Reacia de polimerizare n lan - PCR

Tehnica Real Time

Reacia de polimerizare n lan este o tehnic utilizat n biologia

molecular pentru a amplifica una sau cteva copii ale unui segment ADN n mai
multe mrimi, genernd mii pn la milioane de copii ale unei secvene ADN
particulare. Produsul amplificat (denumit amplicon) este apoi detectat prin diverse
metode.
Aceast metod este una simpl i necostisitoare i este folosit n
diagnosticul molecular al bolilor genetice i al predispoziiei ereditare la bolile
comune.

Fragmentul ADN este introdus ntr-un tub care conine reactivii:

- o ADN-polimeraz termostabil Taq, aceasta fiind extras din bacteria
Termus aquaticus
- 4 dezoxiribonucleotide sintetice primeri.

Primerii constituie punctele la nivelul crora se iniiaz activitatea ADN-

polimerazei. Proba este denaturat termic, primerii hibridizeaz cu secvenele
complementare i pornind de la primeri ADN-polimeraza ncepe s adauge
dezoxiribonucleotide n sensul 5-3 pe matriele reprezentate de monocatenele
segmentului int. Rcirea duce la hibridizarea acestuia cu secvenele noi, iar
renclzirea mediului determin iniierea unei noi reacii de polimerizare.
Efectuarea metodei PCR impune o condiie cea a cunoaterii secvenelor
de nucleotide cu care primerii trebuie s fie complementari.
 Amplificarea se realizeaz ntr-un analizator special, numit thermoycler, iar
amestecul de reacie trebuie sa conin elementele:

- ADN sau ARN int extras din prob;

- ADN-polimeraza Taq pentru o int ADN sau RTth ADN-polimeraza
pentru o int ARN;
- cofactori enzimatici;
- primeri, acetia fiind secvene scurte, monocatenare, cu lungimea
maxim 20-30 nucleotide, care se leag de o matri monocatenar prin
mperecherea complementar a bazelor; primerii marcheaz nceputul i
sfritul regiuni care trebuie s fie amplificat;
- deoxinucleotide, folosite pentru sinteza noii catene ADN;
- amperaza, este o enzim care promoveaz amplificarea selectiv a
intei i distrugerea produilor de contaminare din cursul reaciilor de
amplificare anterioare.

Reacia PCR se desfoar n 3 etape: denaturarea, hibridizarea primerilor

i elongaia.
Procesul de amplificare poate fi divizat n 3 faze: exponenial, linear i
platou.
Metodele PCR convenionale au la baz o detecie a produilor PCR n faza
de platou a procesului. Recent, tehnologia PCR a fost revoluionat prin
dezvoltarea metodelor de detecie n faza exponenial detecie n timp real,
Real-Time PCR.
 Tehnica Real-Time PCR

Amplificarea unui fragment ADN int poate fi urmrit n timp real prin
introducerea n amestecul de reacie a unor fluorocromi, compui fluoresceni care
emit cuante de energie la anumite lungimi de und. Aceast tehnic permite
cuantificarea cantitii iniiale a fragmentului ADN int dintr-o prob.
Marcarea specific fluorescent a ADN se poate realiza prin mai multe
metode, cea mai simpl metod fiind folosirea unui fluorocrom care se intercaleaz
ntre bazele azotate ale ADN, astfel intensitatea fluorescenei crescnd direct
proporional cu acumularea ampliconilor n timpul reaciei PCR.
Reacia Real-Time PCR se desfoar n 4 faze:
1. Faza liniar dureaz aproximativ 10-15 cicluri, n funcie de cantitatea
de ADN iniial i/sau nivelul de exprimare al genei int, fluorescena emis nu
depete valoarea zgomotului (background);
2. n faza exponenial timpurie, nivelul fluorescenei atinge un prag care
depete considerabil nivelul background-ului. Ciclul la care fluorescena
ampliconului depete acest nivel se numete threshold cycle (Ct sau CP).
Valoarea Ct este invers proporional cu cantitatea iniial de ADN int din proba
de analizat;
3. n timpul fazei exponeniale (logaritmic liniar), cantitatea de amplicon
se dublez la fiecare ciclu n condiii optime;
4. n faza de platou, reactanii devin limitai i msurarea fluorescenei nu
se mai justific.
 Avantajele metodei Real-Time PCR

Metoda Real-Time PCR devine una dintre cele mai populare metode, att
n diagnosticul clinic, ct i n cercetrile tiinifice, i prezint urmtoarele
avantaje:
- acuratee mai mare a rezultatelor obinute, efectuarea deteciei se
realizeaz n faza precoce a reaciei, n faza de cretere exponenial a
amplificrii, atunci cnd se produce o dublare exact a cantitii de
amplicon la fiecare ciclu; detecia n acest moment este optim deoarece
rezultatele se coreleaz mai bine cu nivelul iniial al ADN int,
comparativ cu tehnica PCR convenional, unde detecia are loc n faza
de platou, dup ce reacia s-a sfrit, iar produii au nceput s se
degradeze;
- domeniul de linearitate foarte extins;
- limita inferioar de detecie mbuntit, se pot detecta cantiti mici
ale ADN int.
Bibliografie

1. Nahaba V., Balan G., Popa M., Popescu V., 2009, Metode molecular
genetice de cercetare n diagnosticul de laborator la infeciilor, Centru
Editorial-Poligrafic Medicina, Chiinu
2. Popescu A., 2014, Genetic uman i medical-Principii i metode de
laborator, Ed. Universitii din Piteti
3. https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
4.http://www.bio.unibuc.ro/pdf/micro/documente_de_studiat/Cap3-
3_Tehnologia_PCR.pdf
5. http://irasm.ro/events/ev_rom/RT_PCR.pdf