Definitie

Cultura de celule - metoda de cretere a celulelor animale si umane n condiii artificiale, in afara actiuniilor sistemice ale organismului

Istoric
1907 Harrison: 1912 Carrel (primii care au folosit metoda pentru studiul comportamentului celulelor animale in afara variatiilor sistemice si a stresului) Metoda la inceput migrarea celulelor din fragmente de tesut nedezagregat (metoda folosita inca timp de 50 ani)

Alte evenimente importante

1916 metode de dezintegrare tisulara cu enzime hidrolitice 1940 introducerea antibioticileor in tehnica de lucru 1952 transplant de nucleu 1955 medii artificiale complexe 1964 celule stem de soarece (pluripotente) 1966 primul factor de crestere (NGF) 1970 aparitia primelor hote cu flux laminar 1976 medii sintetice, fara ser sanguin bovin 1980 dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetica si inginerie tisulara 1998 cultura de celule umane stem 2000+ - proiectul genomului uman

POSIBILE APLICATII

Avantajele studiilor in vitro (in cultura celulara)

Controlul mediului extracelular pH, temperatura, osmolaritate, gaze in atmosfera Componente nutritive Micromediu (celule-celule, celule-MEC) Omogenitatea materialului
Medii selective , clonare

Economie, scara redusa, mecanizare

Caracterizare relativ usoara prin metode imunocitochimice Volum redus, conservare, acces direct la celule, cost avantajos Dispozitive automatizate

Modelarea conditiilor in vitro

Reducerea numarului de animale utilizate

Limitari (dezavantaje)
Control permanent al produsului
Manipulare in conditii sterile Contaminare chimica Contaminare microbiana

Control permanent al mediului

Sterilitatea spatiului de lucru Controlul incubatorului Deseuri periculoase, cu risc biologic

Cantitatea si pretul materialelor si a mediilor de cultura

Materiale de unica folosinta Medii scumpe Ser fetal de vitel

Instabilitatea genetica
Dediferentiere. adaptarea, cresterea necontrolata selectiva

Identificarea dificila a celulelor Diferente majore intre comportamentul in vivo si in vitro

Tipuri de culturi celulare

Dup sistemul de cultur
Celule aderente Celule n suspensie

Dup tipul celulelor din cultur

Celule normale (nedifereniate, epiteliale, conjunctive) Celule tumorale

Dup sursa celular

Celule embrionare i fetale Celule din esuturi adulte (stem sau difereniate)

Dup modul de iniiere

Culturi primare Culturi de linii celulare

Dup dimensiunea culturii

Culturi n condiii de laborator (petri, flacoane, tuburi, placi multicelulare) Culturi la scar industrial (n bioreactoare)

Avantajele si dezavantajele diferitor tehnici de initiere a culturilor de celule

(Ian Freshney, 2005)

BIOLOGIE CELULARA

Structura celulei eucariote animale

NVELIUL CELULAR
Plasmalema membrana celulara (componenta de baz a inveliului celular) Citoscheletul membranar (pe faa citoplasmatic a plasmalemei) Glicocalixul (pe partea externa a plasmalemei, care vine n contact cu matricea extracelular)

NVELIUL CELULAR

PLASMALEMA
Plasmalema - 6-8 nm structura complex i dinamica Principiul de organizare a plasmalemei este comun cu cel al membranelor intracelulare Singer si Nicolson n 1972 descriu membrana celular prin modelul mozaicului fluid lipoproteic

Mozaicul fluid lipo-proteic

Bistrat lipidic n stare de cristal lichid Proteine care strabat in intregime sau parial bistratul lipidic

Compoziia chimic a membranelor celulare

Lipide 52%
Lipide Plasmalema celulei hepatice Plasmalema eritrocitului Teaca de mielina

Fosfolipide Glicolipide Colesterol Alte lipide

54% 7% 17% 22%

60% 3% 23% 13%

42% 28% 22% 8%

Proteine 40%
teaca de mielina - 25% plasmalema 50% membrana interna a mitocondriilor - 75%

Glucide - aproximativ 8%

FOSFOLIPIDELE MEMBRANARE
esteri fosforici ai glicerolului aprox. 60% din totalul lipidelor membranare 2 acizi grasi de 14-24 atomi de carbon, unul nesaturat Capul polar al fosfolipidului poate fi
fosfatidilcolin fosfatidiletanolamina fosfatidilserina fosfatidilinozitol fosfatidilserin

Sfingomielina face parte din clasa fosfolipidelor

GLICOLIPIDELE MEMBRANARE
aprox. 5% din totalul lipidelor membranare; sunt localizate doar n stratul extern al plasmalemei; capul hidrofil alctuit dintr-un radical glucidic; coada - o molecula de sfingozin legat de un acid gras; clasificare:
Glicolipide neutre - gruparea hidrofil este alctuit din unul sau mai multe reziduri glucidice neutre. Cel mai simplu glicolipid galactocerebrozida glicolipid neutru Glicolipide polare (gangliozidele) au o structura complexa. Contin mai multe resturi glucidice (galactoza, glucoza, N-acetilgalactozamina) si unul sau mai multe resturi de acid sialic (acid-N-acetilneuraminic, sau NANA), care confera moleculei o incarcatur electric negativ

STRUCTURA GLICOLIPIDELOR
NEUTRE POLARE

COLESTEROLUL
Molecul specific doar membranelor celulare din lumea animal; Se gsete n proporie de 3-23% din totalul lipidelor membranare; Molecula de colesterol este amfipatica, prezentnd un segment hidrofil (anionul OH), ataat la primul inel sterolic in pozitia C3. Restul moleculei de colesterol poart un caracter hidrofob Aranjamentul specific al moleculelor de colesterol n membrana celular duce la ordonarea i imobilizarea lipidelor, crescnd rigiditatea membranar

Proteinele membranare
In general, continutul proteic al membranelor celulare reflecta intensitatea functionala a structurii din care fac parte Clasificare proteine integrale (intrinseci) - traverseaz integral sau partial dublul strat lipidic, stabilind legaturi puternice cu lipidele a)transmembranare strbat membrana n ntregime, au proprieti amfifile. Au un mijloc hidrofob si extremiti hidrofile b)superficiale - strabat partial membrana (se gsesc doar n unul din straturi). Au un domeniu hidrofil si unul hidrofob proteine periferice (extrinseci) - stabilesc legaturi necovalente cu gruparile polare de pe suprafeele dublului strat lipidic sau cu domeniile extra- si intracelulare ale proteinelor intrinseci. Sunt proteine cu nveli n totalitate hidrofil

Clasificarea proteinelor membranare dup structur

Proteine globulare -rezulta din plierea lanturilor polipeptidice (n general proteinele intergrate n membran)
Proteine fibrilare lanuri polipeptidice liniare (localizate pe superfa ntern sau extern a membranei, alctuiesc structura MEC sau fac parte din citoscheletul membranar)

GLICOCALIXUL
GLICOCALIXUL - zona periferica externa a suprafetei celulare (NVELIUL DULCE AL CELULEI); Alctuit din resturile glucidice ale componentelor stratului extern al plasmalemei (glicolipide, glicoproteine); Se continu cu matricea extracelular (MEC) Funciile glicocalixului: - recunoasterea celulara, - adeziunea intercelular i de substrat, - distributia sarcinilor electrice pe suprafata celulara, - depozite de calciu ionic - depozite de factorilor de crestere tisulara sub form inactiv

CITOSCHELETUL MEMBRANAR
reea proteic fibrilar pe faa intern a plasmalemei; alcatuit n cea mai mare parte din filamente de actina si filamente intermediare; funciile citoscheletului membranar:
determin forma specific a celulei; este implicat n motilitatea celular; formeaz specializrile plasmalemei polului apical (microvili, stereocili, cili vibratili); particip la formarea jonciunulor celulare

FUNCIILE PLASMALEMEI
Transport transmembranar
pasiv, activ, microtransport, macrotransport

Controlul fluxului de informaie

recunoasterea, recepia si transmiterea moleculelor semnal

Funcia enzimatic
cataliza unor reacii specifice intercelulare

Formarea conexiunilor intercelulare i celul-MEC

jonciuni adeziune, comunicare, strnse ancorarea celulelor la matricea extracelulara prin jonctiuni de adeziune i contacte focale

Funciile plasmalemei sunt asigurate de proteinelele membranare

Tipuri de microtransport (sintez)

MACROTRANSPORT Endocitoza, Exocitoza, Transcitoza

SEMNALIZAREA CELULAR

Localizarea receptorilor
Receptori membranari (proteine membranare) Receptori citoplasmatici (proteine-enzime citoplasmatice) Receptori nucleari (proteine reglatoare de gene)

Mecanismele de actiune
Semnalizare prin clivarea componentelor membranare (albastu) Semnalizare prin intermediari membranari si citoplasmatici (verde) Semnalizare prin pasajul moleculei-semnal prin membrana celular n citoplasm i nucleu (galben) Semnalizare direct la nivel de nucleu (rosu)

Receptori membranari

Receptori citoplasmatici

Receptori membranari
Sunt proteine transmembranare Recunosc specific o anumita molecula ligand specific Legatura ligand - receptor se caracterizeaz printr-o afinitate mare o concentraie foarte mica (10-91011 Mol) a ligandului poate fi detectat de receptor i poate declana fenomenele intracelulare de transmitere a mesajului Mecanismele de actiune intacelulare ale receptorilor membranari sunt de tip ionotrop sau chimiotrop

Receptorii membranari
Receptorilor membranari ionotropi leaga un ligand specific, iar legatura ligandreceptor duce la deschiderea unui canal ionic cu modificarea permiabilitii membranare pentru un anumit ion. Acestia sunt canale ionice cu poart

dependent de ligand, care au un situs extracelular specific de recunoatere i legare a unei molecule

Exemple: receptorul nicotinic pentru acetilcolin (Ach) (pt. Na) pentru acidul--aminobutiric (GABA) (pt. Cl) receptorul glutaminic (glutamate analogue N-Methyl-D-Aspartate NMDAr) (pt. Ca) Receptorii chimiotropi sunt proteine membranare cuplate funcional cu proteine de tip G sau alte enzime, care declaneaz reacii intracelulare n cascad, de activare sau inhibiie a altor enzime. Exemple: receptorii cuplai cu proteinele G (receptorul muscarinic pentru Ach, receptorii adrenergici, receptorul serotoninergic, dopaminergici, receptorii opeoizi, hormoni peptidici si altele) receptorii cu acivitate enzimatic (receptorii pentru factorii de cretere tisulara) receptorii asociai cu enzime membranare, altele decat proteinele G (receptori pt. citokine, in particular interleukine -IL

Receptor ionotrop (Canal ionic cu poart acionat de un stimul chimic)

Tipuri de proteine G

Cytokines, Growth Factors and Hormones

SIGMA-ALDRICH

Mecanismul de transductie citoplasmatica