INTRETINEREA CULTURILOR

CELULARE IN LABORATOR

Tehnici uzuale si conditii de cultura

Elementele cheie in tehnica
culturilor celulare

• Mediul de cultura
• Conditiile de incubare
• Densitatea de crestere
• Asepsia
 Mediile de cultura
 Medii naturale:
 fluide biologice (plasma si serul sanguin, limfa, ser din cordonul
placentar, lichid amniotic),
 extracte tisulare (extract hepatic, splenic, tumoral, maduva
hematopoietica, embrioni de vitel sau pui)
 cheagurile din plasma sanguina

 Medii artificiale, care se obtin prin suplimentarea unor

medii bazale cu extracte naturale, de tipul serului fetal de
vitel

 Medii sintetice, care sunt formulate in intregime utilizand

substante chimice si nu contin suplimente naturale
 Avantaje/Dezavantaje
• Mediile naturale reproduc foarte bine conditiile fiziologice si
necesarul metabolic al celulelor. Principalul dezavantaj al
acestora este accesibilitatea sursei si reproductibilitatea
compozitiei.

• Mediile artificiale sunt cele mai ieftine si cele mai uzuale. Pot
sustine cresterea mai multor tipuri de celule. Ca dezavantaj –
cunoasterea incompleta a compozitiei serului fetal

• Mediile sintetice nu contin adausuri naturale, au o compozitie

foarte complexa si bine cunoscuta, reconstituita prin
adaugarea de hormoni, factori de crestere, lipoproteine si alte
molecule, cu efecte tintite pentru cresterea a unui anumit tip
de celule. Ca dezavantaj – foarte scumpe si specifice pentru o
singura categorie de celule.
 pH in cultura de celule
• Principalul compus, care modifica valoarea pH in cultura
de celule este CO2, produs ca urmare a metabolismului
celular.
• Eliberarea CO2 din mediu, duce la alcalinizarea mediului,
dar in acelasi timp, in mediu apos, CO2 reactioneaza cu
H2O2, producand acid carbonic, care reduce pH-ul
mediului de cutura
• Pentru evitarea modificarii pH-ului prin aceste
mechanisme, mediile de cultura sunt prevazute cu
sisteme tampon, specifice, in functie de conditiile de
incubare vizate.
• Majoritatea mediilor de cultura contin indicator de pH
Rosu-fenol
 Sistemele tampon din mediile de ultura
• Sistemul tampon pe baza de NaHCO3 are la baza
echilibru gazos al CO2 din conditiile de incubare si
continutul de CO3/HCO3 din mediul de cultura
– Conditii de incubare cu atmosfera de 5-10% CO2
• Sistem tampon pe baza compozitie in aminoacizi
bazici
– Mediu L-15, conceput de Leibovitz, are un pH de 7.8,
care in lipsa CO2 nu este deposit
• Sistemul tampon de tip chimic, prin folosirea
zwiterionilor (molecule, care contin in acelasi timp, atat
grupari acide, cat si grupari alcaline)
– HEPES (acid 4-(2-hidroxietil )-1 piperazineetanesulfonic)
– MOPS-ului (acid 3-(N-morfolino)propanesulfonic)
 Osmolaritatea
• Presiunea osmotica exercitata de mediu asupra
celulelor.

• Osmolaritatea este data de cantitatea de molecule

solubilizate intr-o unitate de lichid si trebuie sa fie in
echilibru cu presiunea osmotica intracelulara

• Presiunea osmotica a sangelui este de 290 mOsm/kg

• Osmolaritatea stabilita pentru formularea mediilor de

cultura, este de 280 – 310 mOsm/kg
 COMPOZITIA CHIMICA
• Saruri anorganice si microelemente
– mentinerea unei osmolaritati fiziologice a mediului, precum si a
potentialului membranar celular
• Aminoacizi
– Complexul obligatoriu de aminoacizi este alcatuit din totalitatea
aminoacizilor esentiali (valina, leucina, izoleucina, triptofanul,
fenilalanina, metionina, lisina și treonina)
– pot contine si aminoacizi neesentiali (alanina, asparagina,
acidul aspartic, cisteina, acidul glutamic, glutamina, glicina,
prolina, serina si tirozina)
– L-glutamina, care este implicate in sinteza de NAD, NADPH si
alte nucleotide, are rol de sursa secundara de energie
• Vitamine
• Carbohidrati (glucoza)
• Proteine si peptide
 Proteine si peptide
• Sunt componentele reglatoare ale functiilor
celulare . Ele asigura procesele de diviziune
celulara, diferentiere, adeziune de substrat dar
si altele
• In mediile artificiale, sursa de proteine si
peptide este serul fetal (5-20%)
• in mediile definite chimic, sau cele sintetice,
proteinele si peptidele sunt adaugate sub
forma de substante pure
 Serul fetal
• Albumina
– leaga apa, saruri organice si anorganice, acizi grasi liberi, hormoni si
vitamine, pe care le transporta in tesuturi si celule
– Rol de detoxifiere a mediului de cultura
• Aprotinina
– o proteina stabila in pH neutru si acid,
– este rezistenta la temperaturi ridicate si la degradarea hidrolitica a
enzimelor.
– are capacitatea de a inhiba o serie de protease serinice, ca tripsina, pe
larg utilizata in tehnicile de subcultuvare celulara
• Fetuina
– glicoproteina, care se gaseste in concentratii foarte mari in serul fetal si
cel al nounascutile,
– ca si apotinina, are proprietatea de a inhiba serin-protazele.
• Fibronectina
– glicoproteina, care intermediaza adeziunea celulelor de substrat
• Transferina
– proteina transportoare de ioni fier, la nivelul membrane celulare
Exemple de proteine din mediile sintetice

• Albumina, transferina, fibronectina, laminina,

insulina, hormonul de crestere
• Factori de crestere
• Inhibitorul tripsinei din semintele de soia, cu rol
asemanator cu apotinina si fetuina din serul fetal
 Exemple de factori de crestere

Factor de crestere Celule tinta Concentartii

(Growth factor – GF) recomandate

EGF (Epidermal Growth Factor) Keratinocyte, fibroblaste, condrocite si altele, de tip epitelial si 1–20 ng/ml
mezenchimal

bFGF (basic Fibroblast Growth Celule endoteliale, fibroblaste, condrocite, mioblaste si altele 0.5–10 ng/ml
Factor)

EVGF (Endothelial Vascular Growth Celule endoteliale 1–3 mg/ml

Factor)

IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) Majoritatea celulelor 1–10 ng/ml

PDGF (Platelet Derived Growth Fibroblaste, miocite, celule gliale (celule de tip mezenchimal) 1–50 ng/ml
factor)

NGF (Nerve Growth Factor) Celule neuronale, celule gliale (celule senzoriale) 5–10 ng/ml

TGF – α (Transformator Growth Fibroblaste, mioblaste, condroblaste si altele (in general de tip 0.1–3 ng/ml
factor) mezenchimal)
 Mentinerea de rutina a liniilor celulare
• Multiplicarea celulelor in cultura duce la epuizarea
substantelor nutritive din mediu de cultura si acidifierea
acestuia
• Multiplicarea celulelor duce la epuizarea suprafetei de
crestere, ceea ce duce la oprirea diviziunilor prin mecanismul
“inhibitiei de contact” in cazul culturilor primare si a liniilor
celulare normale
• Intretinerea liniilor celulare in cultura are loc prin schimbarea
perioadica a mediului de cultura
• Frecventa de schimbare a mediului depinde de tipul celulelor
(viteza de multiplicare)
• In cazul celulelor transformate, cu o crestre rapida, pasajul
celular se face la aproximativ fiecare 4-5 zile, iar schimbarea
mediului se face la 2-3 zile
• In cazul celulelor cu o crestere lenta pasajul se realizeaza la
fiecare 2,3 sau chiar 4 saptammani, iar schimbarea mediului
intre perioadele de subcultivarese face saptamanal
 Conditii de cultura

• Temperatura de 37oC
• Atmosfera imbogatita cu 5-10% CO2
• Umiditate 96%
 Asepsie

• Circuite adaptate
• Aer filtrat prin filtre HEPA (pori de 0,22 µm)
• Iradiere UV (254 nm)
• Sterilizarea instrumentarului cu aer fierbine
• Sterilizarea solutiilor cu abur fierbinte
(autoclavare)
• Materiale de unica folosinta, sterile
 Varsta cultuii celulare
• Numarul de pasaje – numarul subculturilor
celulare realizate
• Numarul de generatii – numarul de dublari a
populatiei celulare – numar care indica varsta
culturii
• Linii celulare limitate (finite) – linii celulare cu
durata de viata limitata la un anumit numar de
generatii (aproximativ 20-80, in functie de
tipul celulelor)
Alegerea momentului pentru schimbarea
mediului si subcultivare
Ciclul de crestere si
numarul de dilutii
 Verificarea de rutina a calitatii liniilor celulare
• Verificarea pH
– Majoritatea celulelor isi opresc cresterea la pH 7–6,5
– Majoritatea celulelor isi pierd viabilitatea la pH 6,5-6.
• Determinarea concentratiei celulare
• Morfologia celulara. Semne de deteriorare a
culturii:
– Vacuolizarea
– Granulatiile in jurul nucleului
– Aspectul sferic
• Adaptarea grosimii stratului de mediu, in
functie de consumul de O2
– Culturi consumatoare de O2 – 2 mm
– Culturi cu un consum scazut de O2 – 5 mm
Morfologie celulara anormala
CRIOCONSERVAREA SI CRIOSTOCAREA

• Amanarea in timp a modificarilor genotipice

• Prelungirea perioadei de utilizare inainte de atingerea
senescentei
• Conservarea liniilor valoaroase sau de interes
• Evitarea (reducerea) contaminarii cu microorganisme
• Evitarea (reducerea) contaminarii cu alte linii celulare
• Minimizarea efectelor de manevrare improprie
• Minimalizarea eventualelor deficiente de incubare
• Economia de timp si de material
• Distributia catre alti utilizatori
 Preconditii de inghetare

• Absenta cantaminarii cu microorganisme

• Verificarea caracteristicilor si a provenientei

 Principiul crioconservarii
• Pentru mentinerea viabilitatii celulare la inghetare:
– Minimizarea formarii cristalelor de gheata in celula
– Evitarea efectelor citotoxice solutiilor concentrate de
criocprotectie
• Crioconservarea cu pastrarea viabilitatii celulare:
– Inghetarea lenta (maxim 1oC/min)
– Utilizarea crioprotectantilor care leaga apa
– Stocarea la temperaturi foarte joase, pentru evitarea
efectului nociv a solutiilor concentrate de saruri si
proteine, sub forma de micelii in gheata
– dezghetarea rapida, pentru evitarea formarii cristalelor de
gheata si a gradientilor de concentratie a sarurilor si
proteinelor
 Concentratia celulelor la criostocate
• O concentratie mai mare la inghetare determina o
eficienta mai mare la reluarea culturii dupa dezghetare
• Daca o subcultura normala este initiata cu 1x105
cel/ml, concentratia indicata la inghetare va fi de 1x 107
cel/ml, ca dupa dezghetare si dilutia de 1:20 cu mediu
de cultura, sa se obtina o concentartie de insamantare
de 5x105 cel/ml – de 5 ori mai mare in comparatie cu
cea necesara pentru o subcultivare proaspata
• Prin raportul de 1ml celule dezghetate/20ml mediu, se
asigura dilutia crioprotectantului, cu minimizarea
efectului sau citotoxic
 Crioprotectanti
• Glicerina - devine toxica dupa un an de pastrare
• DMSO (dimetil sulfoxid) in concentratie de 7 –
10 %. Este un produs toxic pentru unele celule.
Dupa adaugarea DMSO la suspensia celulara,
amestecul trebuie tinut la rece (+4oC)
• Polivinilpirolidona (PVP)
• Polietilenglicolul (PEG)
• Concentratii crescute de ser fetal (40 – 100%)
 Viteza de inghetare
• Racirea la +4oC
• Racirea lenta pana la
0oC
• Inghetarea lenta,
(1oC/min), pana la -50oC
• Inghetarea rapida
(50oC/min) pana la -
196oC
 Dezghetarea
• Criotubul cu celulele se introduce rapid in baia
de apa, la +37oC
• Se diluiaza foarte lent cu mediu, 1/20 (celulele
dezghetate sunt sensibile la actiunile
mecanice si osmotice)
• Se centrifugheaza imediat dupa dilutie, pentru
a minimiza efectul crioprotectantului
• Se determina viabilitatea celulelor. O
viabilitate acceptabila pentru reluarea
normala a culturii este de > 65%
CARACTERIZAREA CELULELOR
IN CULTURA
 CARACTERIZAREA CELULELOR IN CULTURA
• Determinarea contaminarilor cu alte celule
• Determinarea (confirmarea) speciei de origine a celulelor
• Corelarea cu tesutul de origine a celulelor
– Determinarea liniei progenitoare la care apartin celulele
– Determinarea pozitiei celulelor in cadrul liniei progenitoare
(daca sunt stem, precursoare sau diferentiate)
• Determinarea transformarilor aparute in cadrul liniilor celulare
– Daca linia celulara are viata limitata sau este continua
– Daca exprima caractere asociate cu malignizarea
• Determinarea instabilitatii genetice si a variabilitatii fenotipice
• Identificarea liniilor celulare in cadrul unui grup de celule cu
aceeasi origine, a suselor celulare sau a liniilor celulare hibride
Cariotipare
• Metoda citogenetica
– Permite identificarea
speciei si a sexului de
origine a celulelor
(umane, soarece,
hamster etc)
– Detrmina numarul de
cromozomi si
structura lor prin
bandare (colorarea
specifica)

Cariotiparea prin metoda picaturii

 Bandarea cromozomilor pentru
identificarea perechilor omologi

Bandarea cu Giemsa

Bandarea cu fluorescenta
Hoechst 33258
 Realizarea
cariotipului
 Caracterizarea morfologica
• Metoda simpla si des utilizata
• Este relativa si depinde de momentul examinarii, de
localizarea celulelor in cultura (central sau spre periferie)
sau de densitatea celulelor.
• Pentru morfologie se utilizeaza frecvent termenii “tip
fibroblastic” (daca lungimea celulei depaseste de cel
putin 2 ori latimea) si “tip epiteloid” (daca celulele sunt
poligonale, cu dimensiuni uniforme si formeaza grupari
celulare)
• Se recomanda examinarea morfologiei in starea vie a
celulei (nefixata, necolorata) cu ajutorul microscopiei
fotonice prin contrast de faza
• Daca se recurge la coloratie – Giemsa este cel mai des
utilizat colorant
Exemple de morfologie celulara in cultura
Detrminararea electroforetica a mobilitatii izoenzimelor
• Izoenzime – enzime cu acelasi specific functional, insa cu structura
si activitate usor diferita in functie de specie, rasa sau tesut
• Pentru determinarea de specie sunt utilizate 7 izoenzime, dintre
care doar 4 sunt de cele mai multe ori suficiente pentru a face un
diagnostic de specie, rasa sau tesut sau pentru a determina
prezenta unei trans-contaminari (minm 10%) cu celule provenite de
la alta specie
– Nucleosid fosforilasa
– Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza
– Malat dehidrogenaza
– Lactat dehidrogenaza
– Aspartat aminotransferaza
– Manozo-6-fosfat izomeraza
– Peptidaza
• Se determina calitativ activitatea unei enzime in functie de viteza de
deplasare si intensitatea benzii formate de aceasta in gelul de
agaroza sau poliacrilamida
Identificarea electroforetica a izoenzimelor
 Metoda ELISA de determinare a
antigenelor de suprafata

• Este o metoda frecvent utilizata, care foloseste

anticorpi monospecifici pentru un anumit set de
antigene specifice
• Pentru determinare sunt necesare kituri si
materiale de control
 Identificarea prin metode de colorare imunocitochimice

Metoda citochimica de identificare cu anticorpi monospecifici

generatori de produsi insolubili sau colorati sau anticorpi
monospecifici cuplati cu fluorocromi. Permite identificarea,
vizualizarea, localizarea si apreciarea cantitativa a unor constituenti
celulari specifici.
• Filamentele intermediare specifice unui anumit tip celular
• Keratine – in celulele epiteliale
• Vimentinele – in celulele de origine mesodermica
• Desminele – in celule musculare
• Proteina gliala acida – in astrocite
• Neurofilamentele – in neuroni etc.
• Componente specifice de suprafata
• Proteine de legare intercelulara – de tip CAM
• Markeri specifici de suprafata de tip CD
• Componente ale metabolismului specific
• Albumina – in hepatocite adulte
• Α feto-proteine (AFP) – in hepatocitele embrionare
• Hormoni – in celule secretoare specifice
 Imagini imunocitochimice

Proangiogenic astrocytes. (A) fibronectin (FN, green), PECAM-1 (red), PDGFRα

(blue); lectin (red), integrin α5 or β1 (green) at the sprouting vascular edges of P5
retina. (B and C) Retinal vessels. (B) PECAM-1 (red), PDGFRα (green) . (C) PECAM-
1 staining. (D) PDGFRα (red) and fibronectin (green) in P7 retina.