Dogma centrală a biologiei moleculare

şi aplicaţii medicale

Biologia moleculară se ocupă cu studierea mecanismelor biologice la nivelul molecular al celulelor.

Principala preocupare a biologiei moleculare este studierea rolului acizilor nucleici pentru păstrarea
și transmiterea caracterelor ereditare, interacţiunile ce apar între diferite sisteme ale celulei, ale
ADN, ARN şi biosintezei proteice, precum şi modul în care aceste interacţiuni sunt reglementate.

Tehnicile folosite in biologia moleculara includ clonarea (folosita in studiul proteinelor), tehnica PCR,
electroforeza in gel, tehnica Western blot, microarray

Formularea dogmei centrale a biologiei moleculare

Dogma centrală a biologiei moleculare descrie

procesul prin care informațiile din gene sunt
incluse în proteine: ADN -transcriptie→ ARNm -
translatie→ proteină.

ADN-ul conține gene care codifică proteinele.

ARN este intermediarul între ADN și proteine.

Acesta transporta informația genetica de la nucleu
la citoplasmă in cazul celulelor eucariote.

Proteinele sunt factorii determinanți ai structurii și

funcției unei anumite celule. O proteină este
compusă dintr-o secvență de aminoacizi, care este
secvența de codificare a unei gene.

Expresia genică este procesul de sinteză a

proteinelor pe baza instrucțiunilor din gene.

Cele două etape ale expresiei genice sunt

transcrierea și traducerea.

1
Materialul genetic şi esenţa replicării ADN-ului.

Modelul structurii ADN întruneşte toate condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească materialul
genetic:

− să stocheze o cantitate mare de informaţie, într-o formă stabilă, dar uşor de exprimat;

− să reproducă informaţia, deci să o transmită cu mare fidelitate de la o generaţie la alta, eventual să

o "repare" corect, dacă se produce o leziune;

− să exprime informaţia genetică prin sinteza unor proteine specifice;

− să fie capabil de variaţie.

Aceste proprietăţi fundamentale şi caracteristice ale ADN îi conferă calitatea de a fi molecula

esenţială a vieţii.

Informaţia genetică

ADN deţine, prin genele pe care le posedă, informaţiile necesare pentru ca celulele să trăiască, să se
multiplice şi să se diferenţieze (căpătând anumite specializări). În ansamblul organismului, ADN
determină şi controlează embriogeneza, dezvoltarea, creşterea, metabolismul şi reproducerea - deci
toate procesele majore ale funcţionării organismului uman.

Informaţia genetică necesară acestor procese este reprezentată de secvenţa lineară (succesiunea
sau ordinea de înlănţuire) nucleotidelor în molecula de ADN; ea determină structura proteinelor care

2
alcătuiesc celulele şi ţesuturile şi participă la funcţionarea lor complexă. Proteinele sunt formate din
lanţuri de aminoacizi; secvenţa aminoacizilor în proteină determină proprietăţile caracteristice ale
fiecărei proteine; această ordine specifică a aminoacizilor este determinată de secvenţa nuclotidelor
în ADN.

Codul genetic reprezinta un sistem de corespondente intre o anumita secventa de 3 nucleotide

numita codon si un anumit aminoacid. Este considerat un dictionar bilingv absolut necesar in
procesul translatiei. Alfabetul genetic are 4 litere reprezentate de cele 4 tipuri de nucleotide:
adenina (A), citozina (C),guanina (G) și timina (T). 3 nucleotide formeaza un codon. Astfel, Gena este
unitatea de informaţie ereditară; ea este alcătuită dintr-o succesiune specifică de codoni, ce
determină ordinea aminoacizilor într-un polipeptid şi, prin aceasta, funcţia lui.

La fiecare triplet de nucleotide, numit codon corespunde pe baza codului genetic (vezi capitolul 4),
un anumit aminoacid din structura proteinei sau un "semnal" necesar pentru a începe sau termina
lectura mesajului (figura 2.7).

Modificarea secvenţei nucleotidelor prin mutaţia genei va duce la modificarea unui / unor codon(i)
şi, de cele mai multe ori, la modificarea structurii şi funcţiei proteinei sintetizate .

Expresia informaţiei ereditare reprezintă, în esenţă, sinteza de proteine.

Informaţia genetică codificată din ADN nu este folosită direct în sinteza proteinelor (figura 1.1 şi 2.7).
Ea este mai întâi copiată - transcripţie - într-o moleculă de ARNm, folosind acelaşi cod şi mecanismul
complementarităţii. Urmează apoi translaţia sau decodificarea informaţiei genetice din ARNm într-o
secvenţă specifică de aminoacizi a proteinei, pe baza corespondenţei dintre fiecare codon şi un
anumit aminoacid.

Copierea informaţiei în ARNm se face numai de pe una din catenele ADN, catena 3'5', numită
catenă copiată sau matriţă 3 . Ea este totdeauna aceeaşi pentru o anumită genă dar la gene diferite
poate fi una sau alta din catenele ADN. Catena ADN complementară catenei transcrise este similară
cu ARNm ca secvenţă (exceptând înlocuirea timinei cu uracilul) şi direcţie (5'  3') şi se numeşte
catenă de referinţă ("sens"). După desfacerea enzimatică, temporară, a legăturilor de hidrogen
dintre cele doua catene ale ADN, copierea se face în direcţia 3'  5', sintetizându-se o moleculă
complementară şi antiparalelă (5'  3') de ARNm; ea va avea aceeaşi secvenţă şi orientare ca şi
catena de referinţă. De aceea, notarea şi descrierea unei gene se fac, convenţional, referindu-se la
catena 5'  3' de referinţă a ADN.

Genele care codifică proteine prezintă o parte centrală, transcrisă (copiată) în ARN mesager
precursor, numită şi "cadrul de lectură 8" al informaţiei genetice deoarece conţine mesajul codificat
pentru sinteza proteinei, flancată de două părţi laterale, netranscrise, cu rolul de a regla expresia
genei (figura 3.12.). În descrierea acestor regiuni ne vom referi la catena 5'-3' a ADN sau catena sens

3
CICLUL CELULAR

INTERFAZA

Perioada cuprinsa intre 2 diviziuni succesivein care se desfasoara toate activitatile specifice celulare.

1. G1 presintetica

Sunt sintetizate substantele necesare cresterii si unctionarii celulare; cromozomii sunt

despiralizati, monocromatidieni, alcatuiti dintr-o molecula ADN

Cantitatea de material genetic este 2n / 46 cromozomi

G1 A acumuleaza substante necesare pana la concentratia prag (punct de restrictie)

G1 B celula se pregateste sa intre in faza S; daca nu depcaseste punctul de restrictie, celula

din G1 A trece in faza G0 (inert, metabolism redus, raman viabile timp indelungat)

Daca dispar conditiile restrictive, celulele din G0 pot reveni in G1 deoarece isi pastraza
capacitatea de diviziune; unele celule in faza G1 A parasesc ciclul celular – celule diferentiate
care nu se mai divid.

2. S sinteza

Sinteza ADN + histone

4
 Se dubleaza cantitatea ADN 2n --> 4n (conditie obligatorie pt diviziunea celulara)

2n = 46 set diploid – bicromatidieni – 2 molecule identice

3. G2 postsintetica

Sinteza de proteine specifice si a unei mici cantitati de ADN necesare in corectarea erorilor
de replicare

Cantitatea de ADN ramane nemodificata 4n

Cromozomii in set diploid sunt bicromatidici, despiralizati

La sfarsitul G2 se activeaza factorul de declansare a mitozei care determina condensarea

filamentelor de cromatina in cromozomi si formarea fusului de diviziune.

DIVIZIUNEA – FAZA MITOTICA

5
Materialul genetic replicat in faza S se distribuie total si egal nucleilor celor 2 celule fiice identice.

Celulele rezultate in urma diviziunii pot evolua dupa cum urmeaza:

1. Proliferare (compartimenul proliferativ – tesuturi embrionare, maduva hematogena,

epiderm)

2. Diferentiere (celule speciale – neuroni, hematii mature)

3. Repaus (intra in G0, compartiment neproliferativ – celule stem)

1. PROFAZA

In citoplasma: centrozomul se divide formand 2 centrozomi fiecare mergand catre un pol al celulei
formand fusul de diviziune

In nucleu are loc disparitia nucleolului, condensarea cromonemelor sub forma de cromozomi vizibili
la microscopul optic dar nu sunt bine idividualizati.

2. PROMETAFAZA

Fragmentarea membranei nucleare prin disocierea laminei nucleare si deplasarea fusului mitotic in
aria pe care a ocupat-o nucleeul ; simultan are loc dezindegrarea reticulului endoplasmatic si a
aparatului Golgi iar cromozomii se ataseaza de filamentul fusului de diviziune prin centromeri.

3. METAFAZA

Cromozomii bicromatidieni se aliniaza independent la ecuatorul fusului de diviziune in acelasi plan

formand placa metafazica

4. ANAFAZA

a.Clivarea longitudinala a centromerului prin ruperea puntilor de heterocromatina dintre kinetopori.

b.Disjunctia /segregarea cromatidiana: separarea cromatidelor surori prin scurtarea

microtubulilor .....

6
c.ascensiunea simultana a cromozomilor monocromatidieni spre polii celulei i, impartirea totala si
egala a materialului genetic intre celulele fiice.

5. TELOFAZA

Are loc fenomenul de refacere a nucleului: cromozomii se decondenseaza s se despiralizeaza

rezultand cromonemele

Fusul de diviziune se dezasambleaza, membrana nucleului se reface si reapare nucleolul.

Replicarea ADN

Replicarea şi repararea ADN

O proprietate esenţială a ADN este capacitatea de a servi ca model (matriţă) pentru autoreplicarea
sa şi sinteza unor noi molecule, identice informaţional între ele şi cu molecula iniţială. Pentru
aceasta, cele două catene ale ADN se desfac şi fiecare serveşte ca matriţă pentru aranjarea
secvenţială şi complementară a deoxiribonucleotidelor. Prin polimerizare lor se formează o catenă
"nouă" care reface împreună cu catena "veche" o moleculă de ADN (vezi figura 1.1). Replicarea
semiconservativă a ADN este cheia eredităţii: un organism parental transmite prin gameţi o replică a
ADN-ului său primei celule a descendenţilor. Astfel, prin replicare, informaţia ereditară se
perpetuează în mod stabil în cursul generaţiilor. Uneori în cursul replicării se pot produce erori, prin
împerecheri "nelegitime" (greşite) ale nucleotidelor (de tipul C-C, A-G sau A-C). Ele ar putea produce
o modificare a informaţiei genetice dacă nu ar interveni un mecanism enzimatic de "reparare"; pe
baza catenei matriţă, aceasta corijează erorile de replicare (vezi capitolul 5.A.1)

Informaţia ereditară, necesară pentru sinteza diferitelor proteine şi realizarea caracterelor

fenotipice, se transmite din generaţie în generaţie, în două etape (vezi figura 1.1): 

- biosinteza unor noi molecule de ADN identice cu molecula iniţială – prin replicare
semiconservativă – care va conduce la dublarea cantităţii de ADN;

- distribuţia totală, egală şi precisă a materialului genetic dublat, prin diviziune celulară.

Aceste procese, riguros controlate, se realizează de obicei cu mare fidelitate (exactitate) asigurând
astfel stabilitatea proceselor ereditare. Evident, ele pot suferi şi erori (de replicare sau de distribuţie)
care, în absenţa unor mijloace eficace de reparare şi eliminare a erorilor, pot avea consecinţe
importante la descendenţi, producând boli.

Transmiterea informaţiei şi caracterelor ereditare în succesiunea generaţiilor de celule şi organisme

eucariote este supusă unor legi obiective şi universale.

7
Descriind modelul structurii ADN, alcătuit din două catene polinucleotidice, antiparalele (cu
polaritate inversă), legate între ele (prin punţi de hidrogen) în mod complementar (A-T; G-C),
Watson şi Crick au intuit de la început că modelul propus de ei explică mecanismul de copiere a
informaţiei genetice: fiecare catenă serveşte drept matriţă pentru formarea unei catene noi.

Schematic, dubla spirală a ADN se separă în cele două catene componente (asemenea deschiderii
unui fermoar), formând o structură în formă de Y numită “furcă de replicare”. Fiecare catenă
serveşte apoi ca matriţă sau tipar pentru aranjarea complementară (A-T, G-C) şi secvenţială (în
direcţia 5’→3’) a deoxiribonucleotidelor activate, care vor fi polimerizate sub acţiunea ADN
polimerazei (figura 5.1.). Astfel, o moleculă bicatenară de ADN va forma două molecule noi, identice
între ele precum şi cu molecula “parentală”, fiecare formată dintr-o catenă "veche" şi o catenă "nou
sintetizată"; de aceea procesul de sinteză al ADN a fost numit replicare semiconservativă. În felul
acesta informaţia genetică a fost transmisă întocmai, în succesiunea generaţiilor de molecule.

Procesul de replicare incepe in puncte definite ale genomului numite origini de replicare si de aici
progreseaza in ambele directii pana ce ADN este complet duplicat. Dubla elice este despiralizata sub
actiunea topoizomerazelor iar catenele sunt separate temporar de catre ADN helicaze, intr-o regiune
localizata, formand o structura in forma de Y – furca de replicare. Pentru a mentine catenele
desfacute, pe fiecare catena matrita se fixeaza proteinele de replicare A sau SSB care impiedica
reimperecherea bazelor azotate si refacerea spontana a dublului helix. Pe cele doua catene matrita,
sub actiunea enzimei ADN polimeraza delta are loc aranjarea secventiala si complementara a
dezoxiribonucleotidelor activate.

Polimerizarea nucleotidelor se face diferit pe cele doua catene matrita, datorita a doua elemente
caracteristice: cele doua catene ADN sunt antiparalele si ADN polimeraza nu poate initia sinteza unei
catene noi de ADN ci doar sa o alungeasca. De aceea, declansarea replicarii ADN necesita utilizarea
unor amorse ARN sintetizate de ADN primaza. Sinteza se face numai in directia 5’--> 3’.

Aceste 2 caracteristici determina o asimetrie a replicarii. Pe catena matrita 5’ – 3’ sau catena sens,
sinteza catenei noi de ADN este continua si rapida. Aceasta se numeste catena avansata. Pe cealalta
catena matrita, catena non-sens, sinteza catene noi se face mult mai lent si discontinuu, sub forma
unor segmente scurte de ADNcare au 100-1000 de nucleotide numite piese Okazaki. Aceasta se
numeste catena intarziata. Fiecare piesa Okazaki necesita cate o amorsa de ARN, in timp ce pe
catena avansata, este necesara doar o singura amorsa ARN, la inceputul sintezei. La sfarsitul
replicarii, amorsele sunt indepartate prin hidroliza si inlocuite cu segvente de ADN sub actiunea ADN
polimerazei, iar frgmentele sunt reunite in final cu ajutorul unei ADN ligaze.

Replicarea ADN ului are loc in faza S care dureaza cca 8h (pentru un ciclu celular de 24h).

Bolile prin mutaţii somatice sunt produse prin efectul cumulativ al unor mutaţii somatice succesive,
în gene diferite, unele determinate de factori de mediu, altele prin erori de replicare a ADN. Ex.
marea majoritate a cancerelor, multe boli autoimune şi procesul de îmbătrânire. Aceste boli se
produc după concepţie, sunt limitate la celulele somatice şi deci NU se transmit la descendenţi; într-
un procent mic de cazuri o mutaţie iniţială (importantă dar nu suficientă pentru producerea bolii) se
poate moşteni de la unul din părinţi, producând o predispoziţie genetică la boală (ex., mutaţia genei
BRCA1 în cancerul de sân familial).

8
REPLICAREA ADN ARE LOC ÎN FAZA S A CICLULUI CELULAR.

Celulele umane realizează procesul de replicare într-o perioadă particulară a ciclului lor de viaţă, faza
S. Toate celulele ce se divid trec prin acest ciclu celular alcătuit din patru faze G1, S, G2 – ce
corespund interfazei - şi M sau faza mitotică. In celulele de mamifere faza S durează circa 8 ore
(pentru un ciclu celular de 24 de ore); este un timp scurt pentru replicarea întregului genom uman
diplod de peste 6 miliarde de pb. La această constrângere temporală se adaugă obligaţia ca
replicarea ADN să fie foarte precisă deoarece orice eroare de plasare a nucleotidelor în catena nou
sintetizată produce mutaţii. Celula are mijloacele necesare pentru a se asigura că întregul genom
este integral şi corect replicat în cursul fazei S. La aceasta se adaugă mecanisme multiple de
identificarea şi corecţie a erorilor Reglarea replicării ADN - se realizează prin interacţiuni coordonate
între diferite proteine:

ciclinele, CDK, inhibitoriii CDK , precum şi anumiţi factori de transcripţie (care activează punctele de
origine ale replicării)(vezi 5.B.1):

 Ciclinele5 D şi E facilitează trecerea G1/S iar ciclina A asigură progresia prin faza S;

 CDK4 este o protein kinază activatoare;

 Factorii de transcripţie: RLF (inclus în complexul de pre-replicare) - activează punctele de origine a

replicării şi împiedică re-replicarea în cursul aceluiaşi ciclu iar E2F stimulează expresia genelor
necesare intrării în faza S;

 Inhibitorii kinazelor dependente de cicline sau CKI (proteinele P21, P27 ş.a.) formează al doilea
nivel de reglare al intrării şi progresii celulelor prin faza S; ei blochează aceste procese (inhibând
complexele CDK-cicline şi PCNA) fie atunci când apar leziuni în ADN fie în cursul diferenţierii
terminale a unui ţesut (însoţită de pierderea capacităţii de replicare şi diviziune).

Unităţile de replicare (ce includ 20-80 repliconi) nu sunt activate concomitent şi la întâmplare ci
asincron şi într-o anumită ordine, în funcţie de structura cromatinei în care ele se găsesc. Cromatina
puternic condensată (heterocromatina) este replicată tardiv, la sfârşitul fazei S, în timp ce
eucromatina, mai decondensată, se replică precoce, la începutul fazei S. Deci regiunile din genom în
care cromatina este mai puţin condensată şi deci mai accesibilă maşinăriei de replicare sunt replicate
mai precoce; acestea sunt de regulă benzile R (bogate în G-C) regiuni de ADN care conţin în special
genele "domestice" (active în toate celulele). Regiunile din cromosomi care sunt replicate tardiv
coincid cu benzile G, bogate în A-T.

In mod normal, în faza S întregul genom este replicat o singură dată. Deoarece replicarea ADN este
asincronă există riscul teoretic ca unele regiuni să fie replicate repetat. Acest lucru nu se întâmplă
deoarece o serie de factori inhibitori se fixează pe cromatina replicată şi nu permit replicarea ei
repetată, până ce celula nu trece prin mitoză. Aceşti factori sunt îndepărtaţi prin diviziune şi celulele
rezultate pot începe un nou ciclu, cu faza S, în care se produce o nouă replicare.

9
Implicaţii şi aplicaţii medicale din studiul replicării ADN-ului.

Testele genetice predictive vor avea o eficienţă mică asupra morbidităţii şi mortalităţii, deoarece o
proporţie redusă din populaţie este afectată de boli monogenice iar rata mutaţiilor noi este destul
de importantă. Testele de susceptibilitate identifică numai o predispoziţie la boală nu şi riscul efectiv
de boală (determinat de parametri mai complexi). În plus, persoanele cu risc (de exemplu pentru
cancer) au încă opţiuni terapeutice reduse

Până în 1970 genele erau entităţi materiale inaccesibile analizei directe din cauza dimensiunilor
foarte mici şi imposibilităţii obţinerii unei cantităţi suficiente de material pentru studiu. În acel an s-
au descoperit enzimele de restricţie, veritabile "bisturie" genetice, cu ajutorul cărora a devenit
posibilă secţionarea ADN şi izolarea genelor. Aproape concomitent s-au introdus alte noi tehnologii
de studiu ale ADN, care au făcut posibilă combinarea moleculelor de ADN de la diferite specii (ADN
recombinant) precum şi clonarea genelor.

Termenul de ADN recombinant se referă la combinaţiile noi de ADN obţinute între anumite secvenţe
de ADN uman (sau de la alte organisme) şi molecule de ADN bacterian (sau de la alte specii),
capabile să se replice indefinit (formând clone moleculare) sau să exprime, într-o celulă gazdă,
informaţia genetică pe care o conţin.

Tehnicile de ADN recombinant au inaugurat "era ingineriei moleculare" care schimbă statutul
geneticienilor, transformîndu-i din observatori în "manipulatori" de gene. În numai două decenii, s-
au obţinut rezultate extraordinare în descifrarea structurii şi funcţiei genelor şi aplicarea noilor
cunoştinţe în medicină (pentru depistarea, diagnosticul şi tratamentul bolilor), industria
farmaceutică (obţinerea de proteine terapeutice şi noi vaccinuri), agricultură şi zootehnie (utilizarea
unor biotehnologii în ameliorarea plantelor şi animalelor). Se poate afirma fără nici o rezervă că
tehnologia ADN recombinant a produs o noua şi importantă revoluţie în biologie şi medicină,
comparabilă cu descoperirea microscopului, care a deschis era medicinii moleculare.

Tehnicile ADN recombinant se pot grupa în două mari categorii:

 clonarea ADN sau amplificarea selectivă a unei gene / secvenţe de ADN, bazată în esenţă pe
multiple runde de replicare a ADN, care vor produce un număr mare de copii ale fragmentului
respectiv; clonarea poate fi celulară, in vivo, când se foloseşte mecanismul natural al replicării ADN
sau acelulară, in vitro, bazată pe reacţia de polimerizare în lanţ (PCR).

 analiza ADN sau detecţia specifică a unei secvenţe de ADN sau ARN, bazată pe hibridizarea
moleculară (prin complementaritate) a unei sonde marcate de acid nucleic, cu secvenţa respectivă.

Clonarea ADN in vivo in celula utilizează mecanismul natural de replicare al ADN în celule şi implică
patru etape majore (figura 3.16):

 formarea ADN recombinant, prin ataşarea in vitro a fragmentelor de ADN uman la "un vector sau
replicon " capabil de replicare independentă;

10
 transformarea: moleculele de ADN recombinant sunt transferate în celule gazdă în care vectorul
recombinant se replică independent de cromosomul celulei gazdă;

 amplificarea sau producerea de clone celulare multiple.

 izolarea clonelor de ADN recombinant prin oprirea culturilor şi izolarea selectivă a ADN
recombinant.

Clonarea moleculara se bazeaza pe izolarea unei secvente ADN de interes pentru a obtine copii
multiple in vitro. Aceasta metoda a castigat teren in microbiologie deoarece presupune costuri
reduse, este simpla, rapida si eficienta.

Clonarea moleculara are multiple roluri in microbiologia clinica in contextul infectiilor

polimicrobiene, antigene recombinate, vaccinuri obtinute prin recombinare, peptide antimicrobiene,
si citokine recombinante. Metodele bazate pe cultura prezinta multiple limitari in infectiile
polimicrobiene, acestea fiind depasite prin tehnicile de clonare.

Antigenele recombinante obtinute prin clonare sunt folosite in prezent pentru screeningul infectiilor
cu HIV, HCV, HBV, CMV, Treponema pallidum, si alti agenti infectiosi.

De asemenea, vaccinurile obtinute cu antigene recombinante pentruhepatita B, holera, influenza A

au inlocuit vaccinurile cu virus viu reducand astfel riscul efectelor adverse.

Sondele genetice obtinute prin clonare pot fi folosite in diagnosticul precoce al bolilor ereditare,
medicina legala si diagnostice de rutina.

Aceasta tehnologie se foloseste si in industria farmaceutica in producerea de noi antibiotice sub

forma peptidelor antimicrobiene si a citokinelor recombinante ce pot fi folosite drept agenti
terapeutici.

.1

OBŢINEREA UNOR GENE/ FRAGMENTE DE ADN.

Pentru obţinerea unor fragmente de ADN în vederea amplificării şi analizei ulterioare, se pot folosi
trei metode: secţionarea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor de restricţie; formarea unei copii de
ADN complementară unei molecule de ARN mesager extras din citoplasmă, utilizându-se
transcriptaza inversă; sinteza artificială (chimică) prin polimerizarea nucleotidelor după o secvenţă
prestabilită, cu ajutorul ADN polimerazei.

a). Secţionarea ADN cu enzime de restricţie

Enzimele de rectricţie13 sunt mijloace naturale de apărare ale unor bacterii contra infecţiilor cu
virusuri; bacteriile reuşesc să limiteze (în engleză, "to restrict") creşterea virusului infectant, printr-
un proces în care ADN fagic este selectiv recunoscut şi degradat enzimatic, în timp ce ADN bacterian
rămâne protejat de această acţiune distructivă14. Enzimele de restricţie nu secţionează ADN la

1
Advances and applications of molecular cloning in clinical microbiology, Kamal Sharma 1, Ajay Kumar Mishra,
Vikram Mehraj, Ganesh Selvaraj Duraisamy Biotechnol Genet Eng Rev 2014 Oct;30(1-2):65-78.

11
întâmplare ci au un grad înalt de specificitate: ele "scanează" ADN şi se opresc atunci când recunosc
o secvenţă nucleotidică specifică, numită situs de recunoaştere şi clivare sau situs de restricţie.

Situsul de restricţie este alcătuit de obicei din 4-6 perechi de baze (rar mai mult de 8 sau mai multe),
dispuse în palindrom deci inversate (o catenă are secvenţa inversă a celeilalte catene; ambele catene
"citite" în sensul 5' 3' au însă aceiaşi secvenţă) (tabel 3.1.). Situsurile de restricţie sunt localizate de
regulă în regiunile intergenice necodante; rareori pot fi şi intragenice, găsindu-se deobicei în introni.

Enzimele de restricţie secţionează ambele catene ale moleculei de ADN la sau lângă situsul de
restricţie; ele sunt endonucleaze deoarece hidrolizează legăturile fosfodiester dintre nucleotide,
totdeauna spre interiorul moleculei. Se cunosc câteva sute de enzime de restricţie, deosebite prin
sursa bacteriană din care provin şi secvenţele nucleotidice pe care le recunosc şi clivează în ADN.

După modul în care secţionează ADN în situsul de recunoaştere enzimele de restricţie sunt de două
feluri (tabelul 3.1): unele enzime (de ex. Eco RI) realizează secţiuni asimetrice (decalate) ale
catenelor şi produc fragmente care au capetele "proeminente", cu o prelungire de 4 baze pe una din
catene; aceste capete se mai numesc "adezive (coezive)" deoarece au tendinţa să se asocieze unul
cu altul sau la o altă extremitate ce posedă o secvenţă complementară (figura 3.16); alte enzime (de
ex. Hae III) taie simetric (la acelaşi nivel) ambele catene şi produc capete "drepte"; ele nu se pot
asocia spontan, ca în primul caz, ci numai sub acţiunea unor ADN ligaze. Există de asemeni enzime a
căror activitate este inhibată de prezenţta metilării ADN (precum HpaII sau NotI), sau dimpotrivă,
care sunt capabile să secţioneze la nivelul situsului de restricţie numai atunci când ADN-ul este
metilat.

Clivarea moleculei de ADN cu o anumită enzimă de restricţie "fragmentează" ADN într-un număr
definit, caracteristic şi reproductibil de fragmente, care reflectă localizarea şi frecvenţa situsurilor
specifice de clivare sau harta de restricţie. Situsurile de restricţie sunt dispuse la distanţe variate iar
fragmentele produse prin secţionare sunt inegale; pe această bază, ele pot fi uşor separate prin
electroforeză.

În acest context este util de subliniat un ultim aspect privind situsurile de resctricţie. Diferite mutaţii
pot modifica situsul de restricţie (care nu va mai fi cunoscut de enzimă) sau pot crea situsuri noi. De
aceea clivarea ADN cu aceiaşi enzimă de restricţie va produce la persoane diferite din populaţie
fragmente de ADN cu lungimi diferite. Se realizează un amplu fenomen de "polimorfism al lungimii
fragmentelor de restricţie" (RFLP), care poate fi folosit ca un marker genetic preţios în diagnosticul
unor boli genetice (vezi capitolul 9.B.2).

În afara acestor particularităţi trebuie să precizăm un lucru important: o anumită enzimă de

restricţie produce capete adezive indentice atunci când secţionează molecule de ADN diferite (figura
3.16) . Datorită acestei caracteristici două fragmente de ADN cu origini diferite dar produse de
aceiaşi enzimă de restricţie se pot uni pe bază de complementaritate producând o moleculă hibridă
de ADN recombinant15.

Enzimele de restricţie au devenit instrumentul de bază al ingineriei genetice, "bisturiul" cu care se

fac toate "operaţiile moleculare" asupra ADN: corecţii, amputaţii şi mai ales "transplante" de gene.

b). Obţinerea de ADN complementar

12
O altă metodă de a obţine gene foloseşte ca material de lucru ARN mesager, produsul (transcriptul)
primar al genei, extras din citoplasma unei celule care îl sintetizează din abundenţă (de ex., ARNm
pentru beta-globină izolat din hematii tinere). Molecula monocatenară de ARN mesager serveşte ca
matriţă pentru sinteza unei catene de ADN complementar (ADNc) realizată de enzima transcriptază
inversă.. Pe baza primei catene de ADN se sintetizează şi cea de a doua catenă; astfel se obţine o
moleculă ADNc bicatenar care va corespunde genei (mai exact exonilor din genă) care în celulă a
produs (prin transcripţie) ARNm ce a servit ca matriţă pentru ADNc. În acest mod s-a sintetizat
pentru prima dată gena pentru beta globină.

c). Sinteza "artificială" (chimică) a unor fragmente de ADN.

Metoda se bazează pe polimerizarea deoxiribonucleotidelor ce alcătuiesc o catenă de ADN, într-o

ordine prestabilită/determinată anterior. Ea se deduce pe baza secvenţei de aminoacizi a proteinei
codificată de genă, cu ajutorul codului genetic, care stabileşte pentru fiecare aminoacid codonul
(trinucleotidul) corespunzător. Alteori, secvenţa de nucleotide a genei ce va fi sintetizată se
stabileşte prin alte metode. Această tehnică se foloseşte mai des pentru obţinerea unor
oligonucleotide corespunzătoare unei părţi din genă, utilizate fie ca sonde fie ca amorse, în alte
tehnici de analiză moleculară.

1.2. CONSTRUCŢIA MOLECULELOR DE ADN RECOMBINANT

După obţinerea unor fragmente de ADN uman analiza sau utilizarea genelor necesită multiplicarea
fragmentului într-o cantitate suficientă. Pentru aceasta, genele se inseră într-un replicon sau vector
şi cu ajutorul lui sunt introduse într-o celulă gazdă (bacterii, levuri etc), unde vor fi multiplicate.
Deoarece vectorii pot forma prin replicare un număr mare de copii per celulă şi întrucât gazdele pot
fi crescute indefinit în laborator se pot obţine mari cantităţi din secvenţa de ADN inserată (genă).

Unirea a două fragmente de ADN de origini diferite produce o moleculă de ADN recombinant. Pentru
aceasta, moleculele de ADN din cele două surse sunt secţionate cu aceiaşi enzimă de restricţie; se
produc capete complementare identice care fiind coezive se pot uni pe bază de complementaritate
şi produce o moleculă hibridă de ADN recombinant (figura 3.16). Legăturile sunt stabilizate cu
ajutorul unei ADN ligaze. Talia fragmentului exogen inserat depinde de tipul de vector.

a). Vectorii.

Un vector este o moleculă naturală de ADN utilizată pentru transportul secvenţelor de ADN exogen
într-o celulă gazdă. El trebuie să fie capabil să se replice activ şi independent de genomul gazdei (de
aceea se mai numeşte şi replicon), din care apoi va fi izolat în formă pură. Vectorul care include un
fragment de ADN exogen se numeşte vector recombinant iar procesul de încorporare a plasmidelor
recombinante în celulele gazdă este numit transformare În tehnicile de clonare se utilizează frecvent
patru tipuri principale de vectori, deosebiţi prin mărimea fragmentelor de ADN exogen pe care-l pot
insera: plasmide, bacteriofagi, cosmide, cromosomi artificiali

1.3. TRANSFORMAREA

Moleculele de ADN recombinant sunt transferate (încorporate) în celule gazdă (de obicei bacterii
nepatogene modificate18,) în care vectorii recombinanţi se vor multiplica independent (autonom)
de cromosomul bacterian, formând mai multe exemplare identice. Introducerea unui vector într-o
celulă bacteriană se numeşte transformare.

13
Procedura de inserţie este specifică fiecărui tip de vector (de ex. în cazul plasmidelor membrana
bacteriilor va fi tratată special19 iar în cazul fagilor, ADN recombinant va fi mai întâi "împachetat" în
capsula virală).

Trebuie subliniat că o celulă gazdă competentă fixează numai o singură moleculă de ADN
recombinant; fiecare celulă transformată va forma o clonă specifică (figura 3.16)

1.4. AMPLIFICAREA

Bacteriile transformate sunt supuse multiplicării. În cazul clonării cu vectori plasmidici celulele
bacteriene sunt însămânţate pe suprafaţa unei plăci cu agar, unde cresc şi formează colonii sau clone
(populaţii de celule identice, descendente dintr-o singură celulă) distincte. Apoi, coloniile sunt
prelevate şi cultivate individual într-un flacon cu mediu lichid, unde se produce o nouă expansiune a
numărului de celule (figura 3.16). Dacă celula iniţială conţinea un vector recombinant atunci - prin
multiplicarea lui precum şi a celulelor ce-l conţin - se realizează o amplificare enormă a fragmentului
de ADN ataşat vectorului.

1.5. IZOLAREA CLONELOR DE ADN RECOMBINANT.

Celulele care au încorporat vectorul recombinant se vor selecta datorită unor caractere fenotipice
particulare. Astfel, creşterea bacteriilor pe un mediu cu ampicilină selectează acele celule care conţin
copii ale plasmidului (cu gena de rezistenţă la ampicilină inserată) ce conferă bacteriei rezistenţă la
acest antibiotic (figura 3.16). Se formează o colonie de bacterii cu ADN recombinant.

La fel, proliferarea fagilor într-o bacterie se traduce prin liza sa: pe culturi în geloză, recombinanţii nu
se evidenţiază prin clone ci prin plaje de liză, pe un "fond" de bacterii normale. Prezenţa ADN
recombinant în structura vectorului este adeseori identificată pe baza inactivării inserţionale a unei
gene. Un astfel de sistem este acela al beta-galactozidazei. Situsul de inserţie este situat în interiorul
acestei gene din structura vectorului. Prezenţa ADN recombinant va determina inactivarea acestei
gene şi, ca urmare, va aboli capacitatea celulelor bacteriene transformate de a transforma Xgal întro
substanta albastră. Există şi alte metode de screening şi selecţie a clonelor de ADN. După selecţie,
celule sunt procesate pentru a se extrage şi purifica clona de ADN recombinant. Această procedură
se va face pentru fiecare colonie bacteriană ce conţine un anumit fragment de ADN genomic.

Rezultă o colecţie sau o bancă (bibliotecă) de clone de ADN ("DNA libraries") din populaţia iniţială de
fragmente de ADN.

Denaturarea şi hibridizarea ADN.

În condiţii experimentale se poate produce ruperea (desfacerea) legăturilor de hidrogen dintre cele
două catene, prin denaturare termică (încălzire la 63-100°C) sau chimică (tratament cu alcali etc.)
(figura 2.6). Acest proces de conversie a ADN de la forma bicatenară la starea monocatenară se
numeşte denaturare. Prin răcirea lentă a soluţiei, monocatenele de ADN se pot reasocia pe baza
complementarităţii şi refac structura originală; procesul se numeşte renaturare sau hibridare. Viteza

14
de reasociere este funcţie de concentraţia ADN şi timp (se numeşte cot de la concentraţie x timp;
valoarea cot la care se produce o asociere de 50% se numeşte cot 1/2). Prin răcire bruscă
monocatenele ADN rămân separate şi pot fi folosite pentru realizarea unor hibrizi moleculari (pe
baza complementarităţii dintre catene ) de tip ADN-ADN, fie între două molecule de ADN de la specii
diferite fie între fragmente de ADN obţinute artificial ("sonde", ce corespund unei gene) şi regiunea
corespunzătoare, complementară din ADN nativ. Se pot obţine de asemeni hibrizi între o catenă
ADN şi o moleculă de ARN complementară (de tip ARNm) rezultând un heteroduplex. Fenomenele
de denaturare şi hibridare sunt amplu utilizate în biologia moleculară, în tehnicile ADN recombinant,
pentru identificarea sau localizarea unor gene şi, mai recent, în terapia cu oligonucleotide antisens
(în cancere, SIDA) care se fixeză pe secvenţe de ADN sau pe ARNm şi blochează expresia genelor.

Hibridizarea fluorescentă in situ FISH

Tehnicile de generaţia IV-a (1991) sunt tehnici de citogenetica moleculară. Ele folosesc "sonde" de
ADN monocatenar, specifice unei anumit cromosom, regiuni cromosomice (centromer sau telomere)
sau unor gene cu localizare cunoscută în anumite zone. Sondele se fixează (hibridizează) prin
complementaritate în aceste situsuri "ţintă". Pentru a fi evidenţiate după hibridizare, sondele sunt
'marcate' cu un fluorocrom (vizibil la microscopul cu lumină UV). De aceea metoda se numeşte
hibridizare fluorescentă in situ sau, prescurtat, FISH (de la Fluorescence In Situ Hybridization).
(caseta 2.3)

FISH este o metodă performantă (rezoluţia pe cromosomi metafazici este de câteva megabaze) dar
dificilă şi scumpă. Ea are indicaţii precise şi nu se substituie celorlalte tehnici citogenetice. Se
foloseşte pentru: suspiciunea clinică / citogenetică a unei microdeleţii (figura 2.24.a şi b) sau
microduplicaţii, a unor translocaţii criptice sau deleţii telomerice; detecţia sexului genetic sau a unor
aneuploidii în nucleii interfazici (FISH “interfazic”; figura 2.24.c), mai ales din celulele fetale
(diagnostic prenatal); caracterizarea unor remanieri complexe sau a unor cromosomi markeri, mai
ales în celulele tumorale; detectarea unor secvenţe de Y la bărbaţii XX; evaluarea unui mozaicism.

Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH)

Principiul acestei metode de citogenetică moleculară este hibridizarea prin complementaritate, a

unei sonde de ADN monocatenar (de circa 40 kb) cu o anumită regiune a unui cromosom. Sonda
ADN este marcată fie direct prin încorporarea unui nucleotidfluorescent, fie indirect prin
încorporarea unui nucleotid modificat ce conţine o moleculă "reporter" (cum ar fi biotina sau
digoxigenina) care este recunoscută de un ligand specific (streptavidina pentru biotină şi anticorpi
specifici pentru digoxigenină) conjugat cu un flourocrom.

Sondele pot fi clasificate în 4 tipuri, în funcţie de aplicaţia practică:

 Sonde specifice unui locus dat, pentru detectarea deleţiilor sau duplicaţiilor submicroscopice; dacă
sonda NU se fixează pe zona cromosomică căreia îi corespunde (absenţa semnalului colorat), atunci

15
se poate concluziona deleţia (pierderea) acestei zone; apariţia a două semnale indică o
microduplicaţie. Astfel, se pot decela anomalii segmentare foarte mici, la limita de rezoluţie a
microscopului optic. Acest tip de sonde se folosesc şi pentru stabilirea precisă a punctelor de ruptură
în cazul translocaţiilor.

 Sonde centromerice (alfoide) pentru identificarea centromerului unui anumit cromosom; pot fi
utilizate în nucleii interfazici sau pe cromosomii metafazici

 Sonde telomerice.

 Sonde specifice unui cromosom permit "colorarea" particulară a unui /unor cromosomi
(chromosome painting); "pictura cromosomică" poate evidenţia remanieri cromosomice mici; în
acest grup se includ şi sondele corespunzătoare ADN genomic, folosite în hibridizarea genomică
comparativă.

Ţintele sunt multiple:

 ADN din cromosomii metafazici; nivelul de rezoluţie este de ordinul a 1-3 Mb

 ADN din nucleii interfazici ai celulelor fetale; hibridizarea unor sonde de ADN specifice anumitor
cromosomi (de ex. 21, 18, 13, X şi Y) cu nuclei interfazici permite diagnosticul prenatal rapid (fără
cultură) al unor anomalii de număr ale cromosomilor respectivi, fără să fie nevoie de efectuarea
cariotipului (ex. trei spoturi fluorescente obţinute cu sonda pentru cromosomul 21 pune diagnosticul
de trisomie 21); nivelul de rezoluţie este de ordinul 100 Kb.

 Molecule de ADN prealabil "alungite" prin procedee fizice sau chimice; această metodă permite
individualizarea a două sonde distanţate la 1 Kb.

 Întregul cromosom. Prin folosirea unui amestec de secvenţe ce corespund diferitelor părţi dintr-un
anumit cromosom se poate obţine colorarea sa integrală cu un anumit fluorocrom ("chromosome
painting"). Metoda a fost ulterior dezvoltată: folosind sonde cu secvenţe din fiecare cromosom, o
combinaţie de mai mulţi fluorocromi (Multiplex FISH) şi analiza digitală automată a imaginilor (cu o
cameră CCD) este posibilă colorarea diferită a fiecărui cromosom din cariotip. O variantă a acestei
metode este cariotiparea spectrală (SKY) ce utilizează combinaţii variate a cinci probe fluorescente, o
cameră specială de luat imagini şi un soft de procesare a imaginilor ce permite ca fiecare cromosom
să aibe o coloraţie particulară, unică, ce face posibilă detectarea oricărui rearanjament cromosomic.

 Întregul genom. O metodă larg folosită în studiile citogenetice în cancer este Hibridizara Genomică
Comparativă (CGH): ADN test (de ex., tumoral) este marcat cu un fluorocrom verde iar ADN normal
(control) cu unul roşu; cele două probe, amestecate, sunt hibridizate cu cromosomi metafazici
normali. Raportul semnalului verde sau roşu pe cromosomii metafazici hibridizati indică localizarea
unei duplicaţii (exces de verde) sau deleţii (exces de roşu) din ADN test

Esenţa transcrierii (transcriptie) şi aplicaţii medicale.

Transcriptia este procesul de copiere a informatiei geneticea unei gene sub forma codificata,
complementara si antiparalela intr-o molecula de ARN. Acest process are loc in nucleu.

ARN ul este un polimer de ribonucleotide alcatuit din 3 componente:

16
 - Riboza (glucid)

- Un fosfat

- Baza azotata purinica sau pirimidinica

Prin polimerizarea ribonucleotidelor in directia 5’  3’ rezulta o monocatena de ARN

Exista mai multe tipuri de ARN cu functii diferite:

- ARNm – este codant, prin translatie va determina sinteza unui polipeptid;

- ARNr – implicat in formarea ribozomilor

- ARNt – intervine in transportul aminoacizilor la ribozomi in procesul translatiei.

Pentru a sintetiza ARNm in vivo sunt necesare:

- AND ca model sau matrita;

- Enzima ARN polimeraza II;

- Factori de transcriptie care orienteaza si activeaza enzima;

- Ribonucleotide activate care prin polimerizare alcatuiesc catena de ARN.

Cele doua catene ale AND ului, catena transcrisa (3’-5’) si catena de referinta (5’-3’) au o
nomenclatura diferita. ARNm care se formeaza prin transcriptie va avea aceeasi secventa de
nucleotide (exceptand inlocuirea T cu U) si acelasi sens (5’-3’) ca si catena AND netranscrisa – se va
numi catena sens. Catena transcrisa se va numi antisens.

Procesul de transcriptie la eucariote se desfasoara in doua etape determinate de structura

discontinua a genelor.

- Formarea ARN mesager precursor (pre ARNm)sau transcriptul primar, prin transcriptia
integrala a genei;

- Maturarea pre ARNm printr-o serie de modificari din care rezulta ARNm matur ce va trece in
citoplasma.

Formarea ARNm precursor

Formarea pre-ARNm începe prin decondensarea zonei de ĄDN care conține gena sau genele ce vor
fi trancrise. Acest proces, care implica interventia unor factori de transcripțię, modificarea chimica a
histonelor, va reduce gradul de compactare a filamentelor de nucleosomî.

Formarea pre-ARNm se realizează în trei etape.

1. Initierea transcriptiei

Prin convenție primul nucleotid din ADN cu care se începe transcripția reprezintă “situsul de inițiere
al transcripției" SIT sau INR) și este numit +1 iar nucleotidul care îl precede -1.

Primul ”pas al transcripției este fixarea ARN polimerazei in regiunea promotor, situată șpre-capătul
5’ al genei, in amonte de-S.I.T. ARNpolimeraza nu poate recunoaște direct promotorul și nici nu
poate iniția singură transcripția. Pentru aceasta sunt necesari o serie de factori de transcripție care

17
se fixează pe secvențele promotorului pentru a ghida si active ARN polimeraza.pentru a începe
transcripția la SIT, cu nucleotidul +1.

2. Transcriptia propriu zisa (elongatia)

După fixarea ARN polimerazei cele doua catene-ale-AND sunt.separate și catena transcrisa 3’-5’
serveste drept matrita pentru asezarea secventiala si complementara a ribonucleotidelor_ąctivate,
care vor fi apoi polimerizate de către ARN polimerază , formându-se pre-ARNm.

Transcriptia se face numai in sensul 5’-3’ deci pre ARNm este natiparalel fata de catena transcrisa.
Pre-ARNm se desprinde treptat de pe catena transcrisa și rămâne fixat temporar numai la capătul 3'.

Cele două catene ale ADN se reunesc treptat, sub acțiunea unei topoizomeraze și refac
dublul helix. In molecula de ARNm precursor sau transcriptul primar sunt copiați atat exonii cat si
intronii.

Când ARN polimeraza întâlnește situsul de terminare a transcriptiei are loc clivarea 3’ a transcriptului
primar.

2. MATURAREA ARNm PRECURSOR

Cuprinde 2 etape distincte în care transcriptul primar devine disponibil în procesul translației:

1.modificarea extremităților ARNm precursor

Determina cresterea stabilitatii sale, faciliteaza transportul in citoplasma, recunoasterea si fixarea la

subunitatea mica ribozomala.

La extremitatea 5’ se adauga la primul nucleotid al transcriptului primar o molecula de 7-metil-

guanozina care formeaza o structura speciala numita boneta.

La extremitatea 3’ se adauga un rest de 50-200 nucleotide cu A (aminoacyl) rezultand coada

poliadenilica.

2.procesarea sau prelucrarea ARNm precursor

Transcrptul primar contine intreaga regiune centrala a genei initiale, adica segvente codante, exoni si
segvente necodante, introni. Dupa sinteza, transcriptul primar sufera o procesare complex ace
consta in decuparea precisa si eliminarea intronilor, urmate de reunirea exonilor care vor forma
ARNm matur.

Fenomenul de eliminare prin decupare al intronilor si de reunire al exonilor se numeste MATISARE

Ordinea exnilor in AND si transcriptul primar este pastrata in ARNm matur. Exista o anumita
flexibilitate in utilizarea exonilor, in sensul ca, in cellule diferite, vo fi “retinuti” in ARNm matur numai
o parte din exoni, altii putand fi indepartati odata cu intronii. Acest process denumit MATISARE
alternative a exonilor explica producerea in tesuturi diferite a unor mesageri si deci a unor proteine
diferite (asemanatorare dar nu identice) pe baza informatiei unei singure gene.

Erorile mecanismelor moleculare ale exprimarii informatiei genetice vor genera firesc, o serie de
boli; descifrarea acestor mecanisme va creste posibilitatile de diagnostic si tratament.

18
Esenţa traducerii (translatie) şi aplicaţii medicale.

Translatia reprezinta decodificarea informatiei genetice din ARNm care determina aranjarea
secventiala specifica a aminoacizilor si polimerizarea lor intr-o catena polipeptidca.

Translatia necesita un dictionary reprezentat de codul genetic si un apparat de translatie care sa

includa si un traducator care este reprezentat de ARNt.

Etapele procesului de translatie

1. Initierea translatiei

Este o etapa complexa care va plasa primul aminoacid al proteinei AA1 in dreptul codonului
initiator AUG din ARNm care corespunde metioninei. Totodata se asambpleaza cele doua unitati
ribozomale formand ribozomul activ.

ARNm rezultat din trascriptie se fixeaza pe subunitatea mica cu extrmitatea 5’, formandu-se n
complex de initiere a translatiei alcatuit din ARNm, ARNt1 incarcat cu aminoacidul 1 (metionina)
si factorii de initiere. Molecula de ARNt1 ce poarta AA1 se plaseaza in situsul P al subunitatii mari
ribozomale astfel incat anticodonul vine in contact cu codonul initiator AUG din ARNm. Cel de-al
doilea situs este liber.

2. Elongatia

Este o etapa relative simpla si repetata succesiv, care conduce la formarea de legaturi peptidice
inaranjati secvential pe baza ordinii codonilor din ARNm.

In situsul P ribosomal se afla ARNt1 – AA1 iar in situsul A liber vine si se plaseaza ARNt-2 incarcat
cu AA-2, codificat de al 2lea codon din ARNm.

Intre cei 2 ainoacizi se formeaza o legatura peptidica prin intermediul peptidyl transferazei,
rezultand un dipeptide care va ramne atasat de molecula de ARNt2.

Dupa formarea dipeptidului in prezenta unor factori de elongatie GTP si a unei translocaze,
rbozomul se deplaseaza cu 3 nucleotide in directia 5’-3’. Astfel, situsul P va fi ocupat de ARNt2 cu
dipeptidul format iar in situsul A devenit lier se va fixa ARNt3 incarcat cu AA3 ce corespunde
celui de-al 3lea codon din ARNm.

Intre dipeptid si AA3 se formeaza o noua legatura peptidica, rezultand un tripeptid, apoi
ribozomul se deplaseaza din nou cu 3 nucleotide.

Dupa elongatie rezulta in final un polipeptid.

3. Terminarea translatiei

Elongatia se opreste in momentul in care ribozomul ajunge in dreptul unuia dintre cei 3 codoni
stop din ARNm. Acestia nu seminifica nic un AA si translatia se opreste.

Polipeptidul format este eliberat, iar cele 2 unitati ribozomale se disociaza pentru o noua
translatie.

19
Aplicatii medicale

Genomul uman si aplicatii medicale ale studierii acestuia

 identificarea genele asociate cu variate caracatere biologice, inclusiv boli, şi identificarea
variantele alelice ale genelor şi profilurilor de expresie în diferite ţesuturi normale sau
anormale.
 interacţiunea complexe dintre gene precum şi între gene şi mediu.
 orientarea practicii medicale de la diagnostic şi tratament la predicţie şi profilaxie, bazate pe
gene de susceptibilitate
 farmacogenomica va permite un tratament bazat pe genotipul individual, va descoperi noi
„ţinte” pentru medicamente şi va „rafina” specificitatea lor de acţiune
Posibile limitari
 corelaţia dintre genotip şi fenotipul clinic (mai ales în bolile comune) va fi dificilă datorita
interacţiunilor complexe intre gene şi cu mediul
 Testele genetice predictive vor avea o eficienţă mică asupra morbidităţii şi mortalităţii,
deoarece o proporţie redusă din populaţie este afectată de boli monogenice iar rata
mutaţiilor noi este destul de importantă. Testele de susceptibilitate identifică numai o
predispoziţie la boală nu şi riscul efectiv de boală (determinat de parametri mai complexi). În
plus, persoanele cu risc (de exemplu pentru cancer) au încă opţiuni terapeutice reduse

Numeroasele descoperiri din ultimul deceniu au avut efecte importante asupra teoriei şi practicii
medicale. Vom enumera cele mai importante consecinţe.
 Diagnosticul genotipic. În plan diagnostic, perfecţionarea metodelor de analiză moleculară, la nivel
genic, a permis ameliorarea capacităţii de identificare a unor boli, indiferent de vârsta pacientului
(făt, nou născut, copil, adult) şi deseori înainte de manifestarea clinică a bolii (presimptomatic).
Diagnosticul genotipic devine astfel o nouă şi eficace acţiune în medicina practică. Deasemeni, cu
ajutorul unor sonde specifice, se pot detecta genomurile unor virusuri, bacterii şi paraziţi care
infectează organismul uman.
 Farmacologia genomică şi terapia genică. Pe plan terapeutic tehnicile de ADN recombinant au dus
la obţinerea unor noi mijloace şi soluţii terapeutice. A început fabricarea industrială a unor proteine
umane cu valoare terapeutică (insulină, interferon, hormon de creştere, eritropoietină, factor VIII,
streptokinază, ş.a.) prin inserţia unor gene umane în bacterii şi cultivarea lor în bioreactoare. A
apărut farmacologia "genomică" în care prin sinteza unor inhibitori ai transcripţiei genelor mutante
sau a unor oligonucleotide anti-sens (complementare ADN sau mARN) se încearcă blocarea
funcţionării genelor mutante sau a genomurilor exogene a unor virusuri (de ex., HIV). A devenit
operaţională (din 1991) şi terapia genică, în care prin fabricarea şi introducerea unor gene normale
în celulele somatice ale unor bolnavi cu afecţiuni genetice grave se poate ameliora / corija efectul
genelor mutante.
 Profilaxia personalizată şi medicina predictivă. Profilaxia bolilor capătă, graţie geneticii, o nouă
dimensiune. Adresându-se familiilor sau persoanelor cu risc genetic, profilaxia devine individualizată,
personalizată. Identificarea unor gene ce determină susceptibilitatea unor persoane sănătoase la

20
anumite boli (de ex., la anumite forme de cancer) precum şi studiul unor markeri genetici individuali
asociaţi cu vulnerabilitatea la boală (de ex., la hipertensiune arterială, boală coronariană, ş.a.)
deschid calea unei medicini predictive, bazată pe "previziunile" prenatale sau premorbide. Medicina
predictivă, cu toate dilemele etice pe care le suscită, oferă mari speranţe pentru prevenirea bolilor.

Bolile multifactoriale au o componenta genetica complexa dar pot fi de asemenea influentate de

factori de mediu. Elucidarea fiziopatologiei bolilor pot identifica mecanismul de insertie a unei gene
specifice cu capacitatea de a inversa ori incetini evolutia bolii. In acest caz, este importants influenta
pe care o produce o gena in cardul proceselor fiziologie ale unui tesut sau celula.
In prezent terapia genetica a acestor boli este intr-un stadiu incipient.
When designing an appropriate approach to genetic disease management or gene
therapy, it is important to ascertain the level of interactions between genes because
the majority of diseases causing death in the United States result from processes
influenced by many genes.These diseases are polygenic and/or epigenetic in origin.
Epigenetic phenomena, such as imprinting, reflect the “state” of a gene and are
influenced by environmental factors. Some measure of the magnitude of the gene
expression changes that occur during a diseased state was provided by a recent
comparison of gene expression profiles in normal and cancer cells (see Chapter 10).
Using cellular DNAs (cDNA) as messenger ribonucleic acid (mRNA) surrogate
markers of gene activation, it was found that almost 300 genes were expressed at
significantly different levels in gastrointestinal tumors compared to normal tissue.
The differential activation of such a large number of genes infers that all the genes
will not be regulated through common mechanisms. Similar studies are now proceeding
in the field of obesity research where the genetic basis of this disease is
being elucidated. Thus, it is fundamental to the understanding of disease pathogenesis
to identify all genes involved. Specific targeted interventions can then be
aimed at the most accessible pathogenic targets. Since multiple experimental therapeutic
approaches exist for treating even a “simple” monogenetic disorder, it will
be most important to lay the groundwork for considering the potential numerous
interventions for the multifactorial diseases that cause morbidity and mortality in
the United States.

21
A specific example of the genetic manifestations of molecular medicine can be

seen with the liver disease, a1-antitrypsin deficiency (see Chapter 7). This liver

disease results from a relatively common genetic lesion, in that, about 1 in 8000

infants born in the United States is homozygous for the most frequent mutant allele.

Two entirely different organ-specific pathogenic processes can occur in these

individuals. Liver injury can result from the accumulation of improperly folded a1-

antitrypsin protein in the endoplasmic reticulum of cells. Lung injury in the form of

emphysema can result from the unrelenting proteolytic attack on lung elastin caused

by the absence of a1-antitrypsin. The severity of disease in individuals homozygous

for the mutated gene is highly variable, indicating that the impact of the singlegene

mutation depends on the “genetic background” of the individual.This example

illustrates how the activity of compensatory genes can determine whether a genetic

lesion becomes a genetic disease, suggesting that the up-regulation of compensatory

genes might be an effective strategy for treating patients with certain genetic

mutations.

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.1701484

Transcription errors play an important role in protein stability. In humans,

transcription errors generate toxic versions of the Aβ protein in patients with
nonfamilial Alzheimer’s disease (28, 29) and faulty ubiquitin-B (UBB) proteins in
patients with Down syndrome (28, 29). In addition, transcription errors induce
proteotoxic stress and accelerate cellular aging in yeast
transcription errors can also lead to widespread changes in the metabolism of
eukaryotic cells due to the depletion of vital resources

Amendamente la dogma centrală a biologiei moleculare.

22