Tema 7 Bacteriofagul.Genetica.

1) Bacteriofagul.Natura.Caractere.
Bacteriofagi sunt numite virusurile ce infecteaz bacteriile. Un virus este un
organism (o unitate genetic) care nu are structur celular, nu posed metabolism
propriu i este capabil s se reproduc doar n celula-gazd. Bacteriofagii sunt
parazii intracelulari obligatorii ale celulelor bacteriene. Toate
bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi. In majoritatea cazurilor, un fag
anumeinfecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei
tulpini -specificitatea fagului. Aceast specificitate de infecie este determinat de
prezena receptorilor pentru acest fag la suprafaa
bacteriei-gazd.
Structura bacteriofagului
Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor.
1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar, linear sau circular).
2. Inveli proteic numit capsid, cu rol de protecie a materialului genetic. Prin
receptorii de la suprafa contribuie la infecia gazdei.
3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, endolizina).
Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntroordine distinct, conferind forma fagului.
Exist 3 forme morfologice principale de fagi:
Fag icosaedric: are form sferic constituit din 20 fee triungiulare, 30 muchii i
12 vrfuri (simetrie cubic a capsidei).
Fag cilindric: reprezint bastonae proteice formate din capsomere, asamblate
ntr-o structur tubular (simetrie helicoidal a capsidei).
Fag complex: este constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal.
Coada este format din doua tuburi concentrice, un tub intern rigid - canalul axial,
care este inconjurat de teaca cozii, un manon contractil. Gulerul cozii (colul) se
afl la jonciunea capului cu coada. a. La partea distal a cozii se afl o plac
hexagonal, placa bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i ofibr. Ele
reprezent sistemul de fixare a fagului pe bacteria receptoare i contribuie la
injecia materialului
genetic n celul.
Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii coada scurt, sau far coad. Exist i fagi filamentoi.
2)Etapele interactiunii bacteriofagului virulent cu celula bacteriana>Fagii
moderati.Profagul.Lizogenia.
Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei
pot duce la doua
tipuri de infecii:
Infecie litic: determinat de fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare
bacteria infectat este
lizat elibernd fagii nou-formati.
Infectie nelitica sau lizogen: determinat defagii temperai (moderai). Ei
infecteaz bacteriile
fr a le distruge.
INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului virulent)
Adsorbia. Dupa o ciocnire intmpltoare, fagul se fixeaz prin intermediul plcii
bazale (la inceput
prin fibrele sale, apoi prin croete) de un receptor specific la nivelul peretelui celular
bacterian
(uneori flageli sau pili).

Penetrarea. Dup fixarea ireversibil a fagului pe peretele bacterian, n urma

aciunii unei enzime
(ex. lizozim) care perforeaz peretele, are loc contracia manonului care apropie
capul de
placa bazal, canalul axial penetreaz membrane citoplasmic a bacteriei i ADN
fagic este injectat
in bacterie.
Expresia genomului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). Dup
penetrarea ADN viral n bacterie (fag vegetativ), timp de aproximativ 12 minute,
virionul nu este depistat n bacteria infectat. Aceasta este faza de eclips. Ea
coincide cu
sinteza enzimelor virale care vor asigura
ulterior: replicarea ADN fagic; sinteza proteinelor fagice; asamblarea acestor
elemente.
Asamblarea fagilor. Odat ce compuii capsidei i acizii nucleici se sintetizeaz n
cantiti suficiente,
are loc asamblarea spontan a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului
nucleic n capsid.
Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup maturizare, sunt eliberai n urma lizei
peretelui bacterian cu
enzime ale bacteriofagului (endolizina)
Timpul dintre infectie i eliberare (ciclul de reproducere) este de 20-60 minute la
37C, fagii sunt
eliberai n valuri de 50-1000 fagi per celul.
INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN :
FAGII TEMPERAI
Fagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o bacterie pot:
- sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la lizabacteriei,
- sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s integreze acest ADN n
cromozomul bacterian prin recombinare specific, formnd un profag (lizogenizare)
- sau sa ramn n citoplasm sub form de plasmid. In ultimele dou cazuri
bacteria nu moare i, multiplicndu-se, replic genomul viral concomitent cu
propriul su genom: bacteria (cultura) este numit lizogen. Ea posed i transmite
descende
3)Metode de izolare a bacteriofagului din materialul examinat.
Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite prelevate umane sau din mediul extern. Fagii
indic prezena bacteriilor sensibile.
IZOLAREA BACTERIOFAGILOR
Prelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etc
I. Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare.
II. Izolare prin metoda de mbogire fr nsmnare materialul de examinat se
inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicarea bacteriile omologe
fagului cutat).Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. In filtrat
s-au acumulat fagii care
s-au inmulit pe contul bacteriilor omologe din prelevat.
III. Izolare prin metoda de mbogire cu nsmnare inocularea prelevatului ntr-o
suspensie bacterian omolog fagului cutat. Cultura bacterian asigur
mbogirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii.
4)Metode de evidentiere a bacteriofagului:OTTo,Furt,Fisher.
1. Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se nsmneaz n gazon
suspensia de bacterii omologe fagului. n continuare se aplic o pictur de filtrat
care conine fag (cutia poate fi nclinat ca pictura s se preling). Cutia se

incubeaz la 37 C timp de 24 ore. Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi

culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului se observ o zon de liz (colonie
negativ de
fag).
2. Metoda FURT
Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz topit i se toarn n cutia Petri.
Suprafaa cutiei se mparte n 4 sectoare. n fiecare sector se nsmneaz n striuri
culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37 c 24 h .Aprecierea: lipsa
creterii bacteriilor ntr-un sector indic prezena fagului omolog.
3. Metoda FISHER
Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel
pot fi nsmnate 10 culturi bacteriene i pot fi indicai concomitent mai muli fagi.
5)Titrarea bacteriofagului in medii lichide dupa Appelman:
Este utilizat pentru determinarea numrului de fagi viruleni n prelevat sau
cultur.
APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de fag (10-1.....10-10) n bulion
peptonat se adaug suspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore
de incubare la 37 C se apreciaz titrul fagului: diluia maxim a fagului care nc
mai provoac liza bacteriilor
(mediu clar).
6) Aplicarea practica a bacteriofagului.Fagoidentificarea si fagotipajul
microorganismelor.
n domeniul therapeutic:- Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase
n domeniul diagnostic- Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene
necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc).
Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai
specii (subdivizarea speciei n lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de
Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a. Lizotipul reprezint un marker
epidemiologic. Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii
temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei
pot asigura transferul de material genetic prin transducie).
7)Genetica microorganismelor.Particularitatile organizarii materialului
genetic la bacteria.Plasmidele,functiile lor genetice .Genotip.Fenotip
Materialul genetic al celulei bacteriene:
1. Cromosomul
2. Plasmidele
Modificarea patrimoniului genetic al bacteriilor are importan major n
bacteriologia
medical, deoarece ea poate cauza modificri n potenialul patogen al bacteriilor
sau sensibilitatea lor la antibiotice.

Organizarea materialului genetic la bacterii : Genomul bacterian este alcatuit din repliconi, care sunt
formatiuni genetice ce se pot replica independent. Acestea sunt cromozomul bacterian, elementele genetice
extracromozomiale (plasmidele si genomul bacteriofagilor) si elementele genetice transpozabile (fragmentele de
insertie si transpozonii).

Cromozomul bacterian :

Majoritatea genelor bacteriene se gasesc intr-un cromozom haploid,

echivalent nuclear care codifica informatiile absolut necesare supravietuirii speciei in conditii normale.
Pe langa dispozitia dublu spiralata spre dreapta a catenelor de ADN, acestea sufera o suprahelicare spre stanga.
Acest mod de organizare denumit "supercoil" sau "supertwist" asigura pe de o parte "impachetarea" economica a
ADN si pe de alta parte o configuratie optima activitatii functinale a ADN (replicare, transcriptie, recombinare).

Plasmidele Plasmidele sunt molecule circulare de ADN autonome, extracromozomiale, libere in citoplasma care
se replica independent de cromozom.. Plasmidele pot fi:
conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezistenta la antibiotice
neconjugative, care nu pot parasi ele insasi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ
sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifica secretia de beta-lactamaza la S.aureus)
episomi, care se pot integra prin recombinare in cromozomul bacterian, pierzandu-si astfel autonomia de replicare.
Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau factorul de fertilitate).

8 Variabilitatea caracterelor principale ale microorganismelor.Variabilitatea dirijata si

importanta ei practica.
Variabilitatea la bacterii este cea care intereseaza medicina in mod deosebit. Variabilitatea este : aparitia unor
caractere diferite de cele ale genitorilor
Importanta variabilitatii dirijate:Modificarea materialului ereditar la bacteriilor da nastere unor tulpini bacteriene noi
care, prin virulenta si rezistenta la chimioterapie, se adapteaza mai bine conditiilor de mediu si inlocuiesc bacteriile
mai putin adaptabile.
Suportul material al ereditatii este ADN. Structura si replicarea acestuia este similiara cu cea de la celulele
eucariote.

9) Mutatiile spontane,induse.Fcatorii mutageni.

I. MUTAII
1. Substituia unei nucleotide cu alta n timpul replicrii ADN
2. Deleia, inseria sau inversarea unor nucleotide ntr-o gen.
Frecvena mutaiilor 10-6 10-10 pentru un caracter anumit. Modificrile
determinate de mutaii (ex.: rezistena la AB) se transmit la descendeni
(transmitere vertical). Unele mutaii pot fi reversibile.
10)Transferul de material genetic si recombinarea.
TRANSFERUL DE MATERIAL GENETIC
Materialul genetic poate fi transferat de la o bacterie la alta (transmitere orizontal).
Trei mecanisme de
transfer sunt posibile:
Transformarea Fragmente de ADN (eliberate n urma lizei bacteriene) pot penetra n
alte bacterii i se pot integra prin recombinare n ADN-ul lor. Este necesar ca
bacteria care accept materialul genetic s se afle ntr-o stare particular, de
competen. Transformarea se poate realiza doar n cadrul bacteriilor de aceeai
specie sau din specii nrudite
Transducia
Transferul de material genetic se realizeaz prin intermediul bacteriofagilor
moderai. n momentul
exciziei profagului din cromosomul bacterian el devine virulent, multiplicndu-se i
liznd bacteria
gazd. n cursul acestui proces fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din
eroare n particulele virale, care la rndul lor se pot integra prin recombinare n
cromosomul altei bacterii acest
proces reprezint transducia. Transducia poate fi specializat i generalizat
C. Conjugarea
Mecanismul cel mai frecvent n natur. Este un transfer de ADN (plasmide
conjugative) de la o bacterie donor ctre o bacterie receptor. Bacteria donor

exprim pe suprafaa sa structuri ce permit contactul dintre celule (pili F). n timpul
conjugrii plasmida se replic i o
copie trece prin intermediului pilului F n bacteria receptor. Transferul se efectueaz
ntre bacteriile de
aceeai specie, dar i ntre specii diferite. Multiple gene de rezisten la AB sunt
localizate n plasmide i prin conjugare se asigur caracterul epidemic al rezistenei
la AB.Plasmida conjugativ poate asigura transferul unei plasmide neconjugative
sau al unor gene cromosomale (prin integrarea plasmidei n cromosom)
RECOMBINAREA
1. Recombinarea generalizat (schimb de ADN ntre 2 secvene corespunztoare)
2. Recombinarea specific (integrarea sau excizia unei secvene de ADN, ex:
plasmid, bacteriofag)
3. Transpoziia
Elementele transpozabile reprezint secvene de ADN cu lungime variabil, flancate
de secvene repetate inversate. mperecherea acestor secvene permite excizia lor
i renserarea n alt loc al cromosomului sau plasmidei. Unele elemente, numite
transpozoni, conin gene suplimentare (frecvent gene de rezisten la
AB).Transpoziia duce la rearanjamente genomice. Unii transpozoni,
numii conjugativi, au capacitatea de a trece de la o bacterie la alta
11)Importanta geneticii microorganismelor pentru medicina.Ingineria
genica.
.Importana practic: numeroase gene de rezisten la AB sunt situate pe
transpozoni, ce perimite rspndirea lor. Transpozonii pot trece de la cromosom la
plasmid i ulterior la alte bacterii prin conjugare. Transpozonii conjugativi pot trece
direct la alt bacteria.