Definitie

Cultura de celule - metoda de cretere a celulelor animale si umane n condiii artificiale, in afara actiuniilor sistemice ale organismului

Istoric
1907 Harrison: 1912 Carrel (primii care au folosit metoda pentru studiul comportamentului celulelor animale in afara variatiilor sistemice si a stresului) Metoda la inceput migrarea celulelor din fragmente de tesut nedezagregat (metoda folosita inca timp de 50 ani)

Alte evenimente importante

1916 metode de dezintegrare tisulara cu enzime hidrolitice 1940 introducerea antibioticileor in tehnica de lucru 1952 transplant de nucleu 1955 medii artificiale complexe 1964 celule stem de soarece (pluripotente) 1966 primul factor de crestere (NGF) 1970 aparitia primelor hote cu flux laminar 1976 medii sintetice, fara ser sanguin bovin 1980 dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetica si inginerie tisulara 1998 cultura de celule umane stem 2000+ - proiectul genomului uman

POSIBILE APLICATII

Avantajele studiilor in vitro (in cultura celulara)

Controlul mediului extracelular pH, temperatura, osmolaritate, gaze in atmosfera Componente nutritive Micromediu (celule-celule, celule-MEC) Omogenitatea materialului
Medii selective , clonare

Economie, scara redusa, mecanizare

Caracterizare relativ usoara prin metode imunocitochimice Volum redus, conservare, acces direct la celule, cost avantajos Dispozitive automatizate

Modelarea conditiilor in vitro

Reducerea numarului de animale utilizate

Limitari (dezavantaje)
Control permanent al produsului
Manipulare in conditii sterile Contaminare chimica Contaminare microbiana

Control permanent al mediului

Sterilitatea spatiului de lucru Controlul incubatorului Deseuri periculoase, cu risc biologic

Cantitatea si pretul materialelor si a mediilor de cultura

Materiale de unica folosinta Medii scumpe Ser fetal de vitel

Instabilitatea genetica
Dediferentiere. adaptarea, cresterea necontrolata selectiva

Identificarea dificila a celulelor Diferente majore intre comportamentul in vivo si in vitro

Tipuri de culturi celulare

Dup sistemul de cultur
Celule aderente Celule n suspensie

Dup tipul celulelor din cultur

Celule normale (nedifereniate, epiteliale, conjunctive) Celule tumorale

Dup sursa celular

Celule embrionare i fetale Celule din esuturi adulte (stem sau difereniate)

Dup modul de iniiere

Culturi primare Culturi de linii celulare

Dup dimensiunea culturii

Culturi n condiii de laborator (petri, flacoane, tuburi, placi multicelulare) Culturi la scar industrial (n bioreactoare)

Avantajele si dezavantajele diferitor tehnici de initiere a culturilor de celule

(Ian Freshney, 2005)

BIOLOGIE CELULARA

Structura celulei eucariote animale

NVELIUL CELULAR
Plasmalema membrana celulara (componenta de baz a inveliului celular) Citoscheletul membranar (pe faa citoplasmatic a plasmalemei) Glicocalixul (pe partea externa a plasmalemei, care vine n contact cu matricea extracelular)

NVELIUL CELULAR

PLASMALEMA
Plasmalema - 6-8 nm structura complex i dinamica Principiul de organizare a plasmalemei este comun cu cel al membranelor intracelulare Singer si Nicolson n 1972 descriu membrana celular prin modelul mozaicului fluid lipoproteic

Mozaicul fluid lipo-proteic

Bistrat lipidic n stare de cristal lichid Proteine care strabat in intregime sau parial bistratul lipidic

Compoziia chimic a membranelor celulare

Lipide 52%
Lipide Plasmalema celulei hepatice Plasmalema eritrocitului Teaca de mielina

Fosfolipide Glicolipide Colesterol

54% 7% 17%

60% 3% 23%

42% 28% 22%

Alte lipide

22%

13%

8%

Proteine 40%
teaca de mielina - 25% plasmalema 50% membrana interna a mitocondriilor - 75%

Glucide - aproximativ 8%

FOSFOLIPIDELE MEMBRANARE
esteri fosforici ai glicerolului aprox. 60% din totalul lipidelor membranare 2 acizi grasi de 14-24 atomi de carbon, unul nesaturat Capul polar al fosfolipidului poate fi
fosfatidilcolin fosfatidiletanolamina fosfatidilserina fosfatidilinozitol fosfatidilserin

Sfingomielina face parte din clasa fosfolipidelor

GLICOLIPIDELE MEMBRANARE
aprox. 5% din totalul lipidelor membranare; sunt localizate doar n stratul extern al plasmalemei; capul hidrofil alctuit dintr-un radical glucidic; coada - o molecula de sfingozin legat de un acid gras; clasificare:
Glicolipide neutre - gruparea hidrofil este alctuit din unul sau mai multe reziduri glucidice neutre. Cel mai simplu glicolipid galactocerebrozida glicolipid neutru Glicolipide polare (gangliozidele) au o structura complexa. Contin mai multe resturi glucidice (galactoza, glucoza, N-acetilgalactozamina) si unul sau mai multe resturi de acid sialic (acid-N-acetilneuraminic, sau NANA), care confera moleculei o incarcatur electric negativ

STRUCTURA GLICOLIPIDELOR
NEUTRE POLARE

COLESTEROLUL
Molecul specific doar membranelor celulare din lumea animal; Se gsete n proporie de 3-23% din totalul lipidelor membranare; Molecula de colesterol este amfipatica, prezentnd un segment hidrofil (anionul OH), ataat la primul inel sterolic in pozitia C3. Restul moleculei de colesterol poart un caracter hidrofob Aranjamentul specific al moleculelor de colesterol n membrana celular duce la ordonarea i imobilizarea lipidelor, crescnd rigiditatea membranar

Proteinele membranare
In general, continutul proteic al membranelor celulare reflecta intensitatea functionala a structurii din care fac parte
Clasificare proteine integrale (intrinseci) - traverseaz integral sau partial dublul strat lipidic, stabilind legaturi puternice cu lipidele a)transmembranare strbat membrana n ntregime, au proprieti amfifile. Au un mijloc hidrofob si extremiti hidrofile b)superficiale - strabat partial membrana (se gsesc doar n unul din straturi). Au un domeniu hidrofil si unul hidrofob proteine periferice (extrinseci) - stabilesc legaturi necovalente cu gruparile polare de pe suprafeele dublului strat lipidic sau cu domeniile extra- si intracelulare ale proteinelor intrinseci. Sunt proteine cu nveli n totalitate hidrofil

Clasificarea proteinelor membranare dup structur

Proteine globulare -rezulta din plierea lanturilor polipeptidice (n general proteinele intergrate n membran) Proteine fibrilare lanuri polipeptidice liniare (localizate pe superfa ntern sau extern a membranei, alctuiesc structura MEC sau fac parte din citoscheletul membranar)

GLICOCALIXUL
GLICOCALIXUL - zona periferica externa a suprafetei celulare (NVELIUL DULCE AL CELULEI); Alctuit din resturile glucidice ale componentelor stratului extern al plasmalemei (glicolipide, glicoproteine); Se continu cu matricea extracelular (MEC) Funciile glicocalixului: - recunoasterea celulara, - adeziunea intercelular i de substrat, - distributia sarcinilor electrice pe suprafata celulara, - depozite de calciu ionic - depozite de factorilor de crestere tisulara sub form inactiv

CITOSCHELETUL MEMBRANAR
reea proteic fibrilar pe faa intern a plasmalemei; alcatuit n cea mai mare parte din filamente de actina si filamente intermediare; funciile citoscheletului membranar:
determin forma specific a celulei; este implicat n motilitatea celular; formeaz specializrile plasmalemei polului apical (microvili, stereocili, cili vibratili); particip la formarea jonciunulor celulare

FUNCIILE PLASMALEMEI
Transport transmembranar
pasiv, activ, microtransport, macrotransport

Controlul fluxului de informaie

recunoasterea, recepia si transmiterea moleculelor semnal

Funcia enzimatic
cataliza unor reacii specifice intercelulare

Formarea conexiunilor intercelulare i celul-MEC

jonciuni adeziune, comunicare, strnse ancorarea celulelor la matricea extracelulara prin jonctiuni de adeziune i contacte focale

Funciile plasmalemei sunt asigurate de proteinelele membranare

MACROTRANSPORT Endocitoza, Exocitoza, Transcitoza

SEMNALIZAREA CELULAR

Localizarea receptorilor
Receptori membranari (proteine membranare) Receptori citoplasmatici (proteine-enzime citoplasmatice) Receptori nucleari (proteine reglatoare de gene)

Receptori membranari
Sunt proteine transmembranare Recunosc specific o anumita molecula ligand specific Legatura ligand - receptor se caracterizeaz printr-o afinitate mare o concentraie foarte mica (10-91011 Mol) a ligandului poate fi detectat de receptor i poate declana fenomenele intracelulare de transmitere a mesajului Mecanismele de actiune intacelulare ale receptorilor membranari sunt de tip ionotrop sau chimiotrop

BIOLOGIA CELULELOR IN CULTURA

Micromediul celular in vitro (asigura expresia functiei specifice in vitro)

Substratul de cultura
Solid (material plastic sau sticla), Semisolid (gel de agar sau colagen) Lichid (pentru cultura in suspensie)

Contactul cu alte celule

de acelasi tip de tip diferit

Constituientii fizico-chimici si fiziologici ai mediului

Tipul si concentratia constituientilor nutritivi din mediu Tipul si concentratia constituientilor moleculari ce regleaza activitatea functionala a celulalor Sistemul de cultura (static, dinamic)

Compozitia fazei gazoase

CO2, O2, N2,, amestec de gaze, imersia completa a celulelor in mediu lichid, interfata straturilor superficiale cu aerul

Temperatura de incubare

Adeziunea celulara
Diviziunea majoritatii celulelor in cultura depinde de interactiunea cu suportul de cultura. Pentru a se divide, celulele ancoraj-dependente se aplatizeaza, realizand contact cu suportul de cultura cu o suprafata cat mai mare (se intind pe suprafata) Majoritatea celulelor ancoraj-dependente formeaza monostraturi confluente Celulele ancoraj-dependente pot deveni ancorajindependente ca urmare a transformarilor genotipice si fenotipice Celulele nu adera de suport direct, ci prin intermediul proteinelor sintetizate si eliberate in mediul extracelular de acestea, depuse pe suport

 Moleculele de adeziune sunt proteine transmembranare sau proteoglicani. Pot fi clasificate in trei categorii:
Proteine pentru adeziunea de tip celula-celula:
CAM-proteine Ca-independente Cadherine Ca-dependente

Molecule de adeziune

Proteine pentru adeziunea de tip celula-MEC (matrice extracelulara)

Integrine (ligand ce contine arginina-glicina-asparagina RGD)

Proteoglicani (structuri transmembranare care nu interactioneaza cu RGD; pot avea rol si de receptori sau molecule asociate cu receptorii pentru factorii de crestere tisulara)

Matricea extracelulara (MEC)

MEC umple saptiile intercelulare din tesuturi Componentele MEC sunt produse in celula, apoi sunt secretate si depuse pe suprafata acesteia Compozitia MEC depinde de tipul celulelor din tesut
(Ex. fibroblastele produc colagen tip I, condrocitele colagen tip II, celulele epiteliale laminina etc)

Celulele aderate de MEC controleaza compozitia MEC si invers compozitia matricii influenteaza fenotipul celular

Elementele structurale ale MEC

Proteine structurale colagen Proteine de adeziune fibronectina, laminina Proteiglicani (GAG+proteine) componenta polizaharidica cu un continut crescut de apa (hidrogel)

Motilitatea celulara in cultura

Celulele din cultura pot migra pe suprafata substratului. Migrarea are caracter diferit, in functie de tipul de celula Cele mai mobile celule fibroblastele in cultura (cu densitate celulara mica) Se stabileste o polaritate de migrare (intr-o anumita directie) prin extinderea de lamelipode) La intalnirea unei alte celule, polaritatea se inverseaza La atingerea unui monostrat confluent se produce inhibitia de contact (incetarea migrarii si a diviziunilor celulare)

Motilitatea celulara in cultura

Mioblastele si celulele endoteliale au aceleasi caracteristici de motilitate in vvitro, iar la atingerea monostratului confluent se diferentiaza Majoritatea celulelor epiteliale sunt mai putin mobile, in special la densitate celulara mare La o densitate mica, celula epiteliala va migra pana va intalni o alta celula (nu isi va schimba polaritatea si se opreste din migrare) Se pot aduna in conglomerate, care, uneori, se pot deplasa organizat, in grup

Diferentierea in vitro
Conditiile necesare pentru diferentierea in vitro: - densitate celulara mare - interactiuni celula-celula si celula-MEC bine exprimate - prezenta factorilor de diferentiere Daca in cultura se urmareste diferentierea, este necesara definirea a doua tipuri de conditii la inceput pentru proliferare si apoi pentru diferentiere Caracteristicile de diferentiere se mentin in cultura pentru mai mult timp daca este creat sitemul de cultura 3D geluri de colagen, celuloza, gelatina Mediile pentru diferentiere sunt medii selective, fara ser fetal

Dediferentiere
Dediferentierea este un fenomen specific culturilor celulare Cauze:
Selectia gresita a liniei progenitoare Diviziunea excesiva a celulelor nediferentiete ale aceleeasi linii progenitoare Absenta unor factori reglatori sau aplicarea incorecta a acestora Absenta conexiunilor specifice de tip celulaMEC

Cai de semnalizare intercelulara in vivo

Heparan sulfatul(HS) din MEC, solubil sau asociat cu membrana celulara poate activa, stabiliza sau transloca factorii de semnalizare

Semnalizarea intercelulara in vitro

Intr-un monostrat celular in vitro se poate discuta doar de actiuni homocrine si autocrine Evolutia culturilor initiate la densitate mica de multe ori esueaza, ca urmare a dilutiei unor factorilori cu actiune paracrina, Una din solutii cultura conditionata (pe strat de celule doica feeder layer)

Evolutia celulelor in cultura

Cultura primara este prima etapa de evolutie a celulelor in conditii in vitro, care are loc dupa migrarea celulelor din explant sau dupa dezagregarea enzimatica a tesutului Dupa cultura primara urmeaza procedeele de subcultivare si selectie a celulelor care duc la obtinerea de liniil celulare

Evolutia celulelor in cultura

Evolutia culturilor seriale

Rolul subculturilor
Permit diviziunea continua a celulelor sensibile la inhibitia de contact Permit mentinerea densitatii reduse, cu mentinerea fenotipului normal in culturile cu un risc de transformare spontana crescut, la o densitate mare a celulelor (ex. fibroblastele de soarece) Subcultura trebuie realizata la aproximativ 2/3 din panta fazei Log (inainte de a obtine monostratului confluent)

TIPURI DE CELULE SI SURSE CELULARE

Celulele implicate n regenerarea tisular

Majoritatea celulelor dintr-un esut sunt celule difereniate, care si-au perdut proprietatea de a se divide Toate esuturile au o rezerv de celuele incomplet difereniate, care n anumite condiii pot intra in diviziune celular Celulele nedifereniate, care au proprietatea de a se divide sunt CELULE STEM Diviziunea are loc atata timp ct actioneaz un stimul specific al diviziunii celulare. Dup ncetarea aciunii acestuia, celulele nouformate vor intra n procesul ireversibil de difereniere.

Keratinocite

Hepatocite
Celule de tip epitelial Diverse alte epitelii

Celulele Specializate

Celule endoteliale
mezenchimale

Fibroblaste Osteoblaste
Condrocite Tenocite

Celule conjunctive

Celulele epiteliale
Asigura functii complexe in organele din care provin: secretie hepatocite, insule pancreatice si epiteliul ductului pancreatic si multe altele transport dirijat epiteliul renal, intestinal etc; schimb de gaze epiteliul tractului respirator rol protector - keratinocite In cultura primara, adesea isi pierd functiile specifice In cultura primara, sunt dominate de celulele mezenchimale si eliminate in timp, daca nu se aplica conditii preferentiale de crestere, specifice metabolismului celulelor epiteliale - manipulari nutritionale ale mediului.

Factorii cu actiune diferentiata in cultura mezenchimala si epiteliala

Serul fetal are actiune puternic mitogena asupra componentei mezenchimale si efect inhibitor asupra celulelor epiteliale Mediile pentru celule epitelialle - fara ser fetal, cu factori de crestere specifici Izolarea celulelor cu ajutorul colagenazei, care disperseaza celulele stromei, pastrand celulele epiteliale in clastere (le asigura viabilitatea post-izolare) Utilizarea substraturilor de cultura (monostraturi subconfluente de celule doica, inactivate mitotic) Medii de cultura cu o concentratie mica de Ca ionic (0,030,06 mM vs. 1,2-1,4 mM) Asigurarea unor densitati celulare mai mari la subcultivare

Freshnei I.(2005) Culture of animal cells

Celule mezenchimale
Celule rol structural
Celulele tesutului conjunctiv (fibroblaste) Celule musculare striate si cardiomiocite Celule osoase

Celule vasculare
Endotelilale (in cultura se comporta ca celule epiteliale, necesitand medii specifice acestora) Celule musculare netede

CELULE STEM
Se clasifica n funcie de sursa celulara in: Celule stem embrionare i fetale Celule stem adulte, sau celule stem somatice (responsabile pentru creterea, meninerea si regenerarea esuturilor diferentiate) Se clasifica in functie de potentialul de a genera celule diferentiate in: Totipotente Pluripotente Multipotente Oligopotente si unipotente

Tipuri de celule STEM cu potentiale aplicatii in medicina regenerativa

totipotente pluripotente

Celule Stem Embrionare Celule Stem Adulte

multipotente pluripotente unipotente

maduva os
tesut adipos sange

Celulele Stem
2006 Prof Shinya Yamanaka (Kyoto, Japonia) Dr. James Thomson (Univ. Wisconsin, SUA) Premiu Nobel 2012 John Gordon si Shinya Yamanaka

Celule stem pluripotente induse (iPSC si piPSCs)

altele

 Celulele stem totipotente pot forma un organism ntreg (ovocitul fertilizat i celulele formate dup primele diviziuni ale zigotului) Celulele stem pluripotente formeaz cele 3 foie germinative ale embrionului, inclusiv celulele germinale. nu pot forma celulele placentei si a cordonul ombelical Provin din masa celular intern a blastocistului Celulele stem multipotente Pot forma multiple celule (ex. celulele stem mezenchimale osteoblaste, condrocite, miocite si adipocite Celule stem oligopotente Pot forma un anumit numar de linii celulare specifice unui tesut (ex. celulele stem neurale pot forma un subset de neuroni cerebrali; celulele stem hematopoietice pot forma subseturile de celule sanguine) Celule stem unipotente Celule care forteaz o singur linie celular (ex. Spermatogoniile se difereniaz doar n spermatozoizi)

Proprietatile celulelor stem

Markeri nucleari: Oct4 Sox2 Nanog Markeri de suprafata: TRA-1-81 TRA-1-60 SSEA-4 SSEA-3

A-Stem/B-Progenitoare/C-Diferentiata

Auto-replicare Difereniere in celule specializate

Etape de dezvoltare embrionar, n care se obtin celulele stem embrionare

Celule stem adulte

Sunt celulele nediferentiate (nespecializate) localizate n esuturile difereniate Au fost descoperite cu aproximativ 50 de ani in urma. n 1961 si 1963 apar primele publicaii care relatau prezenta a doua tipuri de celule stem n mduva hematopoietic Celule stem hematopoietice, cele din care iau nastere elementele figurate ale sangelui Celule medulare stromale (celule stem mezenchimale), o populaie heterogen de celule precursoare, care se pot diferenia n celule osoase, cartilaj, adipocite si celulele tesutului conjunctiv al mduvei hematopoietice Pn n prezent, celule cu proprietati asemanatoare celulelor stem mezenchimale au fost descoperite n toate esuturile difereniate (cord, ficat, pancreas, creier, pulpa dentara, epiderm etc.)

Plasticitatea celulelor stem adulte

Surse de celule stem adulte, usor accesibile

Mduva hematopoietic Sngele periferic, dup mobilizarea celulelor stem din mduva hematopoietic cu ajutorul tratamentelor cu citokine (G-CSF) Placenta i cordonul ombelical sursa celulara productiva si uor de recoltat esut adipos obinut prin liposucie

Capacitatea funcional a celulelor stem mezenchimale umane

Demonstratii in vitro (culturi de celule) In vitro celulele stem mezenchimale pot genera adipocite, condrocite si procese de mineralizare specifice osului Primele celule stem mezenchimale au fost izolate de Friedenstein, n 1979, din grasime, prin centrifugarea n gradient de densitate. Doar 0,001-0,01% din celulele zolate s-au doveedit a fi cele stem Dup o amplificare prin multiplicare in vitro, au fost obtinute culturi de celule difereniate de tipul celor adipoase, condroide i osteoide

Senescena replicativ a celulelor stem

Celulele stem mezenchimale au o via replicativ mai scurt dect a celulelor stem embrionare 5070 diviziuni celulare Senescena replicativ este determinat de scurtarea telomerelor - regiunea terminal a cromizomului, alctuit din terminaia repetitiv de tipul TTAGGG La fiecare diviziune celular, se pierde o parte din secvena repetitiv, din cauz replicrii incomplete Scurtarea treptat a telomerelor duce la alterarea progresiv a ADN i implicit la moartea celular

Aspectul celulelor stem adulte in cultura in vitro

Celule stem embrionare

vs
Celule stem pluripotente adulte

PESC (pluripotent embryonic stem cells) vs iPSC (induced pluripotent stem cells)

Oct4 Sox2 Nanog Lin28

Corp embrioid obtinut din iPSC

CULTURA PRIMARA

Generalitati
Definitie: Cultura celulara initiata cu celule dispersate din tesuturi Evenimentele principale: Recoltarea tesutului Fragmentarea/dezagregarea tesutului Repartizarea celulelor in vase de cultura Subcultivarea seriala

Enzimele de dezagregare tisulara

Tripsina Colagenaza Elastaza Pronaza Dispaza Hialuronidaza DNAza - inlatura ADNul eliberat din celulele lezate. Lizatul celular incurajeaza reagregarea celulara

Conditii specifice in obtinerea culturilor primare

Inlaturarea grasimii si a fragmentelor de tesut necrozat Folosirea unui instrumentar cat mai ascutit pentru minimizarea lezarii Enzimele utilizate la dezagregare trebuie inlaturate eficient, prin mai multe centrifugari Cultura primara se initiaza cu un numar de celule mult mai mare in comparatie cu subcultura (o parte mica de celule vor adera pe supostul de cultura) Sunt folosite medii de cultura mai bogate in constituenti organici (Ham F12) si ser fetal de vitel Pentru celule specializate sunt recomandate medii selective Tesuturile embrionare se dezagrega mai usor decat tesuturile adulte , iar viabilitatea celulara este mai mare Tesuturile recoltate pot fi pastrate in mediu de cultura special (de transport)

Izolarea tesuturilor embrionare animale

Tesut embrionar de soarece
Cultura fibroblatica nediferentiata, folosita frecvent pentru obtinerea straturilor doica (feeder) si studii de proliferare (inclusv citotoxicitate) Recoltarea se face in ziua 12-13 de gestatie (>50% din perioada gestationala- 19-21 zile) pentru a avea embrioni destul de mari, dar cu un raport mare de celule nediferentiate

Tesut embrionar de pui

Embrionii sunt mai mari (se recolteaza la 10 zile de incubare a oualor de pui) Celulele embrionare sunt folosite pentru studii de proliferare, straturi doica si suport pentru propagarile virale Embrionii recoltati in perioade de gestatie mai mari sunt utilizati pentru obtinerea de celule specializate (hepatocite, cardiomiocite sau celule epiteliale pulmonare

Recoltarea tesuturilor embrionare de soarece

Recoltarea tesuturilor embrionare de pui

Cultura primara prin explant

Cultura prin explant este indicata pentru fragmente tisulare mici, ale caror celule se pot pierde in urma tratamentelor enzimatice

Dezagregare enzimatica la cald

Durata intregului proces 3-4 ore Pentru evitarea reagregarii celulare, la suspensiile celulare inainte de centrifugare poate fi adaugata DNAza Tehnica este folosita pentru digestia relativ rapida a unor fragmente tisulare mari (embrioni intregi de soarece sau pui) Nu este o tehnica potrivita pentru tesuturile adulte. Digestia prelungita pentru dezagregarea tesutului fibros poate afecta celulele epiteliale

Metoda de tripsinizare la rece

Durata intregului proces aprox. 6-18 ore Consta in mentinerea fragmentelor celulare in solutie de tripsina pentru 6-18 ore la temperatura de +4oC (la gheata), urmata de expunerea amestecului la 37oC pentru 20-30 min. La rece are loc doar difuzia enzimei in intreaga structura a tesutului, iar digestia propriu-zisa la cald a tesutului are loc in doar 20-40 min Avantaj
minimizeaza leziunilor celulare si munca laborioasa Supravietuirea diferitor tipuri de celule

Metoda potrivita pentru fragmente de tesuturi nu foarte mari (organe embrionare)

Dispersia enzimatica utilizand colagenaza

Colagenaza este utilizata pentru dispersia tesuturilor prea froase sau prea sensibile la tripsina Este o metoda frecvent utilizata pentru dezagregarea tumorilor (in general al epiteliilor)

Dezagregare mecanica
Utilizare Pentru tesuturi moi: - splina, -ficat embrionar, - tesut cerebral, - tumori moi

SUBCULTURA CELULARA SI LINII CELULARE

Notiuni generale
Cresterea celulelor din cultura primara duce la epuizarea substratului si oprirea diviziunilor produsa de inhibitia de contact Odata subcultivata (pasaj celular) cultura devine linie celulara O linie celulara contine mai multe tipuri de descendente celulare, cu fenotip asemanator sau diferit Prin selectia unui singur tip de descendenta celulara prin clonare se obtin o tulpina celulara (susa celulara) Linie celulara continua o linie celulara transformata in vitro Tulpina celulara continua (susa celulara continua) un anumit tip (fenotip) celular, selectata prin clonare si caracterizata, necontaminata cu alte tipuri celulare Foarte multe linii celulare sunt linii contaminate (contin mai multe tipuri celulare)

Varsta cultuii celulare

Numarul de pasaje numarul subculturilor celulare realizate Numarul de generatii numarul de dublari a populatiei celulare numar care indica varsta culturii Linii celulare limitate (finite) linii celulare cu durata de viata limitata la un anumit numar de generatii (aproximativ 20-80, in functie de tipul celulelor)

Nomenclatura
Cod (nume) ex. Normal Human Brain (NHB) Numarul liniei daca din aceeasi sursa au fost selectate mai multe linii Ex. NHB1, NHB2 etc Numarul clonei, daca exista mai multe (NHB1-1, NHB2-1 etc) Numarul pasajelor dupa ultima dezghetare NHB1-1/p3 Laboratorul din care provine (Ex. WI Wistar Institute, NCI national cancer institute etc)

Mentinerea de rutina a liniilor celulare

Intretinerea liniilor celulare in cultura are loc prin schimbarea perioadica a mediului de cultura Frecventa de schimbare a mediului depinde de tipul celulelor (viteza de multiplicare) In cazul celulelor transformate, cu o crestre rapida, pasajul celular se face la aproximativ fiecare 4-5 zile, iar schimbarea mediului se face la 2-3 zile In cazul celulelor cu o crestere lenta pasajul se realizeaza la fiecare 2,3 sau chiar 4 saptammani, iar schimbarea mediului intre perioadele de subcultivarese face saptamanal

Alegerea momentului de schimb al mediului

Ciclul de crestere si numarul de dilutii

Verificarea de rutina a calitatii liniilor celulare

Verificarea pH
Majoritatea celulelor isi opresc cresterea la pH 76,5 Majoritatea celulelor isi pierd viabilitatea la pH 6,5-6. Acidifierea mediului de cultura poate fi urmarita folosind indicatorul pH din mediu (phenol red), care la acidifiere vireaza de la rosu la portocaliu sau galben

Determinarea concentratiei celulare (se rasfrange si asupra pH) Morfologia celulara. Semne de deteriorare a culturii:
Vacuolizarea Granulatiile in jurul nucleului Aspectul sferic

Adaptarea grosimii stratului de mediu, in functie de consumul de O2

Culturi consumatoare de O2 2 mm Culturi cu un consum scazut de O2 5 mm

Morfologie celulara anormala

Caracterizarea morfologica a celulelor in cultura

Metoda simpla si des utilizata Este relativa si depinde de momentul examinarii, de localizarea celulelor in cultura (central sau spre periferie) sau de densitatea celulelor. Pentru morfologie se utilizeaza frecvent termenii tip fibroblastic (daca lungimea celulei depaseste de cel putin 2 ori latimea) si tip epiteloid (daca celulele sunt poligonale, cu dimensiuni uniforme si formeaza grupari celulare) Se recomanda examinarea morfologiei in starea vie a celulei (nefixata, necolorata) cu ajutorul microscopiei fotonice prin contrast de faza Daca se recurge la coloratie Giemsa este cel mai des utilizat colorant

Exemple de morfologie celulara in cultura

Identificarea prin metode de colorare imunocitochimice

Metoda citochimica de identificare cu anticorpi monospecifici generatori de produsi insolubili sau colorati sau anticorpi monospecifici cuplati cu fluorocromi. Permite identificarea, vizualizarea, localizarea si apreciarea cantitativa a unor constituenti celulari specifici.

Filamentele intermediare specifice unui anumit tip celular

Keratine in celulele epiteliale Vimentinele in celulele de origine mesodermica Desminele in celule musculare Proteina gliala acida in astrocite Neurofilamentele in neuroni etc.
Proteine de legare intercelulara de tip CAM Markeri specifici de suprafata de tip CD

Componente specifice de suprafata

Componente ale metabolismului specific

Albumina in hepatocite adulte feto-proteine (AFP) in hepatocitele embrionare Hormoni in celule secretoare specifice

Imagini imunocitochimice

Proangiogenic astrocytes. (A) fibronectin (FN, green), PECAM-1 (red), PDGFR (blue); lectin (red), integrin 5 or 1 (green) at the sprouting vascular edges of P5 retina. (B and C) Retinal vessels. (B) PECAM-1 (red), PDGFR (green) . (C) PECAM1 staining. (D) PDGFR (red) and fibronectin (green) in P7 retina.

CRIOCONSERVAREA SI CRIOSTOCAREA

Motivele pentru care se conserva celulele prin inghetare

Amanarea in timp a modificarilor genotipice Prelungirea perioadei de utilizare inainte de atingerea senescentei Conservarea liniilor valoaroase sau de interes Amanarea in timp a transformarilor in comportamentul de crestere a celulelor Evitarea (reducerea) contaminarii cu microorganisme Evitarea (reducerea) trans-contaminarii cu alte linii celulare Minimizarea efectelor de manevrare improprie Minimalizarea eventualelor deficiente de incubare Economia de timp si de material Distributia catre alti utilizatori

Preconditii de inghetare
Absenta cantaminarii cu microorganisme Confirmarea tipului celular prin autentificarea liniei celulare (verificarea caracteristicilor si a provenientei)

Principiul crioconservarii
Pentru mentinerea viabilitatii celulare la maxim in urma ciclului de inghetare dezghetare, trebuie avute in vedere:
Minimizarea formarii cristalelor de gheata in celula Evitarea efectelor citotoxice solutiilor concentrate de criocprotectie

Crioconservarea cu pastrarea calitatii materialului conservat se obtine prin:

Inghetarea lenta (maxim 1oC/min) Utilizarea crioprotectantilor care leaga apa Stocarea la temperaturi foarte joase, pentru evitarea efectului nociv a solutiilor concentrate de saruri si proteine, sub forma de micelii in gheata dezghetarea rapida, pentru evitarea formarii cristalelor de gheata si a gradientilor de concentratie a sarurilor si proteinelor

Concentratia celulelor la criostocate

O concentratie mai mare la inghetare determina o eficienta mai mare la reluarea culturii dupa dezghetare Daca o subcultura normala este initiata cu 1x105 cel/ml, concentratia indicata la inghetare va fi de 1x 107 cel/ml, ca dupa dezghetare si dilutia de 1:20 cu mediu de cultura, sa se obtina o concentartie de insamantare de 5x105 cel/ml de 5 ori mai mare in comparatie cu cea necesara pentru o subcultivare proaspata Prin raportul de 1ml celule dezghetate/20ml mediu, se asigura dilutia crioprotectantului, cu minimizarea efectului sau citotoxic

Crioprotectanti
Glicerina - devine toxica dupa un an de pastrare DMSO (dimetil sulfoxid) in concentratie de 7 10 %. Este un produs toxic pentru unele celule. Dupa adaugarea DMSO la suspensia celulara, amestecul trebuie tinut la rece (+4oC) Polivinilpirolidona (PVP) Polietilenglicolul (PEG) Concentratii crescute de ser fetal (40 100%)

Viteza de inghetare
Racirea la +4oC Racirea lenta pana la 0oC Inghetarea lenta, (1oC/min), pana la -50oC Inghetarea rapida (50oC/min) pana la -196oC

Dezghetarea
Criotubul cu celulele se introduce rapid in baia de apa, la +37oC Se diluiaza foarte lent cu mediu, 1/20 (celulele dezghetate sunt sensibile la actiunile mecanice si osmotice) Se centrifugheaza imediat dupa dilutie, pentru a minimiza efectul crioprotectantului Se determina viabilitatea celulelor. O viabilitate acceptabila pentru reluarea normala a culturii este de > 65%