste curentul electric pentru a transfera proteinele din gel pe membrana, astfel incat proteinele isi mentin asezarea pe care au avut-o in gel.

3. Blocarea legarii nespecifice la membrana a anticorpului primar Pentru a preveni legarea nespecifica la membrana a anticorpului primar ce urmeaza a fi adaugat, membrana este incubata cu o solutie diluata de proteina ce se va atasa la membrana in toate locurile in care nu sunt legate proteinele transferate. Astfel, cand anticorpul va fi adaugat, el se va lega specific doar de proteina de interes si nu nespecific de membrana. Blocarea se face cu: 5% solutie de lapte degresat sau 5% solutie cu albumina serica bovina Tamponul solutiei: Ex. PBS + 0.1% Tween-20 sau Triton-X-100 agitare lenta, 1.5 h, temperatura camerei 4. Adaugarea anticorpului primar (monoclonal sau policlonal) - care recunoaste proteina de interes Ex: Proteina: insulina de la soarece 2

Anticorp primar: anti-insulina de la soarece, produs in iepure (policlonal - care recunoaste un tag specific in cazul unei proteine care are atasat un tag Ex: Proteina-tag: FLAG-insulina Anticorp primar: anti-FLAG, produs la soarece (monoclonal) Cantitate: in general 0.5 5 g/ml Acelasi tampon folosit si pentru blocarea legarii nespecifice Conditii de incubare: 12-18 h la 40C, dar posibil si 1,5 h la tc, incubarea membranei se realizeaza sub agitare usoara Optional: folosirea unui anticorp primar control In solutie se poate introduce alaturi de anticorpul primar si un anticorp primar control specific unei proteine exprimate in toate celulele organismului ( housekeeping ) de tipul bactina, a-tubulina, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza. Alternativ, membrana se incuba cu anticorpul control intr-un experiment separat, dupa indepartarea anticorpului primar si secundar de pe membrana. 5. Spalarea membranei pentru a inlatura anticorpul primar care nu s-a legat (Ex. PBS) 6. Adaugarea anticorpului secundar - Acesta este un anticorp anti specia in care a fost produs primul anticorp - Prin adaugarea lui, mai multi anticorpi secundari vor fi legati de un anticorp primar, crescandu-i astfel semnalul - Anticorpul secundar este de obicei cuplat cu biotina sau o enzima reporter de tipul fosfatazei alcaline (alkaline phosphatase, AP), peroxidazei din hrean (horseradish peroxidase, HRP) - Incubarea se realizeaza in acelasi tampon ca si anticorpul primar, 1h, tc, agitare usoara Proteina: insulina de la soarece Anticorp primar: anti-insulina de la soarece, produs in iepure Anticorp secundar: anti-iepure conjugat cu HRP (AP, biotina etc.) Proteina-tag: FLAG-insulina Anticorp primar: anti-FLAG, produs in soarece Anticorp secundar: anti-soarece conjugat cu HRP (AP, biotina etc.) 7. Spalarea membranei pentru a inlatura anticorpul secundar care nu s-a legat (Ex. PBS) 3

8. Analiza benzilor de interes a. Detectia colorimetrica (cromogena) cu ajutorul unui substrat ce reactioneaza cu o enzima reporter cuplata cu anticorpul secundar. Substratele fosfatazei alcaline (AP): NBT (nitroblue tetrazolium ) BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolil fosfat) Substratul peroxidazei: diaminobenzidina (DAB) - Enzima converteste substratul dintr-o forma solubila intr-o forma insolubila de culoare diferita, care precipita langa enzima si coloreaza specific membrana. - Reactia este stopata prin spalare, blotul este developat, iar nivelul de proteina este evaluat prin densitometrie (cat de intensa este banda corespunzatoare proteinei de interes) sau spectrofotometrie. b. Detectie fluorescenta c. Detectie radioact d. Detectia chemiluminiscenta. HRP conjugata cu anticorpul secundar scindeaza un agent chemiluminiscent (substratul HRP), rezultand un produs luminiscent, a carui intensitate este proportionala cu cantitatea de proteina prezenta. Lumina generata in urma acestei reactii este detectata cu ajutorul unui film presat pe membrana. Imaginea corespunzatoare benzii de interes este analizata prin densitometrie, care evalueaza cantitatea de proteina detectata

4. Imunofluorescenta / Imunohistochimie Evidentierea localizarii celulare si a functiei proteinei de interes: 1. Anticorpi marcati fluorescent Examinare prin microscopia de fluorescenta. Acest tip de microscopie poate defini pozitia antigenilor cu o rezolutie de 200 nm a. Proteine cu taguri fluorescente - proteina verde fluorescent (Green Fluorescent Protein, GFP), proteina natural fluorescenta, izolata din Aequorea victoria Receptorului pentru steroizi ii este atasat un tag GFP.

Folosind GFP se poate vedea localizarea celulara a receptorului pentru hormonul steriod prin imunofluorescenta in culturi de celule. In absenta hormonului, receptorul este localizat in citoplasma. La adaugarea hormonului corticosteron, receptorul se muta in nucleu. b. Folosirea unui anticorp secundar conjugat cu un marker fluorescent 1. Culturi de celule, preparate histologice fixate 2. Spalare (PBS) 3. Blocarea legarii nespecifice a anticorpului primar ce urmeaza a fi adaugat cu un tampon ce contine: PBS + 10% ser fetal bovin (sau albumina serica bovina), optional Triton X-100 1. Incubare cu anticorpul primar care recunoaste proteina de interes, 12-18 h, 40C 2. Spalarea excesului de anticorp primar (PBS) 3. Incubare cu anticorpul secundar anti specia in care a fost produs primul anticorp, conjugat cu un marker fluorescent (FITC, TRITC, Cy, Alexa), 1h, tc 4. Spalarea excesului de anticorp secundar (PBS) 5. In cazul culturilor celulare: vizualizare la microscopul fluorescent In cazul preparatelor histologice: acoperirea cu 50% glicerol sau marcarea nucleilor cu DAPI si acoperirea lamelor cu lamele, urmata de vizualizarea la microscopul fluorescent. - Colocalizare: 2-3 anticorpi primari si 2-3 anticorpi secundari conjugati cu tipuri diferite de markeri fluorescenti 5. Imuno electromicroscopie Anticorpi conjugati cu nanoparticule de aur coloidal sau feritina Examinati cu ajutorul microscopiei electronice Acest tip de microscopie poate defini pozitia antigenilor cu o rezolutie de 10 nm Determinarea localizarii celulare a unei proteine de canal din alcatuirea veziculelor membranare a sinapselor neuronale. Particulele opace sunt clustere de atomi de Au cu care sunt conjugati anticorpii ce recunosc proteina de canal.

6. Imunoprecipitare Reprezinta o tehnica de izolare a proteinelor si a complexelor proteice Proteinele fuzionate cu epitopi tag (FLAG, HA, c-myc, V5) pot fi purificate prin afinitate si imunoprecipitate folosind anticorpi foarte specifici anti-epitop. Consta in urmatoarele etape: 1. Pregatirea probelor care contin antigenul (Ex: Liza celulara). 2. Legarea unui antigen specific (proteina fuzionata cu tag epitop, ex: FLAG) de un anticorp (anticorp anti-epitop, ex: anti-FLAG) 3. Precipitarea complexelor Ag-Ac 4. Spalarea precipitatelor 5. Disocierea antigenelor (proteina fuzionata cu tag epitop) de complexul imun